Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши

15.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57270

⸱

10 июля 2018 г.

 ,  , 
1Institute of Neuroscience, National Yang-Ming University, 2Brain Research Center, National Yang-Ming University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол стереотаксической хирургии с домашним головы Исправлена устройством для microinjecting реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши. Эта техника позволяет генетические манипуляции в нейрональных клеток конкретных областей мозга новорожденных мыши.

Аннотация

Многие гены выражены в эмбриональных мозги, и некоторые из них постоянно выражаются в мозге после рождения. Для такой настойчиво выраженное генов они могут функционировать для регулирования процесса развития и/или физиологических функций в мозге новорожденных. Расследовать нейробиологических функций конкретных генов в головном мозге, важно для инактивации генов в головном мозге. Здесь мы описания простой стереотаксического метода для инактивации экспрессии генов в стриатума трансгенных мышей на новорожденных времени windows. AAV-eGFP-Cre вирусы были microinjected в Полосатое тело Ai14 репортер генов мышей на послеродовой день (P) 2 по стереотаксической хирургии. Экспрессия генов tdTomato репортер был обнаружен в стриатума P14, предполагая, что успешный Cre-loxP при посредничестве рекомбинации ДНК в клетках AAV-преобразованы полосатой. Мы далее подтвержден этот метод microinjecting AAV-eGFP-Cre вирусов в P2Foxp2fl/fl мышей. Двойной маркировки GFP и Foxp2 показал, что GFP-положительных клеток не хватало Foxp2 иммунореактивности в P9 стриатума, предлагая потери Foxp2 белка в клетках полосатой AAV-eGFP-Cre преобразованы. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют эффективных генетических удаления stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre вирусами в конкретных нейрональных популяций в мозге новорожденных floxed трансгенных мышей. В заключение наша стереотаксического техника обеспечивает легкий и простой платформу для генетических манипуляций в мозге новорожденных мыши. Этот метод может использоваться не только для удаления генов в конкретных регионах неонатальная мозги, но он также может использоваться для вставки фармакологических препаратов, нейронов трассировщиков, генетически модифицированных Оптогенетика и chemogenetics белки, показатели активности нейронов и другие реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши.

Введение

Современные исследования структуры и функции мозга обычно требуют генетические манипуляции специфических генов в нейрональных клеток. Зонда функции различных генов, трансгенных мышей, перевозящих мутантные аллели, включая регулярно созданы Выбивное и забивные аллелей. Стереотаксической хирургии для взрослых грызунов является стандартным методом для локально доставки наркотиков, вирусы, Трейсеры и другие реагенты для конкретных регионов грызунов мозги1,2. Применяя стереотаксической хирургии трансгенных мышей позволяет генетически манипулировать функции гена и активности нейронов в конкретных нейрональных популяций головного мозга мыши. Манипуляция определенного типа клеток обеспечивает мощный подход к расшифровать нейрональных функций в сложных нейронных цепей мозга3,4,5.

Нейронные развития нервной системы начинается на ранних эмбриональных стадиях, и процессов развития продолжать после рождения до периода несовершеннолетних. Послеродовой период созревания нервной системы включает в себя точные синаптической проводки нейронных цепей, которая необходима для физиологических и когнитивных функций мозга6. Таким образом изучение развития события, возникающие в windows неонатальной время важное значение не только для понимания нейронных нормального развития, но она также может обеспечить понимание патогенеза психомоторного развития и нервно-психических расстройств7 ,8. Хотя методы стереотаксической хирургии для взрослых грызунов легко доступны2,9, несколько протоколов доступны в Интернете для стереотаксической хирургии новорожденных мышей10,11. В самом деле стереотаксического микроинъекций реагентов в мозги новорожденных мыши щенков трудны, потому что глава новорожденным щенком слишком хрупкой, чтобы быть исправлена в стандартной стереотаксического аппарата. Тем не менее применение стереотаксической хирургии трансгенных мышей возможно для новорожденных мышей12. Здесь мы опишем простой метод с домашним установки для выполнения стереотаксической хирургии в мыши новорожденных щенков. Мы показываем, что этот метод позволяет условно удалять floxed гены, microinjecting рекомбиназа AAV-выражая Cre ДНК в стриатума репортер генов мышей и условно floxed трансгенных мышей. Этот метод применяется также для доставки реагентов в неонатальной стриатума мышей дикого типа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животных протоколы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование комитетов национального Yang Ming-университета.

1. Подготовка держателя для новорожденных щенков в стереотаксического аппарата

  1. Сделать головы лоток: нарезать форму, которая подходит глава новорожденных щенков, удалив 1/5 по стенкам трубы в нижней части пластиковых пробирок 1.5 мл (15 мм).
  2. Возьмите коробку наконечник пипетки с правильный размер, который подходит с пьедесталом стереотаксического аппарата и снимите верхнюю крышку. Аффикс головы лоток, подготовленные на этапе 1.1 и ткани внедрения кассеты на базе наконечник лотка с горячей плавления клей. Высота внедрения кассеты ткани — 7 мм, которая используется для поддержки шеи и тела щенка в положении головы исправлена.
  3. Место всей установки в стандартный стереотаксического аппарата.

2. Подготовка 30G инъекций иглы из нержавеющей стали

  1. Предварительно чистые иглы шприца 30 G путем замачивания их в хлороформе на 3 дня.
  2. Используйте корнцанг тщательно и медленно вытащить иглу из его полипропиленовые хаб в химические вытяжки.
  3. Вымойте иглы с абсолютного этанола для 20 мин, затем 70% этанол полоскания для 3 × 10 мин на шейкер на 50 об/мин. Пусть воздух иглы сухой и хранить очищенную иглы в чистое поле при комнатной температуре (RT) до использования.

3. Подготовьте адаптер для микроинъекции труб

  1. Подключите микролитр шприц для инъекционной иглой 30G с PE10 полиэтиленовые трубки (PE10 трубки). Подготовьте PE20 полиэтиленовых труб (труба PE20) адаптер для преодоление инъекционной иглы и шприца микролитр. Использование адаптера необходимо, потому что диаметр PE10 трубы гораздо меньше, чем в иглу шприца микролитр 26G.
  2. Подготовка трубки для шприца микролитр: Подключите предварительно очищенных инъекционной иглой 30 G с 5 см PE20 трубки и уплотнение junction с мгновенными клей. Этот адаптер трубки многоразового использования.
    Примечание: Если игла шприца микроинъекции 30G, подготовка (шаг 3.1) и использования (шаг 3.3) Этот адаптер не является необходимым.
  3. Подключите адаптер трубки (подготовленных на шаге 3.1) с помощью шприца микролитр (10 мкл).
  4. Подключите один конец трубки PE10 (не более 60 см) на иглой 30G адаптер трубки PE20. Смонтируйте новый инъекционной иглой 30G на другой конец трубки PE10.

4. Загрузите микроинъекции трубу с газобетона дистиллированной воды, краситель и вирусы

  1. Выньте поршень шприца микролитр. Используйте 25G шприц для загрузки микролитр шприц и его связанных PE трубки газобетона дистиллированной водой для удаления воздуха из шланга.
  2. Место поршень обратно в микролитр шприц и толкать поршень до 2 мкл останков дистиллированной воды в бочке. Не позволяйте объем дистиллированной воды, становится меньше, чем 2 мкл.
  3. Смонтируйте тщательно микролитр шприца микро потока скорость шприцевой насос.
  4. Пипетка небольших количествах 0,1% быстро зеленый краситель (подготовлен в 0,9% физиологического раствора и отфильтрованы с 0,22 мкм фильтром) и вирус жидкостей на кусок парафина.
  5. Вывести небольшое количество воздуха, чтобы сделать видимым воздушный пузырь на стыке между инъекционной иглой 30G и PE10 трубки, после загрузки 0,7 мкл отфильтрованных быстро зеленый в трубку для тестирования потока жидкости в трубке микроинъекции.
  6. Снять еще небольшое количество воздуха, чтобы сделать второй воздушный пузырь, следуют загрузки вирус жидкости в трубке микроинъекции.
  7. Установите и закрепите микроинъекции иглой 30G в руку стереотаксического аппарата.

5. анестезия при гипотермии новорожденных мышей

  1. Поместите щенка в рукава латексные перчатки и погрузить его в колотым льдом до шеи за 5 мин.
  2. Щепотка щенка ноги с щипцами, чтобы убедиться, что ответа вывод своих ног.
  3. Поместите щенка с латексной перчатке рукава в головы лоток и положить некоторые дробленый лед вокруг латекса втулку, чтобы держать его холодной для анестезии гипотермии.
  4. Примените мазь ветеринар на глаза щенка чтобы предотвратить сухость во время под наркозом, если это возможно.

6. микроинъекции

  1. Подготовьте стерильные хирургии, вытирая стереотаксического инструмента тщательно с 70% этиловом спирте. Стерилизации хирургических инструментов, погружая их в 70% этиловом спирте.
  2. Вымыть голову щенка с 70% этиловом спирте. Найдите лямбда ориентир на черепе и Марк лямбда-выражения с маркером. Цель кончик иглы для лямбда-выражения и установите передний задний (AP) и медиальной боковой (мл) координаты как ноль.
  3. Перемещение руки инъекции на целевой сайт по X и Y координат целевого сайта. Для стриатума послеродовой день (P) 2 щенят, координаты являются: AP, 2,4 мм впереди лямбда-выражения; МЛ, ±1, 0 мм бокового от средней линии; спинной вентральный (DV), −1.7 мм от черепа. Отметьте положение быстро зеленый краситель в PE10 трубу с ручкой.
  4. Сбить инъекционной иглой 30G медленно проникать через кожу и черепа, а затем принести вверх кончик иглы, до тех пор, пока он останавливается на поверхности черепа. Задайте координаты DV как ноль.
  5. Сбить инъекционной иглой 30G медленно, пока достигнет DV координат целевого сайта. Подождите 1 мин позволить возобновить свою нормальную форму паренхимы. Запустите программу микроинъекции (100 nL/мин).
  6. Убедитесь, что Марк быстро зеленый краситель движется в PE трубки, чтобы убедиться, что вирус Жидкость впрыскивается в мозг.
  7. Подождите 1 мин после прекращения микроинъекции, а затем медленно и постепенно воспитывать иглу в 1/2 высоты DV глубины в течение 30 s. После 30 сек, медленно снять иглу из головы щенка.
  8. Повторите шаг 6.2 до 6,7 до завершения микроинъекций всех целевых сайтов.

7. послеоперационные восстановления щенка

  1. Теплый вверх щенка на 20 мин в инкубаторе 33 ° C. Проверка восстановления щенка от гипотермии анестезии каждые 5 мин до тех пор, пока щенок сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
  2. Возвращение щенка плотины после того, как щенок полностью выздоровел.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для первого набора эксперимента, мы microinjected 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 вирусов (ААВ eGFP-Cre, 1/10 разрежения в Дульбекко фосфатный буфер) которые выражают рекомбиназа Cre ДНК сливается с GFP в P2 стриатума Ai14 мышей. Ai14 мышей Экспресс tdTomato Репортер ген после удаления Cre опосредованной бокам loxP (floxed) остановки кассеты (Рисунок 2F). Мозги были собраны на P14 за иммуноокрашивания GFP и tdTomato. Многие AAV преобразованы GFP-п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы демонстрируем простой и надежный стереотаксического метода для инъекций AAV вирусов в стриатума мозги новорожденных мыши. Мы microinjected AAV-eGFP-Cre вирусов в Полосатое тело Ai14 репортер мышей на P2 и затем проанализировать выражение гена репортера на P14. Мы нашли, что AAV преобразованы GFP-положительных клеток на протяжении стриатума на rostrocaudal уровне. Кроме того почти все GFP-положительных клеток совместно выразили tdTomato Репортер ген в полосатой клеток, предложив успешным рекомб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Министерством науки и технологии предоставляет MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения грант НПУ-EX106-10429NI и Рекомендуемые области исследований центра программы грантов от Министерство образования через мозг научно-исследовательский центр, Национальный университет Yang Ming в Тайване, и докторантура стипендий предоставляет MOST106-2811-B-010-031 (S.-клуба), MOST105-2811-B-010-036 и MOST106-2811-B-010-030 (H.-ю.к.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
30G Игла PrecisionGlideBecton DickinsonREF 305106
хлороформJT Baker9180-03
Hamilton MICROLITER ШприцHamilton Игла 8030030G подходит для трубки PE10; для иглы 26G требуется адаптер PE20
Полиэтиленовая трубка PE20Becton Dickinson427406
Полиэтиленовая трубка PE10Becton Dickinson427401
Шприцевой насос с микроскоростью потокаLong Precision Pump Co.TJ-2A (Контроллер) и L0107-2A (Приводной блок)
Шприц 25GBecton DickinsonREF 302105
Fast greenSigma-AldrichF-72520,1%
Стандартные стереотаксические инструментыRWD Life Science68037Без использования 68030 Адаптер мыши/новорожденной крысы
Anti-FOXP2 антителоAbcamab16046Кролик поликлональный к FOXP2, 1:4,000
Антитело против RFPAbcamab65856Мышь моноклональная к RFP, 1:1,000
BX63 микроскопOlympusBX63
LSM 880 конфокальный микроскопZeissLSM 880
Козий антикролик конъюгированный Alexa fluor594Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40Penn Vector CoreAV-9-PV1848Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.куриный актин-eGFPAAV Core, Институт биомедицинских наук, Академия Синика, Тайваньн/д1x1014 (GC/ml)
B6. Cg-gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JЛабторарий Джексона 007914Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJЛаборатория Джексона 026259Foxp2fl/fl
Dulbecco' s фосфатный буферный солевой растворCorning  cellgro21-030-CVR

Ссылки

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

AAV eGFP CreCre loxP
Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.