Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши

Современные исследования структуры и функции мозга обычно требуют генетические манипуляции специфических генов в нейрональных клеток. Зонда функции различных генов, трансгенных мышей, перевозящих мутантные аллели, включая регулярно созданы Выбивное и забивные аллелей. Стереотаксической хирургии для взрослых грызунов является стандартным методом для локально доставки наркотиков, вирусы, Трейсеры и другие реагенты для конкретных регионов грызунов мозги^1,2. Применяя стереотаксической хирургии трансгенных мышей позволяет генетически манипулировать функции гена и активности нейронов в конкретных нейрональных популяций головного мозга мыши. Манипуляция определенного типа клеток обеспечивает мощный подход к расшифровать нейрональных функций в сложных нейронных цепей мозга^3,4,5.

Нейронные развития нервной системы начинается на ранних эмбриональных стадиях, и процессов развития продолжать после рождения до периода несовершеннолетних. Послеродовой период созревания нервной системы включает в себя точные синаптической проводки нейронных цепей, которая необходима для физиологических и когнитивных функций мозга⁶. Таким образом изучение развития события, возникающие в windows неонатальной время важное значение не только для понимания нейронных нормального развития, но она также может обеспечить понимание патогенеза психомоторного развития и нервно-психических расстройств^{7 ,8}. Хотя методы стереотаксической хирургии для взрослых грызунов легко доступны^2,9, несколько протоколов доступны в Интернете для стереотаксической хирургии новорожденных мышей^10,11. В самом деле стереотаксического микроинъекций реагентов в мозги новорожденных мыши щенков трудны, потому что глава новорожденным щенком слишком хрупкой, чтобы быть исправлена в стандартной стереотаксического аппарата. Тем не менее применение стереотаксической хирургии трансгенных мышей возможно для новорожденных мышей¹². Здесь мы опишем простой метод с домашним установки для выполнения стереотаксической хирургии в мыши новорожденных щенков. Мы показываем, что этот метод позволяет условно удалять floxed гены, microinjecting рекомбиназа AAV-выражая Cre ДНК в стриатума репортер генов мышей и условно floxed трансгенных мышей. Этот метод применяется также для доставки реагентов в неонатальной стриатума мышей дикого типа.

Животных протоколы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование комитетов национального Yang Ming-университета.

1. Подготовка держателя для новорожденных щенков в стереотаксического аппарата

1. Сделать головы лоток: нарезать форму, которая подходит глава новорожденных щенков, удалив 1/5 по стенкам трубы в нижней части пластиковых пробирок 1.5 мл (15 мм).
2. Возьмите коробку наконечник пипетки с правильный размер, который подходит с пьедесталом стереотаксического аппарата и снимите верхнюю крышку. Аффикс головы лоток, подготовленные на этапе 1.1 и ткани внедрения кассеты на базе наконечник лотка с горячей плавления клей. Высота внедрения кассеты ткани — 7 мм, которая используется для поддержки шеи и тела щенка в положении головы исправлена.
3. Место всей установки в стандартный стереотаксического аппарата.

2. Подготовка 30G инъекций иглы из нержавеющей стали

1. Предварительно чистые иглы шприца 30 G путем замачивания их в хлороформе на 3 дня.
2. Используйте корнцанг тщательно и медленно вытащить иглу из его полипропиленовые хаб в химические вытяжки.
3. Вымойте иглы с абсолютного этанола для 20 мин, затем 70% этанол полоскания для 3 × 10 мин на шейкер на 50 об/мин. Пусть воздух иглы сухой и хранить очищенную иглы в чистое поле при комнатной температуре (RT) до использования.

3. Подготовьте адаптер для микроинъекции труб

1. Подключите микролитр шприц для инъекционной иглой 30G с PE10 полиэтиленовые трубки (PE10 трубки). Подготовьте PE20 полиэтиленовых труб (труба PE20) адаптер для преодоление инъекционной иглы и шприца микролитр. Использование адаптера необходимо, потому что диаметр PE10 трубы гораздо меньше, чем в иглу шприца микролитр 26G.
2. Подготовка трубки для шприца микролитр: Подключите предварительно очищенных инъекционной иглой 30 G с 5 см PE20 трубки и уплотнение junction с мгновенными клей. Этот адаптер трубки многоразового использования.
   Примечание: Если игла шприца микроинъекции 30G, подготовка (шаг 3.1) и использования (шаг 3.3) Этот адаптер не является необходимым.
3. Подключите адаптер трубки (подготовленных на шаге 3.1) с помощью шприца микролитр (10 мкл).
4. Подключите один конец трубки PE10 (не более 60 см) на иглой 30G адаптер трубки PE20. Смонтируйте новый инъекционной иглой 30G на другой конец трубки PE10.

4. Загрузите микроинъекции трубу с газобетона дистиллированной воды, краситель и вирусы

1. Выньте поршень шприца микролитр. Используйте 25G шприц для загрузки микролитр шприц и его связанных PE трубки газобетона дистиллированной водой для удаления воздуха из шланга.
2. Место поршень обратно в микролитр шприц и толкать поршень до 2 мкл останков дистиллированной воды в бочке. Не позволяйте объем дистиллированной воды, становится меньше, чем 2 мкл.
3. Смонтируйте тщательно микролитр шприца микро потока скорость шприцевой насос.
4. Пипетка небольших количествах 0,1% быстро зеленый краситель (подготовлен в 0,9% физиологического раствора и отфильтрованы с 0,22 мкм фильтром) и вирус жидкостей на кусок парафина.
5. Вывести небольшое количество воздуха, чтобы сделать видимым воздушный пузырь на стыке между инъекционной иглой 30G и PE10 трубки, после загрузки 0,7 мкл отфильтрованных быстро зеленый в трубку для тестирования потока жидкости в трубке микроинъекции.
6. Снять еще небольшое количество воздуха, чтобы сделать второй воздушный пузырь, следуют загрузки вирус жидкости в трубке микроинъекции.
7. Установите и закрепите микроинъекции иглой 30G в руку стереотаксического аппарата.

5. анестезия при гипотермии новорожденных мышей

1. Поместите щенка в рукава латексные перчатки и погрузить его в колотым льдом до шеи за 5 мин.
2. Щепотка щенка ноги с щипцами, чтобы убедиться, что ответа вывод своих ног.
3. Поместите щенка с латексной перчатке рукава в головы лоток и положить некоторые дробленый лед вокруг латекса втулку, чтобы держать его холодной для анестезии гипотермии.
4. Примените мазь ветеринар на глаза щенка чтобы предотвратить сухость во время под наркозом, если это возможно.

6. микроинъекции

1. Подготовьте стерильные хирургии, вытирая стереотаксического инструмента тщательно с 70% этиловом спирте. Стерилизации хирургических инструментов, погружая их в 70% этиловом спирте.
2. Вымыть голову щенка с 70% этиловом спирте. Найдите лямбда ориентир на черепе и Марк лямбда-выражения с маркером. Цель кончик иглы для лямбда-выражения и установите передний задний (AP) и медиальной боковой (мл) координаты как ноль.
3. Перемещение руки инъекции на целевой сайт по X и Y координат целевого сайта. Для стриатума послеродовой день (P) 2 щенят, координаты являются: AP, 2,4 мм впереди лямбда-выражения; МЛ, ±1, 0 мм бокового от средней линии; спинной вентральный (DV), −1.7 мм от черепа. Отметьте положение быстро зеленый краситель в PE10 трубу с ручкой.
4. Сбить инъекционной иглой 30G медленно проникать через кожу и черепа, а затем принести вверх кончик иглы, до тех пор, пока он останавливается на поверхности черепа. Задайте координаты DV как ноль.
5. Сбить инъекционной иглой 30G медленно, пока достигнет DV координат целевого сайта. Подождите 1 мин позволить возобновить свою нормальную форму паренхимы. Запустите программу микроинъекции (100 nL/мин).
6. Убедитесь, что Марк быстро зеленый краситель движется в PE трубки, чтобы убедиться, что вирус Жидкость впрыскивается в мозг.
7. Подождите 1 мин после прекращения микроинъекции, а затем медленно и постепенно воспитывать иглу в 1/2 высоты DV глубины в течение 30 s. После 30 сек, медленно снять иглу из головы щенка.
8. Повторите шаг 6.2 до 6,7 до завершения микроинъекций всех целевых сайтов.

7. послеоперационные восстановления щенка

1. Теплый вверх щенка на 20 мин в инкубаторе 33 ° C. Проверка восстановления щенка от гипотермии анестезии каждые 5 мин до тех пор, пока щенок сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
2. Возвращение щенка плотины после того, как щенок полностью выздоровел.

Для первого набора эксперимента, мы microinjected 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 вирусов (ААВ eGFP-Cre, 1/10 разрежения в Дульбекко фосфатный буфер) которые выражают рекомбиназа Cre ДНК сливается с GFP в P2 стриатума Ai14 мышей. Ai14 мышей Экспресс tdTomato Репортер ген после удаления Cre опосредованной бокам loxP (floxed) остановки кассеты (Рисунок 2F). Мозги были собраны на P14 за иммуноокрашивания GFP и tdTomato. Многие AAV преобразованы GFP-положительных клеток были подарок на протяжении стриатума (рисунок 2A, C), указывающее обширные инфекции полосатой клеток вирусами AAV-eGFP-Cre. Подобные обширные выражение tdTomato был также найден в стриатума (Рисунок 2Б, C). При микроскопическом исследовании в большом увеличении, мы обнаружили, что почти все GFP-положительных клеток полосатой совместно выразили tdTomato Репортер ген (рисунок 2A'-C'). Кроме того tdTomato сигналы были обнаружены предположительно аксона терминалах в Глобус бледного (Рисунок 2D) и сетчатая Парс substantia nigra (Рисунок 2E), целевых регионах стрионигральная и striatopallidal проекции нейронов 13. Эти результаты свидетельствуют успешный Cre-loxP при посредничестве рекомбинации ДНК, вызванных AAV-опосредованной выражение Cre активности в неонатальной полосатой нейронов.

Для второго набора эксперимента, мы microinjected 50 nL AAV-eGFP-Cre вирусов в стриатума Foxp2fl/fl мышей, перевозящих loxP бокам Foxp2 аллелей в P2 (рис. 3A- C, F) и собирают мозга в P9. Не Foxp2+; Клетки двойной меченых GFP+ были найдены в Полосатое тело, т.е., отсутствовал Foxp2 белка GFP-положительных клеток (Рисунок 3А'-C'). В экспериментах управления Foxp2+; Клетки двойной меченых GFP+ присутствовали в стриатума Foxp2fl/fl мышей с AAV-eGFP управления вирусов (рис. 3D) и Полосатое тело от гетерозиготных Foxp2fl / + мышей с AAV-eGFP-Cre вирусы (Рисунок 3E). Эти результаты показывают, что Foxp2 гена в AAV-eGFP-Cre преобразованы клеток новорожденных стриатума специально удаляется.

В совокупности результаты AAV-eGFP-Cre; Ai14 и AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl мышей, методика стереотаксической неонатальной хирургии, который мы разработали поддается условно удалять генов в конкретных регионах мозга новорожденных мыши.

Рисунок 1. Стереотаксического аппарата и домашние головы фиксированный держатель для новорожденных мышей. (A) стереотаксического инъекции система состоит из следующих устройств: i. шприцевый насос (контроллер); II. шприцевый насос (привода); III. микролитр шприц (10 мкл); IV. PE20 адаптер трубки; v. PE10 труба; VI. 30G инъекционной иглы; VII. стереотаксического аппарата; VIII. Пипетка советы коробка преобразован платформы для новорожденных щенков; XI: дробленый лед. (B) высота ткани внедрения кассеты составляет около 7 мм. Кнопка 1,5 мл пластиковых пробирок находится около 15 мм длиной. (C) мыши голова крепится в домашней держатель для головы исправлена. Стрелка показывает лямбда ориентир в голове новорожденных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Выражение tdTomato в стриатума P14 Ai14 мышей после AAV-eGFP-Cre опосредованной рекомбинации ДНК Cre-loxP. AAV-eGFP-Cre вирусы были sterotaxically вводят в P2 стриатума Ai14 мышей. Мозг был проанализирован на P14. (A) многие GFP-положительных клеток присутствуют во всем стриатума (Str). (B) многие tdTomato положительных клеток, также присутствуют в стриатума. (C) объединенного изображения показывают обширные Сопредседатель локализации GFP и tdTomato в стриатума. Конфокальный изображения в штучной упаковке регионов в A-C отображаются с высоким увеличением в A'-C', соответственно. Все GFP-положительных клеток (зеленый) совместно Экспресс tdTomato (красный) в стриатума. (D, E) TdTomato сигналы обнаруживаются в целевых регионах полосатой проекции нейронов, включая Глобус бледного (GP; D) и substantia nigra Парс reticulata (SNr; E). (F) схематические чертежи AAV-eGFP КРР и Ai14 трансгенных конструкций. CTX: коры; Сентябрь: перегородки; HIPP: Гиппокампа; МБ: мозга. Линейки в A (для A-C), 200 мкм; A' (для A'-C'), 10 мкм; D (D и E), 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

На рисунке 3. Условного удаления Foxp2 гена в неонатальной стриатума, intrastriatal injecions вирусов AAV-eGFP-Cre. Intrastriatal инъекции AAV-eGFP-Cre вирусов были исполнены в P2 Foxp2fl/fl (A-C') и Foxp2fl / +(E) мышах. Мозги были проанализированы в P9. (A-C) GFP-положительных клеток (A, C, зеленый) отсутствие иммунореактивности Foxp2 (B, C, красный) в стриатума Foxp2fl/fl мышей с AAV-eGFP-Cre вирусов. Штучной упаковке регионов в A-C показываются на большом увеличении в A'-C', соответственно. (D) полосатой клетки совместно Экспресс GFP и Foxp2 присутствуют в Полосатое тело, который был впрыснут AAV-eGFP управления вирусами. (E) GFP-положительных клеток совместно Экспресс Foxp2 (стрелок) присутствуют в Полосатое тело из Foxp2fl / + мышей с AAV-eGFP-Cre вирусов. (F) схематические чертежи AAV-eGFP-Cre вирус и Foxp2fl/fl трансгенных мышей. Линейки в A (для A-C), 200 мкм; A' (для A'-C', D и E), 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.