Мы описываем протокол стереотаксической хирургии с домашним головы Исправлена устройством для microinjecting реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши. Эта техника позволяет генетические манипуляции в нейрональных клеток конкретных областей мозга новорожденных мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Многие гены выражены в эмбриональных мозги, и некоторые из них постоянно выражаются в мозге после рождения. Для такой настойчиво выраженное генов они могут функционировать для регулирования процесса развития и/или физиологических функций в мозге новорожденных. Расследовать нейробиологических функций конкретных генов в головном мозге, важно для инактивации генов в головном мозге. Здесь мы описания простой стереотаксического метода для инактивации экспрессии генов в стриатума трансгенных мышей на новорожденных времени windows. AAV-eGFP-Cre вирусы были microinjected в Полосатое тело Ai14 репортер генов мышей на послеродовой день (P) 2 по стереотаксической хирургии. Экспрессия генов tdTomato репортер был обнаружен в стриатума P14, предполагая, что успешный Cre-loxP при посредничестве рекомбинации ДНК в клетках AAV-преобразованы полосатой. Мы далее подтвержден этот метод microinjecting AAV-eGFP-Cre вирусов в P2Foxp2fl/fl мышей. Двойной маркировки GFP и Foxp2 показал, что GFP-положительных клеток не хватало Foxp2 иммунореактивности в P9 стриатума, предлагая потери Foxp2 белка в клетках полосатой AAV-eGFP-Cre преобразованы. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют эффективных генетических удаления stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre вирусами в конкретных нейрональных популяций в мозге новорожденных floxed трансгенных мышей. В заключение наша стереотаксического техника обеспечивает легкий и простой платформу для генетических манипуляций в мозге новорожденных мыши. Этот метод может использоваться не только для удаления генов в конкретных регионах неонатальная мозги, но он также может использоваться для вставки фармакологических препаратов, нейронов трассировщиков, генетически модифицированных Оптогенетика и chemogenetics белки, показатели активности нейронов и другие реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши.
Введение
Современные исследования структуры и функции мозга обычно требуют генетические манипуляции специфических генов в нейрональных клеток. Зонда функции различных генов, трансгенных мышей, перевозящих мутантные аллели, включая регулярно созданы Выбивное и забивные аллелей. Стереотаксической хирургии для взрослых грызунов является стандартным методом для локально доставки наркотиков, вирусы, Трейсеры и другие реагенты для конкретных регионов грызунов мозги1,2. Применяя стереотаксической хирургии трансгенных мышей позволяет генетически манипулировать функции гена и активности нейронов в конкретных нейрональных популя....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Животных протоколы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование комитетов национального Yang Ming-университета.
1. Подготовка держателя для новорожденных щенков в стереотаксического аппарата
- Сделать головы лоток: нарезать форму, которая подходит глава новорожденных щенков, удалив 1/5 по стенкам трубы в нижней части пластиковых пробирок 1.5 мл (15 мм).
- Возьмите коробку наконечник пипетки с правильный размер, который подходит с пьедесталом стереотаксического аппарата и снимите верхнюю крышку. Аффикс головы лоток, подготовленные на этапе 1.1 и ткани внедрения кассеты на базе наконечник лотка с горячей плавле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для первого набора эксперимента, мы microinjected 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 вирусов (ААВ eGFP-Cre, 1/10 разрежения в Дульбекко фосфатный буфер) которые выражают рекомбиназа Cre ДНК сливается с GFP в P2 стриатума Ai14 мышей. Ai14 мышей Экспресс tdTomato Репортер ген после удаления Cre опосредованной бокам loxP (floxed) остановки кассеты (Рисунок 2F). Мозги были собраны на P14 за иммуноокрашивания GFP и tdTomato. Многие AAV преобразованы GFP-п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В настоящем исследовании мы демонстрируем простой и надежный стереотаксического метода для инъекций AAV вирусов в стриатума мозги новорожденных мыши. Мы microinjected AAV-eGFP-Cre вирусов в Полосатое тело Ai14 репортер мышей на P2 и затем проанализировать выражение гена репортера на P14. Мы нашли, что AAV преобразованы GFP-положительных клеток на протяжении стриатума на rostrocaudal уровне. Кроме того почти все GFP-положительных клеток совместно выразили tdTomato Репортер ген в полосатой клеток, предложив успешным рекомб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Министерством науки и технологии предоставляет MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения грант НПУ-EX106-10429NI и Рекомендуемые области исследований центра программы грантов от Министерство образования через мозг научно-исследовательский центр, Национальный университет Yang Ming в Тайване, и докторантура стипендий предоставляет MOST106-2811-B-010-031 (S.-клуба), MOST105-2811-B-010-036 и MOST106-2811-B-010-030 (H.-ю.к.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 30G Игла PrecisionGlide | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| хлороформ | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Шприц | Hamilton | Игла 80300 | 30G подходит для трубки PE10; для иглы 26G требуется адаптер PE20 |
| Полиэтиленовая трубка PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Полиэтиленовая трубка PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Шприцевой насос с микроскоростью потока | Long Precision Pump Co. | TJ-2A (Контроллер) и L0107-2A (Приводной блок) | |
| Шприц 25G | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0,1% |
| Стандартные стереотаксические инструменты | RWD Life Science | 68037 | Без использования 68030 Адаптер мыши/новорожденной крысы |
| Anti-FOXP2 антитело | Abcam | ab16046 | Кролик поликлональный к FOXP2, 1:4,000 |
| Антитело против RFP | Abcam | ab65856 | Мышь моноклональная к RFP, 1:1,000 |
| BX63 микроскоп | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 конфокальный микроскоп | Zeiss | LSM 880 | |
| Козий антикролик конъюгированный Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.куриный актин-eGFP | AAV Core, Институт биомедицинских наук, Академия Синика, Тайвань | н/д | 1x1014 (GC/ml) |
| B6. Cg-gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Лабторарий Джексона | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | Лаборатория Джексона | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco' s фосфатный буферный солевой раствор | Corning cellgro | 21-030-CVR |
Ссылки
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
