Стратегий выборки и обработки образцов ткани биобанка из свинины биомедицинской модели

Краткое содержание

Демонстрируются практического применения и производительности методов для генерации образцы представительной ткани свинину животных моделей для широкого спектра течению анализов в биобанке проектов, включая volumetry, систематического случайной выборки, и дифференциальный обработка образцов ткани для качественных и количественных анализов молекулярных и морфологических типов.

Аннотация

В трансляционного медицинских исследований свинину модели постепенно становятся более популярными. Учитывая высокую ценность отдельных животных, особенно генетически модифицированных свиней, модели и часто ограниченное количество доступных животных этих моделей, создание коллекций (биобанке) образцов должным образом обработанной ткани подходит для широкий спектр последующий анализ методов, включая анализ, не указанный на этапе отбора проб, представляют собой значимые подходы в полной мере воспользоваться трансляционная значения модели. Отношении особенности свинину анатомии недавно были установлены всеобъемлющие руководящие принципы для стандартизированных поколения представителя, высокое качество образцов из разных свинину органов и тканей. Эти руководящие принципы являются необходимыми условиями для воспроизводимости результатов и их сопоставимости между различными исследованиями и следователей. Запись основных данных, таких как орган весов и томов, определение мест отбора проб и количество образцов ткани будет создан, а также их ориентацию, размер, обработки и направления обрезки, являются соответствующие факторы определение обобщения и удобство образца для молекулярной, качественные и количественные морфологического анализа. Здесь наглядные, практические, шаг за шагом демонстрация самых важных методов для поколения представителя, представлен многоцелевой биобанке образца от свиного тканей. Описанные здесь методы включают в себя определение органа/ткани томов и плотности, применение процедуры средневзвешенная по объему систематического выборочного Паренхиматозный органов путем подсчета точки, определение степени усадки ткани связанные с гистологическим внедрение образцов, и поколения произвольно ориентированный образцов для количественных стереологических анализов, например изотропной единообразных случайных (IUR) секции, создаваемые методы «Ориентатор» и «Isector» и вертикальная форма случайные (VUR) секций.

Введение

В трансляционной медицины, свиньи чаще для использования крупных животных моделей^1,2,3,4,5, благодаря несколько выгодных сходство между свинину и человеческой анатомии и физиологии и наличие установленных молекулярно-биологических методов, позволяя для поколения с учетом, генетически модифицированных свиней модели для широкого спектра болезней условия^1,4.

Однако по сравнению с моделями грызунов, количество животных соответствующих свинья модель, которая может быть предоставлена для экспериментов в любое время ограничено. Это обусловлено свинину поколения интервал примерно один год, и финансовых и время интенсивных усилиях, необходимых для генерации свинину моделей и животноводства. Таким образом отдельные животные модель свинину, а также образцы, которые могут быть сгенерированы из этих свиней, являются очень ценным, особенно если генетически модифицированных свиней модели и/или долгосрочных экспериментальных вопросов (например, поздних осложнений хронические заболевания) рассматриваются в возрасте лица^2,6,7.

В ходе любого исследования, проведения дополнительных анализов, которые не были запланированы в первоначальный экспериментальный дизайн исследования позднее может оказаться актуальными, например, адрес, различные вопросы, возникающие в связи с ранее обнаружил неожиданные результаты. Если подходящие образцы для таких дополнительных экспериментов не доступны, непропорционально высокой стоимости и расходов много времени может потребоваться для создания дополнительных свиней и образцы тканей. Быть готовы к таким событиям, генерации биобанке коллекции сохраняется резервные образцов различных органов, тканей или био жидкости, количественно и качественно подходит для широкого круга последующих анализов, считается важным подход^2,6,7. Получения оптимальных выгод от свиней животные модели, наличие адекватных биобанке образцов также предлагает уникальную возможность выполнить широкий спектр методов анализа различных на идентичных образцов материалов на уровне нескольких орган в тот же отдельных животных, например, путем распространения образцов для ученых различных рабочих групп, организованных в исследовательской сети^2,6,7. Кроме того '' перспективных '' выборки стратегия в biobanking также способствует уменьшению числа животных, нуждается в исследовании. Преимущества свинину модель biobanking недавно были продемонстрированы в нескольких орган, multiomics исследование, изучение орган кросс talk в генетически модифицированных свинину модели долгосрочного сахарный диабет, с использованием образцов из Мюнхена MIDY свинья биобанке ².

Есть некоторые обязательные требования, которые биобанке образцы обычно должны соответствовать для установления надежности и интерпретируемость результаты впоследствии проведенных анализов. Образцы должны быть сгенерированы можно воспроизвести, и они должны быть представитель, т.е., адекватно отражающий заинтересованных молекулярных и морфологических особенностей ткани/органа образцы были взяты из⁷. Чтобы быть пригодным для широкого круга вниз по течению анализ типов, образцы должны в достаточных количествах и обработаны согласно требованиям (включая время и температурных условий) различных аналитических методов, включая описательный гистопатологические анализов, например cryohistology, парафин и пластиковые гистологии, иммуногистохимия, в situ гибридизация, микроскопические анализы ультраструктурных электрона и клинических лабораторных диагностических анализов, а также как молекулярные анализ ДНК, РНК, белков и метаболитов.

Чтобы для оценки широкого круга различных количественных морфологических параметров, таких как числа, томов, длины или площади поверхности различных тканевых структур путем количественного анализа стереологических, рандомизированных раздел самолетов Гистологические образцы соответствующих органов/тканей должны быть подготовлены^7,8,9,10,11. В количественных морфологических исследований, точное определение общего объема ткани, органа или органа отсека, образцы были взяты из (т.е., ссылка пространства) является критически важным^{7,9 , 12} для вычисления абсолютного количества заинтересованных параметров в пределах соответствующего органа, ткани или организма. В конце концов эффект встраивания связанных ткани усадки при подготовке Гистологические срезы должен быть определены и приняты во внимание¹³. Таким образом количественные стереологических анализ, особенно архивных образцов (фиксированная образцов тканей, блоков встроенного ткани, Гистологические срезы и т.д.) от предыдущих исследований, иногда серьезно ограничены или даже невозможным¹², особенно если volumetry соответствующих органов/тканей не выполняется, если не адекватные выборки были применены для репрезентативных выборок, если цифры и количества доступных отдельных примеров являются недостаточными или если обработка образцы несовместима с оценки количественных морфологических параметров, представляющих интерес. Из-за многочисленных возможных факторов пригодность архива образцы материалов для анализа различных количественных морфологических параметров нельзя однозначно ответить, но зависит от тщательной оценки каждого отдельного случая.

Таким образом как расположение, размер, номер, обработки, обрезки направления и ориентации образцов потенциально повлияет на результаты последующего анализа, эти факторы имеют большое значение и должны рассматриваться в экспериментальный дизайн любого исследования. Эти аспекты и особенности анатомии свинину, всеобъемлющий, подробный, крупномасштабные выборки руководящие принципы были созданы недавно адаптированы к свинине Животные модели, предоставляя надежные ссылки на стандартизированных, воспроизводимые и эффективное создание избыточных, адекватно обработанные, высокое качество образцов из более чем 50 различных свинину органов и тканей^6,7.

Методологические описания и видео учебник, показано в настоящей статье предоставляют подробные, иллюстративный, понятной, шаг за шагом инструкции для практического выполнения различных методов для volumetry, отбор проб свинину тканей и органы и обработка образцов ткани для различных течению анализа методов. Рекомендуемые методы включают в себя методы определения объемов ткани органов и плотности, основанные на принципах Архимеда и Кавальери⁹, включая определение размеров трехмерной усадка ткани, связанные с Встраивание в разных внедрения мультимедиа¹⁴ во время обработки для гистологического исследования, применение практически систематического случайной выборки, средневзвешенная по объему подходов, обработка образцов пробы ткани для различных последующих анализ^7,8,9,15и поколение надлежащим образом и обработанных образцов для потенциальных количественных анализов стереологических^{7,8, 9,10,11}. Рядом с их применения в проектах свинину биобанке продемонстрировали методы обычно подходят для всех исследований, изучения количественных гисто Морфологические свойства органов/тканей. Кроме того систематическое случайных выборок особенно полезно для создания репрезентативных выборок в эксперименте с использованием методов молекулярного анализа для обнаружения изменения в изобилии, например, РНК, белки или метаболитов в различные органы и ткани.

В следующий пунктах приводится краткое введение в эти методы, в то время как их практической эффективности описан в разделе протокол.

Определение объемов органа/ткани
Определение весов орган и тома имеет важное значение в нескольких экспериментальных установках, как эти факторы могут указывать на изменения, потенциально связанных с экспериментально изучались факторы интереса. Для вычисления абсолютных количественных параметров, (например, числа общей ячейки), от stereologically численные объем плотности (то есть, количество клеток на единицу объема также часто требуется общий объем органа/ткани ткани)^7,12. Помимо методов с использованием сложного технического оборудования, такие как компьютерная томография существуют в основном три практические методы, обычно используемые для определения абсолютный объем органа или ткани. Объем органа может определяться «прямого объемного измерения» согласно принципу Архимеда, т.е., измерения объема воды или физиологического раствора, перемещенных в результате структуры, когда полностью погружены. Однако соответствующе большие свинину органов, эти подходы являются непрактичными и склонны к неточности, так как они требуют очень больших объемных/измерительные колбы. Более удобно можно рассчитать объем органа/ткани от его веса и плотности^7,12,16, которые эффективно может быть определено, используя «метод погружения»^{7,12 ,16} (протокол шаг 1.1.). Ткани органов томов может быть оценена с помощью volumetry подходы, основанные на «принцип Кавальери» (1598 — 1647). В простых терминах Cavalieri принцип гласит, что если два объекта секционного в плоскостях, параллельных плоскости земли, и профили секций прорезать двух объектов на соответствующем расстояния от заземленной у тех же областях, два объекта у того же тома. Таким образом объем произвольной формы объектов может быть оценена как продукт их раздела профиля областях в параллельной, столь же далекой секущих плоскостей и расстояние между секущих плоскостей. Это приемлемые с следующую аналогию: рассмотреть два стека, состоящий из одинаковое количество идентичных монеты расположены бок о бок, один стек с монеты аккуратность, накладываются на друг друга, давая цилиндрическую форму монета стека, и другие стопка монет с-центр расположены монеты (рис. 3A). Хотя разные формы как монета стеки, их объемы совпадают, поскольку области монет на соответствующих уровнях обоих стеков (т.е., области профилей параллельных секций прорезать оба монета стеки в равных расстояниях от молотый) идентичны. Оценки объемов свинину органов и тканей, с использованием Cavalieri принцип^7,12,15 описано в шаге 1.2.

Определение степени усадки ткани, связанные с гистологическим внедрение
В анализ нескольких количественных морфологических параметров, измеряется в разделах ткани гистологических эффект встраивания связанных ткани усадка, происходящих во время обработки для Гистология ткани должен быть определены и приняты во внимание. Степень усадки встраивания связанных ткани может быть переменной и зависит как от ткани, ее обработки и внедрения средние^{8,13,,1718,19}. Как правило происходят встраивание связанные изменения объема образца ткани (т.е., главным образом усадки) во всех трех измерениях пространства, и, таким образом, затрагивает все размерные параметры оценкам количественных анализов стереологических⁸ . В принципе можно оценить степень внедрения связанных с ткани усадка, выраженный в виде линейной ткани коэффициент усадки (f_S), как показано в шаге 1.3. и используется для коррекции количественных морфологических параметров (усадка чувствительных)¹⁴.

Средневзвешенная по объему систематической выборки органов/тканей
Для создания биобанка коллекции образцов свинину органа/ткани средневзвешенная по объему систематического выборочного подходов, таких, как описано в шаге 2 оказались практический, экономящее время и эффективных методов для генерации представителя, многоцелевой ткани образцы^7,8,9,15.

Поколение изотропной единообразные случайной разделов и вертикальные единообразные случайной для количественного анализа, стереологических
Образцы тканей биобанке нужно быть подходит для широкого спектра различных количественных стереологических анализа методов для оценки максимум параметров, которые не могут быть определены без надлежащим образом подготовленного образца. Почти все количественные параметры стереологических можно определить, используя «изотропного (независимой) единообразные случайных (IUR) разделы»^8,9. В разделах IUR рандомизированных трехмерную ориентацию плоскости сечения образца ткани. Это может быть достигнуто путем рандомизации положения образца ткани относительно положения секущей плоскости, как применяется метод «Isector»¹¹ (протокол шаг 3.1), или путем рандомизации ориентации секущей плоскости относительно образец ткани, как и метод «Ориентатор»¹⁰ (протокол шаг 3.2). В образцах тканей, такие, как кожи или слизистой оболочки образца, показ естественным образом присутствуют, или определенных и правильно идентифицировать вертикальной оси, подготовка «вертикальный единообразных случайных (VUR) секций» (протокол шаг 3.3.) строго секционного в плоскости их Вертикальная ось является выгодным^8,20. Для полного дискурса теоретические основы выборки IUR/VUR и всеобъемлющего обсуждения потенциальных течению количественных стереологических анализов заинтересовавшийся читатель именуется учебники количественных stereology в жизни наук^8,9.

Протокол

Все методы, описанные здесь использовать образцы тканей, полученных от мертвых животных и полностью соответствуют нормам немецкой правовой защиты животных.

1. Volumetry

1. Погружение техника для определения плотности ткани/орган (Рисунок 1 и рис. 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Подготовка материалов: скальпель лезвия, бумажные полотенца, тонкой щипцы, стандартные лабораторные весы, стекла или пластиковые стаканы, 0,9% физиологического раствора и держатели построенных собственными образца (рис. 2A).
   2. Акцизный кусок ткани (максимальный размер: 2 x 2 x 2 см³) от органа/ткани, в частности из отсека орган интерес. Малые органы, например гипофиза, или шишковидной железы, являются измеренные в полном объеме.
      Предупреждение: Убедитесь, что размер выборки особенно меньше, чем внутренний диаметр стакан (шаг 1.1.5 et seq.) и ее уровень наполнения разрешить полное погружение образца без обращения к внутренние стены стакан на шаге 1.1.7.
   3. Тщательно тампоном образца с бумажным полотенцем, чтобы удалить избыток крови/тканевая жидкость.
   4. Взвесить образец в масштабе точности и запишите вес образца (_м/сек). Определите вес образцов малых тканей до ближайшего мг (рис. 1A).
   5. Поместите стакан, наполненный комнатной 0,9% физиологического раствора на шкале. Не полностью заполнить стакан, чтобы позволить для погружения образца ткани на последующем шаге без переполнения.
      Предупреждение: Используйте стакан размер, соответствующий размер и вес ткани представленном(ых) измеряться и эффективный диапазон шкалы. Для больших выборок до 2 x 2 x 2 см³, стакан размером 50-100 мл подходит в сочетании со шкалой измерения от приблизительно 100 мг до 500 g, тогда как для малых выборок, используйте стаканы объемом 5-10 мл в сочетании с точностью весы с диапазоны измерения между приблизительно 0,1 мг и 20 г.
   6. Опускайте держателя образца (то есть, достаточно жестким петлю тонкой проволоки или что-то подобное, рисунок 2A) в Салине помеченную позицию (стрелки в Рисунок 1B, Рисунок 2Bи 2 c рисунок). Затем сбросьте (тары) отображение шкалы к нулю.
   7. Тщательно прикрепить образец ткани для держателя образца и полностью погрузить образец в Салине до указанной позиции на держателе образца (стрелки в Рисунок 1B, Рисунок 2Bи 2 c рисунок).
      Предупреждение: Погруженной образца и держателя образца не должны иметь контакта с внутренние стены или в нижней части стакан или поверхности физиологического раствора.
   8. Удерживая держателя образца и погруженной образец в этом положении, запишите вес, отображаются на шкале (m_L), ссылаясь на вес физраствора, перемещенных в результате образца ткани (рис. 1 C, Рисунок 2B, и Рисунок 2 c).
   9. Рассчитать объем выборки (V_S) от m_Lи плотность раствора при комнатной температуре (20 ° C) (ρ_{физиологическим} = 1.0048 г/см³) как V_S m_L= / Ρ_{солевой} [g/g/см ³] (Рис. 1).
   10. Рассчитать плотность образца ткани (ρ_{образца}) от веса (т.е., массовые) образца (_м/сек) и ее объем (V_S): _Пример ρ = м_S /V_S[г/см³] (рис. 1).
   11. Для органов измеряется в totoповторите измерение в три раза и рассчитать плотность средняя орган от одного измерения значений. Для крупных органов/тканей выполняют повторные измерения с различными образцами отсеке же органа/ткани/орган и вычислить среднюю плотность от одного измерения, соответственно.
   12. Вычислите общий объем отсека органа/ткани/органа от его веса и плотности (рис. 1).
2. Применение метода Cavalieri для определения объемов свинину орган ⁷
   1. Подготовка материалов: правитель, суппорта, нож, ножницы, пинцет, водонепроницаемый перо, пластиковые прозрачные, сканер, Фото камеры и крест сетки печатаются на пластиковых пленок.
   2. Поместите весь органа/ткани на ровную поверхность (резка база) и измерить длину (l) органа вдоль его продольной оси (рисунок 3B, Рисунок 5A).
   3. Нарежьте на полный органа/ткани равноотстоящих параллельных ломтиками ортогональных орган продольной оси (рис. 3 c, Рисунок 5B). Выберите расстояние d между двумя секциями (т.е., Толщина резания разделе интервал, обычно примерно 1 см) достаточно мал, чтобы получать достаточное количество ткани/орган плит. Случайно поместите первый раздел на расстоянии между 0 и секущей интервал от края органа. Во время нарезки, визуально судите о позиции и ориентации каждого секущей плоскости, чтобы получить приблизительно параллельной органа/ткани плит примерно одинаковой толщины.
      Примечание: Необходимое количество ткани/орган плит зависит от формы и размера исследуемого органа/ткани. Если малые органы или образцы секционного в тонких плит ≤5 мм, внедрить образцы в агар до секционирование (см. шаг 1.3.3.) и использовать техническое устройство для нарезки агар встроенный образца. Эмпирически рекомендуется секущей интервалы для наиболее свинину органов и тканей, а также примеры для нарезки устройств, указаны в дополнительных материалах «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»⁷.
   4. Все ткани органов плиты на той же поверхности вниз на базе резки (т.е., последовательно на правом или левом секущей плоскости каждого органа плиты, 3D рисунок, Рисунок 5 c) и количество плит (n).
   5. Получение раздела профили ткани плит одним из следующих подходов:
      1. Осторожно поместите ткани плит на соответствующей маркировкой пластиковых пленок, при сохранении ориентации их верхняя и нижняя секции поверхностей. Обведите контуры ткани плит на пластиковой пленки с использованием водонепроницаемый пера (3E рисунок1-2).
      2. Возьмите фотографические изображения тканей плит, держа камеру вертикально над поверхности раздела (Рисунок 3F). Для калибровки место размер линейки рядом с плитами ткани.
      3. Сканировать ткани плит на планшетный сканер при сохранении ориентации их верхняя и нижняя секции поверхности (рис. 3 g). Для калибровки место размер линейки рядом с плитами ткани.
   6. Измерьте области (проследить, сфотографировали или сканированные) раздел профили всех тканей плит одним из следующих подходов:
      1. Наложение или наложения проследить орган плиты профили с соответствующего размера, калиброванный сетки равноудаленных крестов, печатаются на пластиковых прозрачности и count, все кресты, попав в разделе Профиль (Рисунок 3E3-4; по сравнению с Рисунок 5 d). Вычислить площадь сечения профиля каждого органа плиты, умножив количество крестов, ударяя области профиль в области, соответствующей одной крест.
         Примечание: Чтобы получить достаточно точный объем сметы, выбрать крест сетки с достаточно малое расстояние между соседними кресты, так что в среднем по крайней мере 100 пересекает будет хит раздела поверхности плит одного органа в каждом случае рассмотрены исследования . Эмпирически рекомендуется крест сетка размеров для наиболее свинину органов и тканей, указаны в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»⁷.
      2. Измерить области ткани плит в цифровых изображений фотографий/сканирования с помощью соответствующих коммерчески доступных или freeware морфометрия мягкой - и аппаратных приложений (рис. 3 H), например коммерческих изображений анализа системы²¹, или ImageJ²².
         Предупреждение: Примечание что один ткани плиты (первый или последний) помещается на сканер, опираясь на его естественной поверхности, соответственно, стоит перед камерой с его естественной поверхности. Таким образом отсканированные изображения, Фото изображение этой плиты, не будет отображаться раздел поверхности. Таким образом профиль не раздел области измеряется в отсканированные изображения/фото образ этой ткани плиты (Рисунок 3I). Также Примечание чрезмерной проекции в сканированные изображения и фотографии плит органа/ткани, то есть, только измерить области фактического раздела профилей, но не из ткани в изображении лежа позади поверхности раздела плиты (рис. 12 G-H).
   7. Рассчитать объем сметных орган как произведение суммы все соответствующие секции профиль области всех тканей плит в каждом случае (т.е., последовательно по в правой или левой, соответственно, Секция верхняя или нижняя поверхность каждого органа горбыль и средняя толщина плиты (то есть, коэффициент измеренной длины оси вертикальный орган (l) и количество плит)¹⁵.
3. Определение степени усадки трехмерной внедрения связанных с ткани при обработке образцов ткани для гистологии
   1. Подготовка материалов: микротом лезвия, щипцы, агар, металлических литейных форм, цифровой сканер и размер линейки (например, Диаграммная бумага).
   2. Вырежьте свежие, ровную поверхность раздела из выборки фиксированного ткани.
      Примечание: При использовании образцов легко деформируемых (мягких) тканей (жировой ткани, желеобразной ткани), внедрить образца фиксированной ткани в агар до резания (рис. 4A).
   3. Чтобы встроить образца в агар:
      1. Смешайте Стандартный агар порошок используется для микробиологии питательной среды с соответствующим объемом воды (примерно 0,5 – 1 г агара/10 мл воды) в стеклянный стакан. Перемешать смесь и тепло его в микроволновую печь на 700 Вт до кипения на 3 – 5 с. перемешать смесь и довести до кипения еще раз за 3-5 s.
      2. При необходимости, чтобы увеличить контраст агар для образца ткани, краска жидкий агар, например, с черными чернилами (добавить 1 мл чернил в 10 мл горячего жидкого агар и размешивать энергично).
      3. Залить горячей агар в литья плесень (например, металлической формы, используемые для парафина, встраивание, Рисунок 10А-D) и погрузить образец фиксированной ткани в теплой агар. Пусть агар остыть до затвердевания, удалить плесень и вырезать блок агар с встроенных ткани, используя микротом или лезвием бритвы.
         Предупреждение: При обработке горячие жидкости агар, надевайте защитные очки и перчатки. Образцы тканей процесса, фиксированной в раствор формальдегида под выхлопных капот и надевайте защитные очки и перчатки лабораторные.
   4. Поместите образец с ее поверхности раздела вниз на планшетный сканер, вместе с линейкой размер и сканирования поверхности раздела (рис. 4AB).
   5. Определите площадь поверхности раздела фиксированной ткани образца (_f) в цифровой сканирования, используя один из методов, описанных в шаге 1.2.6 (рис. 4В).
   6. Внедрить образца в пластиковых вложения среде, таких как эпоксидные (например, Epon) или glycolmethacrylate/метилметакрилатом (GMA/ММА)²³(²⁵ следующие стандартные протоколы^23,)^24, Рисунок 4 c). Убедитесь, что раздел поверхности фиксированной выборки, проверенных на предыдущем шаге (1.3.4) поддерживается в образце встраиваемый пластик.
      Примечание: Для поддержания ориентации поверхности раздела образца во время обработки образца, последовательно поместить образец с ее поверхности предназначен раздел вниз в внедрения кассеты или литья плесень, или Марк предназначен раздел поверхность (или противоположной стороне образца) с чернилами.
   7. Вырезать гистологические раздел из пластиковых блока, соответствующий оригинальный раздел поверхности образца фиксированной ткани (шаг 1.3.2) используя микротом (рис. 4 d), смонтировать раздел на слайде стекла (рис. 4 d) и выведение его регулярно ( например, гематоксилином и эозином пятно, H & E)^24,25.
      Предупреждение: Чтобы получить Гистологическое разделе примерно в той же плоскости, как оригинальный раздел поверхности образца фиксированной ткани, тщательно Отрегулируйте положение пластиковый блок на горе микротома перед секционирование.
   8. Поместите слайд с окрашенных раздел вниз на планшетный сканер вместе с линейкой размер и проверки секции (Рисунок 4E).
   9. Определите области раздела образец ткани, встраиваемый пластик (A-_e) в цифровой сканирования, используя один из методов, описанных в шаге 1.2.6 (Рисунок 4F).
   10. Рассчитайте средний внедрения связанных с ткани усадка (для соответствующих тканей и внедрения среднего) от измеряемой области соответствующего раздела профили образцов ткани до и после внедрения в пластик, встраивание среднего. Линейная усадка фактор f_s рассчитывается как квадратный корень частное области раздела профили n образцов ткани после внедрения в пластик, встраивание среднего (_e) и области соответствующий раздел профили же образцов ткани до встраивания в пластик, встраивание среднего (_f) (рис. 4 g)¹⁴.

2. объем взвешенный систематического случайной выборки путем подсчета и обработки проб тканей для различных течению типы анализа⁷

1. Подготовка материалов: правитель, суппорта, нож, ножницы, пинцет, водонепроницаемый перо, точка/крест сетки печатаются на пластиковых пленок и случайные числа таблиц.
   Примечание: Копирование шаблоны для кросс-сетки (5-60 мм) предоставляются в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»⁷.
2. Место ткани органов на ровную поверхность (резка база) и измерить длину (l) органа вдоль его продольной оси (Рисунок 5A, рис. 6А).
3. Нарежьте полный органа/ткани равноотстоящих параллельных ломтиками ортогональных своей продольной оси (Рисунок 5B). Выберите расстояние d между двумя секциями (т.е., Толщина резания разделе интервал, обычно примерно 1 см) достаточно мал, чтобы получить достаточное количество срезов ткани/орган. Случайно поместите первый раздел на расстоянии между 0 и секущей интервал от края органа. Во время нарезки, визуально судите положения и ориентации каждого секущей плоскости для получения приблизительно параллельно органа/ткани из примерно одинаковой толщины плит.
   Примечание: Необходимое количество ткани/орган плит зависит от размера исследуемого органа/ткани и количество мест пробы ткани. Если малые органы или образцы секционного в тонких плит ≤5 мм, внедрить образцы в агар до секционирование (см. шаг 1.3.3.) и использовать технические устройства для нарезки агар встроенный образца. Эмпирически рекомендуется секущей интервалы для наиболее свинину органов и тканей, а также примеры для нарезки устройств указаны в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»⁷.
4. Поместите все ткани органов плиты на одной поверхности вниз на базе резки (рис. 6B).
5. Ткани плиты с соответствующего размера сетки кросс печатаются на пластиковых прозрачности, поместив внешней оверлей покинул верхний крест сетки над случайной точки из ткани (рис. 5 c-D, Figure 6B).
   Примечание: Выберите крест сетки с достаточно малое расстояние между соседними кресты, таким образом, чтобы в каждом случае рассмотрены исследования, по крайней мере в два раза больше кресты будет хит раздела поверхность ткани отсека для выборки, как количество образцов, должны быть взяты из ткани отсеке. Эмпирически рекомендуется крест сетка размеров для наиболее свинину органов и тканей, указаны в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»⁷.
6. Марк и рассчитывать все кресты, поражения тканей (соответственно, ткани суб отсек для выборки). Последовательно применять единый режим подсчета и нумерация крестов, поражения тканей отсек для выборки в всех тканей плиты, например, путем последовательных нумерация соответствующих крестов в каждой линии, от слева направо и сверху вниз, или, например, по нумерации кресты в одной ткани плите после другой в направлении по часовой стрелке, начиная с крестом, ближе всего к двенадцати часов позиции, как образцово продемонстрировано в Рисунок 5E.
7. Разделите количество крестов, ударяя отсеке ткани/ткани для выборки (n) на количество выборок, создаваемого для получения интервал систематической выборки (i).
8. Определите в первую позицию выборки, выбора случайных чисел x в промежутке между 1 и я. Для этого используйте таблицы случайных чисел. Марк на первую позицию выборки (x) и каждый следующий x + i, x + 2я, x + 3iи т.д., крест, ударяя отсеке ткани/ткани для выборки на пластиковые прозрачности с помощью водонепроницаемый пера (Рисунок 5F).
   Примечание: Случайных чисел таблицы можно быстро и удобно создавать с помощью онлайн генератор случайных чисел.
9. Тег ткани, соответствующий отмеченного места кресты, слегка поднимая пластиковые прозрачности и размещение небольшой кусочек бумаги чистой, пустой конфетти на поверхности плиты ткани, используя пинцет (рис. 5 g, Рисунок 6E ).
10. Акцизный образца ткани из выбранных мест (рис. 5 H, 6F рис, рис. 7A) и далее подразделять их для различных типов последующих анализов (цилиндровая рисунок, Рисунок 7а-B), как указано в Таблица 1.
11. После выборки, пластиковой пленки с теплой водой и мылом, сухой, чистой и повторно использовать их.

3. поколение изотропной единообразные случайной (IUR) разделов и вертикальные единообразные случайной (VUR) для количественного анализа, стереологических

1. Техника «Isector»
   1. Подготовка материалов: бритвы или правки микротомных ножей, агар, сферические литейных форм (например, литейных для пралине, которые могут быть получены от поставщиков кондитер), foldback зажимы и пинцет.
   2. Место адекватно размера кусок (1 x 1 x 1 см³) фиксированной, систематически случайно пробы ткани в сферической литья плесень, держаться вместе foldback хомутами и заполнить форму с теплой жидкой агар (рис. 8A-E).
   3. Удаление области агар (рисунке 8F) из литья плесень после отверждения агара.
   4. Ролл сфере агар с образца встроенных ткани по всей таблице, остановить и раздел в случайные позиции.
      Примечание: Результирующий секущая плоскость является раздел ЕУР (рисунке 8F-G).
   5. Перейти к вставлять образец ткани в пластиковые смолы как GMA/MMA, поддержание ориентации секции ЕУР плоскости (см. 1.3.5).
2. Техника «Ориентатор»
   1. Подготовить материалы: бритвы или правки микротомных ножей, агар, щипцы, случайное число таблиц, печатает равноугольные и косинус взвешенный кругов.
      Примечание: В предыдущих публикаций^8,26предоставляются копии шаблонов кругов.
   2. Поместите образец фиксированной ткани (или агар встроенный фиксированной ткани) на печати равноугольные круга с одним краем параллельно 0 – 180 ° направлении (рис. 9а, Рисунок 10E).
   3. Определите случайный угол с помощью случайных чисел таблицы. Найти соответствующие отметки на шкале равноугольные круга, который образца опирается на. Использование этих знаков, вырезать раздел образца (или через агар, окружающих образца встроенных ткани), с ориентируясь секущей плоскости параллельно направлению случайный угол, показано на шкале равноугольные круга и вертикально отдыхает поверхности образца (рис. 9B-C, Рисунок 10F).
   4. Поместите блок ткани с поверхностью раздела, созданного на предыдущем шаге, сталкивается с недостатком на косинус взвешенный круг с края поверхности покоя, уложены параллельно оси 1-1 (9D рисунок, Рисунок 10 H).
   5. Повторите шаг 3.2.3 и вырезать новый раздел через образец на случайный угол определяется с использованием случайных чисел таблицы (Рисунок 9E-F, рис 10I-J).
      Примечание: Результирующий секущая плоскость является раздел IUR.
   6. При необходимости, определить области ЕУР раздел профиля выборки фиксированного ткани для определения связанных с встраивание ткани усадка (Рисунок 9 g-J), как описано в шаге 1.3 и приступить к вставлять образец ткани в пластик смолы, например GMA/ММА.
3. Генерация вертикальных единообразные случайной (VUR) секций
   1. Подготовка материалов: бритвы или правки микротомных ножей, агар, щипцы, случайных чисел таблиц и печатает равноугольные кругов.
      Примечание: В предыдущих публикаций^8,26предоставляются копии шаблонов кругов.
   2. Определение вертикальной оси в образец фиксированной ткани, которая всегда узнаваемый в разделах образца на последующих этапах.
      Примечание: Как правило, оси вертикальные природные поверхности образца ткани выбирается в качестве вертикальной оси.
   3. При необходимости, внедрить образца в агар (рис. 11B).
      Примечание: Агар встраивание до VUR - или ЕУР резании фиксированной выборки обычно рекомендуется для малых, тонких, хрупких или мягких образцах. Также используйте агар встраивание образцов для облегчения позиционирования образца секционного VUR во время последующего внедрения образца в пластиковые смолы.
   4. Поместите образец на печать равноугольные круга, с вертикальной осью, ориентируясь ортогонально к плоскости таблицу таблица/бумага (Рисунок 11C).
   5. Вырезать образца на случайный угол (определяется с помощью таблицы случайных чисел) с секущей плоскости ортогонально к таблице и параллельно вертикальной оси, чтобы получить VUR секущей плоскости (рис. 11 d).
   6. При необходимости, определить области ЕУР раздел профиля выборки фиксированного ткани для определения связанных с встраивание ткани усадка, как описано в шаге 1.3 (Сравните Рисунок 9 g-J) и приступить к вставлять образец ткани в пластиковые смолы как GMA/ММА.

Результаты

Метод погружения для определения плотности ткани/орган

Рисунок 12А -B показывает, представитель определение плотности и объема свиные почки методом погружения, описанный в шаге 1.1 (рис. 1, рис. 2). В таблице 2представлены более представительным результаты измерений плотности дополнительных свинину органов и т...

Обсуждение

Поколения биобанке образца коллекций из свиных животных моделей требуются надежные методы и протоколы для определения объемов органа/ткани, воспроизводимые поколения представителя, подходит для широкого круга образцов избыточной ткани анализ различных методов и для рандомизации ориентации образца секций для количественного анализа, стереологических. Методы, описанные в настоящей статье, адаптированы к размерам свинину органов и тканей и были разработаны для эффективного удовлетворения этих потребностей^2...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Agar	Carl Roth GmbH, Германия	Агар (порошок), кат.: 5210.3	Растворите примерно 1 г агара в 10 мл холодной воды в стеклянном или пластиковом стакане, нагрейте в микроволновой печи до 700 Вт, дважды вскипятите раствор при тщательном помешивании. Отлить в форму еще в тепле и дать застыть. Внимание: При работе с горячим жидким агаром надевайте защитные очки и перчатки.
Суппорт	Hornbach Baumarkt GmbH, Борнхайм, Германия	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 мм Кат.: 3664902	Подойдет любой тип суппорта (механический или электронный).
Литейные формы (металл)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, Германия	Einbettschä lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 мм, кат.: 14302b	Подойдет и любая другая форма для литья металла, используемая для заделки парафина.
Шаблоны копий поперечных сеток (5мм - 6 см)			копий поперечных сеток (5мм - 6 см) предоставлены в дополнительном файле данных Albl et al.  Токсикол Патол. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Копировать шаблоны равноугольных и косинусовзвешенных кругов	в том числе не более чем н.а.н.а.Копировать		шаблоны равноугольных и косинусовзвешенных кругов можно в Nyengaard & Гундерсен. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) и в Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathology. В: Haschek and Rousseaux´ Справочник по токсикологической патологии. 3-е изд., 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Откидные зажимы (YIHAI binder clips, 15 мм и 19 мм)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., Китай	Y10006 и Y10005	Любой другой тип стандартных офисных откидных зажимов также подойдет.
Щипцы (анатомические)	NeoLab Migge GmbH, Гейдельберг, Германия	neoLab Standard -Pinzette 130 мм, анатомический, rund, кат.: 1-1811	Подойдет любой тип анатомических щипцов.
Раствор формальдегида 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Флинтсбах, Германия	Формальдегид 37/40 %, кат.: 1000411525005	Разбавить до 4% из концентрированного раствора. Буфер до нейтрального pH. Носите соответствующие средства защиты глаз, рук и органов дыхания. Обработайте образцы тканей, зафиксированные в растворе формальдегида под вытяжным колпаком и надев защитные очки и лабораторные перчатки.
Миллиметровая бумага (для калибровки)	Bü romarkt Bö ttcher AG, Йена, Германия. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Подойдет любой тип миллиметровой бумаги (в масштабе в миллиметрах).
Лабораторные стаканы (5мл, 10 мл, 50 мл, 100 мл)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Германия	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Кат.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Подойдет любой вид стеклянных или пластиковых стаканов объемом 5 – 100 мл.
Лабораторные весыMettler	Toledo GmbH, Gieß en, Германия	PM6000	Любые стандартные лабораторные весы с диапазонами измерения от 0,1 мг до приблизительно 20 г, соответственно от 100 мг до приблизительно 500 г подойдут
	для Sartorius AG, Gö ttingen, Германия	BP61S
Микротомные лезвия	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, Германия	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Подойдет любой вид одноразовых лезвий для микротомов.
Программное обеспечение/система морфометрии/планиметрии	Национальный институт здравоохранения (NIH)	ImageJ	Скачать с https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Германия	Система анализа изображений VideoplanTM	Нет в наличии
Фотоаппарат	Nikon	D40	Подойдет любой вид цифровой фотоаппарата, который можно установить на штатив.
Пластиковые прозрачные пленки	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Подойдет любая (лазерная) пластиковая прозрачность.
Таблицы случайных чисел	n.a.n.a.Таблицы		случайных чисел могут быть удобно сгенерированы (с заданными числами случайных чисел и в пределах определенных интервалов), используя генераторы случайных чисел, такие как: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Подойдет любой вид бритвенных лезвий.
Линейка	Bü romarkt Bö ttcher AG, Йена, Германия. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 см, Kunststoff, прозрачный, кат.: ln30	Подойдет любая линейка с масштабированием см-мм.
Физиологический раствор (0,9%)	Carl Roth GmbH, Германия	Натрийхлорид, >99% Кат.: 0601.1	Для приготовления 0,9% солевого раствора растворите 9 г NaCl в 1000 мл дистиллированной воды при температуре 20°C.
Лезвия для скальпелей	Aesculap AG & Co KG, Туттлинген, Германия	BRAUN Хирургические лезвия N° 22	Подойдет любой вид лезвий скальпеля.
Сканер	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Подойдет любой тип стандартного офисного сканера, способного сканировать с разрешением от 150-600 dpi.
Примеры			сконструированных устройств для нарезки можно найти в Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) и в дополнительном файле данных Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Сферические литейные формы (например, диаметром 25,5 мм)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Германия	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25,5 мм	Сферические литейные формы также могут быть изготовлены самостоятельно или приобретены у других поставщиков кондитерских изделий (например, для пралине). Указанные здесь формы для литья на самом деле представляют собой упаковку/упаковку полых тел пралине (сначала ешьте пралине, а затем используйте пакет для создания секций i-сектора)
Тонкая проволока	Basteln & Hobby Schobes, Straß Фюрт, Германия. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0,3 мм) Кат.: 216464742	Подойдет и любая другая тонкая проволока.
Папиросная бумага	NeoLab Migge GmbH, Гейдельберг, Германия	Declcate Task Wipes-White, кат.: 1-5305	Подойдет и любая другая лабораторная папиросная бумага.
Водонепроницаемая ручка	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nü rnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, черный, кат.: 313-2	Подойдет и любой другой вид водостойкой ручки.