Определение липидов индекс путем восстановления жидкого флуоресценции в грибкового патогена Пузырчатая Maydis

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол для получения липидного капель индекс (LD) для изучения динамики триацилглицеролов в клетки культивировали в высок объём экспериментов. Assay индекс LD-это простой и надежный метод, который использует BODIPY 493/503. Этот assay не нужно dispendious экстракции липидов или анализа в микроскопии.

Аннотация

В статье показано как реализовать пробирного LD индекс, который является чувствительной Гонав пробирного определить накопление триацилглицеролов (Теги) в капельках липидов (LDs). LD индекс получается без экстракции липидов. Это позволяет измерения содержания LDs в высок объём экспериментов в различных условиях, таких как рост в богатых или азота в исчерпаны средства массовой информации. Хотя этот метод был описан в первый раз для изучения капелька метаболизма липидов в Saccharomyces cerevisiae, он был успешно применен к базидиомицета пузырчатая maydis. Интересно и потому, что LDs являются органеллы, филогенетически сохраняется в эукариотических клетках, метод может быть применен к большое количество клеток, от дрожжевых клеток млекопитающих. LD индекс основан на пробу восстановления жидкого флуоресценции (LFR) BODIPY 493/503 тушения условиях путем добавления ячеек фиксированной с формальдегидом_. Калий йод используется как флуоресценции утоления. Соотношение между флуоресценции и склонах оптической плотности называется LD индекс. Склоны вычисляются из прямых линий, полученных при BODIPY флуоресценции и оптическая плотность 600 Нм (₆₀₀OD) заговор против добавления образца. Оптимального качества отражается коэффициенты корреляции равной или выше 0,9 (r ≥ 0.9). Несколько образцов можно читать одновременно, как он может быть реализован в микроплиты. Поскольку BODIPY 493/503 липофильных флуоресцентных красителей что разделы в капелек липидов, она может использоваться во многих типах клеток, которые аккумулируют LDs.

Введение

Липидного капель (LDs) являются повсеместно внутриклеточного жира тела состоит из ядра нейтральные липиды, главным образом Теги и эфиры стеринов (SE). Ядро окружен монослоя фосфолипидов, который взаимодействует с белками, как perilipin и ферментов, участвующих в синтезе нейтральные липиды, например диацилглицерол ацил трансферазы, ацетил-КоА carboxylase и дефицит ацил CoA синтазы¹. Из-за его динамическое поведение фосфолипидный монослоя также содержит триацилглицеринов липазы которые гидролизуют Теги и SE². В зависимости от типа клеток и организм хранимые нейтральные липиды могут использоваться для получения энергии, или....

Протокол

1. Подготовка буферов и решения

1. Подготовить 1 Л фосфата буфер солевой раствор (PBS, pH 7), растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г х₂PO₄ 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с HCl, а затем добавьте воды для окончательного объемом 1 л PBS могут быть сделаны как 10 x Стоковый раствор и хранятся при комнатной температуре.
2. Подготовить 10 мл фиксации решение, добавьте 1 mL 37% формальдегида в 9 мл PBS до конечной концентрации 3,7%. Готовить это решение непосредственно перед использованием.
   Предупреждение: Используйте перчатки для обработки раствора формальдегида.

Результаты

НОСЛЛ, с BODIPY 493/503 как флуоресцентный зонд является надежной и простой метод для изучения динамических накопление LDs в U. maydis, независимо от условий роста. Когда клетки были культивировали в YPD-средний, было увеличение индекса LD на этапе экспоненциального последующим снижением в стационарной фазе (рисунок 2A). В противоположность этому в клетках, выращенных под азота голод, был неуклонный рост индекса LD поэтапно как экспоненциальная и ста.......

Обсуждение

LFR это новый метод, который был применен в первый раз для изучения жирового обмена в S. cerevisiae и позднее было успешно реализовано в U. maydis^20,21. Хотя индекс LD не абсолютное значение тэгов, накапливается в клетках, он обеспечивает быстрый идея содержания липидов клеток, и интерпретация данных проста при сравнении LD индекс из двух или более экспериментальных условиях. BODIPY 493/503 весьма специфичен для нейтральные липиды, основной комп.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Спектрофотометр	Varioskan Lux многомодовый микропланшет	reade D5879	Filter 493/503 или монохроматор
детектора Plate costar	Corning Inc.	3615	96 луночный планшет с черными стенками/прозрачным дном
costar	Corning Inc	3598	96 луночный планшет для культивирования клеток
costar BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-дифтор-1,3,5,7,8-пентаметил-4-бора-3a,4a-диаза-s-индацен
Раствор формальдегида	Sigma Aldrich	252549	реагент ACS, 37 мас.% в H2O, содержит 10-15% метанола для предотвращения полимеризации
Йодид калия	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC	201384	Базидиомицет-дрожжи Хлорид
натрия	Sigma Aldrich	746398	реагент ACS, неорганическая соль
Фосфат калия одноосновной	Sigma Aldrich	P0662	ACS реактив
Select Экстракт дрожжей	Sigma Aldrich	Y100	Смесь аминовых кислот, пептидов, водорастворимых, витаминов и углеводов для питательных сред
N-Z case plus	Sigma aldrich	N4642	Казеиновый ферментативный гидролизат из коровьего молока
Глюкоза	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) глюкоза
Skaker колба	Pirex	CLS4450250-6EA	Borosiicate glass
Shaker	SEV Mé xico	INO650V-7	Орбитальный шейкер
Стол для центрифуги	Eppendorf	5415C	Центрифуга
Микропробирки	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
Наконечники для пипеток	Axygen Scientific	T-200-Y	Универсальные наконечники для пипеток со скошенным концом, 200 мкл, нестерильная
пипетка mLine	Biohit	725130	8 каналов, диапазон объема 5-100 мкл