Количественные и качественные метод сфингомиелин, LC-MS, с использованием двух стабильных гетерогенны помечены виды сфингомиелин

Summary

Здесь мы представляем протокол для количественного определения и квалификацию каждого вида сфингомиелин, используя несколько мониторинг реакции и МС/МС/МС режим, соответственно.

Abstract

Мы представляем метод анализа сфингомиелин (SM) качественно и количественно жидкого хроматографии электроспрей ионизации тандем масс-спектрометрия (LC-ЭСИ-МС/МС). SM является общей Сфинголипиды, состоящий из фосфорилхолин и Церамид как компонент гидрофильные и гидрофобные, соответственно. Ряд видов SM присутствуют в клетках млекопитающих из-за разнообразия в сфингоидные длинной цепи базы (LCB) и N-ацил группу в составе Церамид. В настоящем докладе, мы показываем метод оценки количество углерода и двойных связей в LCB и N-ацил группу на основе их соответствующего продукта ионов в экспериментах MS/MS/MS (³МС). Кроме того мы представляем метод количественного анализа для SM с использованием двух стабильных гетерогенны помечены SM видов, что облегчает определение диапазона, используемые в SM количественный. Нынешний метод будет полезным при характеристике различных видов SM в биологических образцов и промышленных продуктов, таких как косметика.

Introduction

Сфингомиелин (SM) является общим Сфинголипиды в mammalian клетках. SM-синтезированных внутриклеточно¹ и настоящего как прекурсор для других Сфинголипиды, такие как сфингозин-1-фосфата и керамиды, которые имеют решающую роль в иммунной клетки оборота и кожи барьер гомеостаза, соответственно^{2, 3}. Таким образом точный анализ метаболизма SM имеет важное значение для выяснения роли физиологических и патологических Сфинголипиды.

SM состоит из церамида и фосфорилхолин, что связано с 1-гидрокси группы Церамид, которая также состоит из сфингозин и N-ацил ост....

Protocol

Консультации все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Надевайте перчатки, чтобы свести к минимуму загрязнение образцов кожи производные SM. Настоящий Протокол применяется к клетки HeLa, выращенных в орла минимальных основных средних дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамин, 1.000 U/L пенициллина и стрептомицина 100 мг/Л.

1. подготовка проб липидов

Примечание: Важно, что все стекла, включая пробирки с тефлоновым покрытием колпачки быть моющих средств бесплатно.

1. Извлечение общего Липидные фракции из клеток огневки, используя метод....

Results

Химически синтезированных d18:1 / см (рис. 1A) и d18:1 24:0 / 24:0 SM в образцах липидов, извлеченные из клеток HeLa (рис. 1Б) были проанализированы LC-ЭСИ-МС³ использованием [M + HCOO]^– и [M-CH₃]^- как первый и второй прекурсоров ионы, соответственно. Обратите внимание, что интенсивность спектра деметилированное sphingosylphosphorylcholine (СПК) (m/.......

Discussion

В настоящий качественный метод, мы получили MS³ продукта ионов SPC и N-ацил остаток. Важно, чтобы правильно назначить SPC и N-ацил остаток. В этой связи следует отметить, что другие молекулы, содержащие фосфорилхолин также могут быть обнаружены как MS³ продукта ионов. Diacyl фосфатидилхолин (PC) и Плазмалогены PC изобилии присутствуют в клетках млекопитающих, и их гидрофобность подобна SM. Таким образом diacyl- и Плазмалогены ПК с изотопом (обычно ¹³C) может быть теорети.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	ThermoFisher	10010023
100 мм чашка для культуры	тканей IWAKI	3020-100
Скребок	для клеток IWAKI	9000-220
Силиконизированная пробирка 2,0 мл	Fisher Scientific	02-681-321
Пробирка	IWAKI	TST SCR 16-100
Завинчивающаяся крышка с тефлоновой футеровкой	IWAKI	9998CAP415-15
Одноразовая стеклянная трубка	IWAKI	9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 & m 1,5 мм I.D. x 100 мм	Shiseido	92223	Картридж Guard вставляется в держатель картриджа и соединяется с колонкой C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 мм x 10 мм GUARD CARTRIDGE	Shiseido	12197
Держатель картриджа	Shiseido	12415
Ацетонитрил	Wako	018-19853
2-пропанол (изопропиловый спирт)	Wako	161-09163
Метанол	Wako	134-14523
Муравьиная кислота	Wako	066-00466
28% Аммиак вода	Wako	016-03146
Ультразвуковая аппаратура (ванного типа)	SHARP	UT-206H
Вихревой миксер для стеклянной пробирки	TAITEC	Mix-EVR
1,4 мл стеклянный флакон	Tomsic	500-1982	Образцы хранятся в стеклянном флаконе объемом 1,4 мл, запаянном завинчивающейся крышкой и перегородкой 8 мм при температуре -20°С; C
8 мм перегородка	Tomsic	200-3322	При анализе образцов винтовые крышки заменяются на винтовые крышки с прорезью перегородки
Винтовая крышка для стеклянного флакона 1,4 мм	Tomsic	500-2762
Винтовая крышка с прорезью перегородки	Shimadzu GLC	GLCTV-803
PVDF 0.22 &; m фильтр	Millipore	SLGVR04NL
Тройная квадрупольная и квадрупольная линейная ионная ловушка масс-спектрометрия	SCIEX	QTRAP4500
Программное обеспечение для сбора данных и анализа ионных спектров продукта	SCIEX	Analyst
Программное обеспечение для интеграции данных в количественный анализ	SCIEX	MultiQuant
ВЭЖХ система	Shimadzu	Nexera
Стеклянная бутылка	Sansyo	85-0002
d18:1/24:0 сфингомиелин	Avanti Полярные липиды	860592P
Сфингозицилфосфорилхолин	Merck	567735
фетальная бычья сыворотка	ThermoFisher
L-глютамин	ThermoFisher
Пенициллин и стрептомицин	Sigma	P4333
Eagle' s минимальная необходимая среда	Sigma	M4655