Методическая статья

Количественные и качественные метод сфингомиелин, LC-MS, с использованием двух стабильных гетерогенны помечены виды сфингомиелин

DOI:

10.3791/57293

⸱

7 мая 2018 г.

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для количественного определения и квалификацию каждого вида сфингомиелин, используя несколько мониторинг реакции и МС/МС/МС режим, соответственно.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем метод анализа сфингомиелин (SM) качественно и количественно жидкого хроматографии электроспрей ионизации тандем масс-спектрометрия (LC-ЭСИ-МС/МС). SM является общей Сфинголипиды, состоящий из фосфорилхолин и Церамид как компонент гидрофильные и гидрофобные, соответственно. Ряд видов SM присутствуют в клетках млекопитающих из-за разнообразия в сфингоидные длинной цепи базы (LCB) и N-ацил группу в составе Церамид. В настоящем докладе, мы показываем метод оценки количество углерода и двойных связей в LCB и N-ацил группу на основе их соответствующего продукта ионов в экспериментах MS/MS/MS (3МС). Кроме того мы представляем метод количественного анализа для SM с использованием двух стабильных гетерогенны помечены SM видов, что облегчает определение диапазона, используемые в SM количественный. Нынешний метод будет полезным при характеристике различных видов SM в биологических образцов и промышленных продуктов, таких как косметика.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сфингомиелин (SM) является общим Сфинголипиды в mammalian клетках. SM-синтезированных внутриклеточно1 и настоящего как прекурсор для других Сфинголипиды, такие как сфингозин-1-фосфата и керамиды, которые имеют решающую роль в иммунной клетки оборота и кожи барьер гомеостаза, соответственно2, 3. Таким образом точный анализ метаболизма SM имеет важное значение для выяснения роли физиологических и патологических Сфинголипиды.

SM состоит из церамида и фосфорилхолин, что связано с 1-гидрокси группы Церамид, которая также состоит из сфингозин и N-ацил ост....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Консультации все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Надевайте перчатки, чтобы свести к минимуму загрязнение образцов кожи производные SM. Настоящий Протокол применяется к клетки HeLa, выращенных в орла минимальных основных средних дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамин, 1.000 U/L пенициллина и стрептомицина 100 мг/Л.

1. подготовка проб липидов

Примечание: Важно, что все стекла, включая пробирки с тефлоновым покрытием колпачки быть моющих средств бесплатно.

  1. Извлечение общего Липидные фракции из клеток огневки, используя метод....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Химически синтезированных d18:1 / см (рис. 1A) и d18:1 24:0 / 24:0 SM в образцах липидов, извлеченные из клеток HeLa (рис. 1Б) были проанализированы LC-ЭСИ-МС3 использованием [M + HCOO]– и [M-CH3]- как первый и второй прекурсоров ионы, соответственно. Обратите внимание, что интенсивность спектра деметилированное sphingosylphosphorylcholine (СПК) (m/.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящий качественный метод, мы получили MS3 продукта ионов SPC и N-ацил остаток. Важно, чтобы правильно назначить SPC и N-ацил остаток. В этой связи следует отметить, что другие молекулы, содержащие фосфорилхолин также могут быть обнаружены как MS3 продукта ионов. Diacyl фосфатидилхолин (PC) и Плазмалогены PC изобилии присутствуют в клетках млекопитающих, и их гидрофобность подобна SM. Таким образом diacyl- и Плазмалогены ПК с изотопом (обычно 13C) может быть теорети.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана исследовательский грант от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии (KAKENHI) для К.Х. (#15 K 01691), Ю.Ф (#15 K 08625), к.ю. (#26461532) и Грант для изучения сложных заболеваний проекта от министерства Здравоохранения, труда и социального обеспечения (к.ю. #201510032A). Мы благодарим группу Edanz (www.edanzediting.com/ac) для редактирования проекта этой рукописи.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PBSThermoFisher10010023
100 мм чашка для культурытканей IWAKI3020-100
Скребокдля клеток IWAKI9000-220
Силиконизированная пробирка 2,0 млFisher Scientific02-681-321
ПробиркаIWAKITST SCR 16-100
Завинчивающаяся крышка с тефлоновой футеровкойIWAKI9998CAP415-15
Одноразовая стеклянная трубкаIWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 & m 1,5 мм I.D. x 100 ммShiseido92223Картридж Guard вставляется в держатель картриджа и соединяется с колонкой C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 мм x 10 мм GUARD CARTRIDGEShiseido12197
Держатель картриджаShiseido12415
АцетонитрилWako018-19853
2-пропанол (изопропиловый спирт)Wako161-09163
МетанолWako134-14523
Муравьиная кислотаWako066-00466
28% Аммиак водаWako016-03146
Ультразвуковая аппаратура (ванного типа)SHARPUT-206H
Вихревой миксер для стеклянной пробиркиTAITECMix-EVR
1,4 мл стеклянный флаконTomsic500-1982Образцы хранятся в стеклянном флаконе объемом 1,4 мл, запаянном завинчивающейся крышкой и перегородкой 8 мм при температуре -20°С; C
8 мм перегородкаTomsic200-3322При анализе образцов винтовые крышки заменяются на винтовые крышки с прорезью перегородки
Винтовая крышка для стеклянного флакона 1,4 ммTomsic500-2762
Винтовая крышка с прорезью перегородкиShimadzu GLCGLCTV-803
PVDF 0.22 &; m фильтрMilliporeSLGVR04NL
Тройная квадрупольная и квадрупольная линейная ионная ловушка масс-спектрометрияSCIEXQTRAP4500
Программное обеспечение для сбора данных и анализа ионных спектров продуктаSCIEXAnalyst
Программное обеспечение для интеграции данных в количественный анализSCIEXMultiQuant
ВЭЖХ системаShimadzuNexera
Стеклянная бутылкаSansyo85-0002
d18:1/24:0 сфингомиелинAvanti Полярные липиды860592P
СфингозицилфосфорилхолинMerck567735
фетальная бычья сывороткаThermoFisher 
L-глютаминThermoFisher 
Пенициллин и стрептомицинSigmaP4333
Eagle' s минимальная необходимая средаSigmaM4655
2614007925030081

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HeLa

Похожие статьи