Method Article

ТРИФОСФАТЫ опосредованной потери функции анализа в мозжечковой грануле клеток с помощью в утробе матери на основе электропорации перенос генов

DOI:

10.3791/57311

⸱

June 9th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Neurogenetics, German Cancer Research Center (DKFZ), DKFZ-ZMBH Alliance, 2Division of Molecular Genetics, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 3Hopp-Children's Cancer Center at the NCT Heidelberg (KiTZ), 4Division of Pediatric Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 5Department of Pediatric Hematology and Oncology, Heidelberg University Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычные потери функции исследования генов с помощью маскирования животных часто были дорогостоящим и трудоемким. Электропорация основанный ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутагенеза является мощным инструментом, чтобы понять, что ген функционирует в естественных условиях. Здесь мы приводим метод для анализа нокаут Фенотипы пролиферирующих клеток мозжечка.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пороки развития головного мозга часто является причиной генетических мутаций. Расшифровка мутации в тканях пациента производный выявила потенциальные причинных факторов заболеваний. Чтобы проверить вклад дисфункции мутировавших генов для развития болезни, поколения животных моделей, перевозящих мутации — один очевидный подход. Хотя микрофлорой генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) являются популярных биологических средств и воспроизводимые результаты, он ограничен по времени и расходов. Между тем не микрофлорой GEMMs часто позволяют изучить функции гена более осуществимым образом. Поскольку некоторые мозга заболевания (например, опухоли головного мозга), как представляется, в результате соматических но не герминальных мутаций, не микрофлорой химерных мыши модели, в которой сосуществуют нормальных и ненормальных клеток, может быть полезным для болезни значимого анализа. В этом исследовании мы приводим метод для индукции ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутаций в мозжечке. В частности, мы использовали условное стук в мышей, в которых Cas9 GFP хронически активизируются и промоутер CAG (ЦМВ усилитель/курица ß миозина) после Cre-опосредованной рекомбинации генома. Самостоятельно разработанные сингл руководство РНК (sgRNAs) и Cre рекомбиназа последовательности, оба закодированы в одной плазмидные конструкции, были доставлены в мозжечковой стволовых/прогениторных клеток на эмбриональном этапе с помощью электропорации в утробе матери . Следовательно Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), способствуя тем самым далее фенотипические анализы были помечены transfected клеток и их дочь клетки. Следовательно этот метод не только показаны доставки на основе электропорации гена в эмбриональных клеток мозжечка, но предлагает также Роман количественный подход к оценке ТРИФОСФАТЫ опосредованной фенотипов потери функции.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заболевания головного мозга являются одним из самых страшных смертельной болезни. Они часто являются результатом генетических мутаций и последующей регуляции. Чтобы понять молекулярные механизмы заболеваний головного мозга, когда-либо прочного усилия расшифровать геном человека пациентов обнаружили ряд возможных причинных генов. До настоящего времени микрофлорой генетически модифицированные Животные модели были использованы в естественных условиях получить из функции (Гоф) и потери функции (LOF) анализ генов такого кандидата. Из-за ускоренного развития функциональной проверки исследований желательно более осуществимым и гибкие в vivo гена пробирного систему для изучения функции гена.

Применение системы передачи на основе электропорации гена в естественных условиях на развивающийся мозг мыши подходит для этой цели. В самом деле несколько исследований, с использованием в утробе матери электропорации показали свой потенциал для проведения функционального анализа в развивающегося мозга1,2,3. На самом деле несколько регионов мозга мыши, например коре4, сетчатки5, таламус6, задний мозг7, мозжечок8и спинного9 были мишенью соматическая генная доставки подходы, пока.

Действительно выражение переходных гена путем электропорации в естественных условиях на мозги эмбриона мыши уже давно используется для GOF анализа. Последние технологии на основе transposon геномной интеграции далее включены долгосрочные и/или условное выражение генов интерес10,11, который выгодно чтобы вскрыть функции гена на основе пространственных и временных во время развития. В отличие от GOF анализ анализ LOF была более сложной. Хотя была выполнена переходных трансфекции малые интерферирующие РНК и перевозящих индуцируемый плазмид, долгосрочные последствия LOF генов не гарантируется из-за возможной деградации экзогенно введено нуклеиновых кислот, таких как плазмидов и двуцепочечных РНК. Однако ТРИФОСФАТЫ/Cas технология обеспечивает прорыв в LOF анализы. Гены, кодирующие флуоресцентных белков (например, GFP) или биолюминесцентных белков (например, Светлячок Люцифераза) были совместно transfected ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и sgRNAs для обозначения клетки подвергаются ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной соматических мутаций. Тем не менее этот подход может иметь ограничения в функциональных исследований пролиферирующих клеток, так как разбавленный и деградированных после долгосрочного распространения экзогенных маркерных генов. В то время как transfected клеток и их дочь клетки претерпевают ТРИФОСФАТЫ индуцированной мутации в их геном, их следы могут заблудиться со временем. Таким образом генетических меток подходов будет подходящим для преодоления этой проблемы.

Мы недавно разработали метод основанный ТРИФОСФАТЫ LOF в клетках мозжечковой гранул, которые проходят долгосрочного распространения во время их дифференциации12. Генетически маркировать transfected клеток, мы построен плазмида, перевозящих sgRNA вместе с КРР и введены плазмида cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мышей13 с помощью электропорации в утробе матери . В отличие от обычных плазмида векторов кодирования EGFP, этот подход успешно помечены грануле transfected нейрон прекурсоров (ВНП) и их дочь клетки. Этот метод обеспечивает большую поддержку в понимании в естественных условиях функции генов интерес в пролиферирующих клеток в развитие нормального мозга и опухоли подверженных фон.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были проведены согласно правилам защиты животных и были одобрены ответственными органами (Regierungspräsidium Карлсруэ, утверждение чисел: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 и G133/14).

1. создать плазмиды pU6-sgRNA-Cbh-Cre

  1. Дизайн sgRNA целевой гена интереса согласно ранее опубликованного протокола №14.
    Примечание: В этом эксперименте, два sgRNAs предназначены для целевой мыши ген Top2b и не являющихся объектом контроля sgRNA (Таблица 1). В плей-офф gene(s) с помощью технологии ТРИФОСФАТЫ sgRNAs необходимо разработать целевой кодирующая последовательность 5' региона либо основных функциональных домен белка. Одной удобной отправной точкой является для тестирования публично доступных готовых sgRNA последовательностей, как в GeCKO v2 мыши нокаут бассейн библиотеки15 из лаборатории Чжан. Кроме того, sgRNAs могут разрабатываться с использованием общественных программного обеспечения таких как следующий веб-узел: crispr.mit.edu.
  2. Клон sgRNAs в pU6-sgRNA-Cbh-Cre вектор.
    Примечание: PU6-sgRNA-Cbh-Cre вектор12 , используемые в данном исследовании является производным от оригинальной плазмида pX33016 , заменив кодирующая последовательность SpCas9 рекомбиназа Cre .
    1. Синтезировать два ДНК oligos следующим образом. Смысл: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
      Примечание: 20 N в показано выше стенд для sgRNA последовательности.
    2. Дайджест pU6-sgRNA-Cbh-Cre с BbsI на 30 минут при 37 ° C, с использованием следующих реагентов, загрузить переваривается образец гель агарозы 1% и очистить их с помощью геля добыча комплект. Использование 3 мкг плазмиды; 3 мкл Bbsя; 1 мкл FastAP; 5 мкл 10 x буфер пищеварения; Добавьте ddH2O довести объем до 50 мкл.
    3. Фосфорилировать и отжига каждой пары sgRNA oligos с использованием следующих реагентов (общий объем 10 мкл): 1 мкл подгонянные смысл oligo (100 мм); 1 мкл подгонять антисмысловых oligo (100 мм); 1 мкл 10 x буфер лигирование T4; 6,5 мкл ddH2O; 0.5 МКЛ T4 ПНК. Инкубировать в термо циклователь на 30 минут при 37 ° C и 5 мин при 95 ° C, а затем рампы до 25 C ° на 5 ° C/мин.
    4. Настройте следующие реакции перешнуровки и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре (общий объем 10 мкл): X µL Bbsя переваривается плазмида (50 нг); 1 мкл фосфорилированных и отжигом, oligo дуплекс (разбавления 1: 200); 5 мкл 2 x лигирование буфер; X µL ddH2O; 1 мкл быстрый лигаза.
    5. 2 мкл лигирование продукта, в 50 мкл химически компетентных клеток DH5α кишечная палочка . После 30 минут инкубации на льду, тепловой шок образца для 90 s при 42 ° C и инкубировать в течение 2 минут на льду. 100 мкл LB среднего и пластины на пластину LB, содержащий ампициллина 100 мкг/мл.
      Примечание: Интеграция sgRNA последовательности в pU6-sgRNA-Cbh-Cre плазмиду производится по клонирования шаги для плазмида pX33014.
    6. Прививок две колонии, каждый по 2 мл среды фунтов при 37 ° C как минимум 6 часов и выполнять мини-prep ДНК изоляции с помощью комплекта.
    7. Сэнгер последовательности ДНК мини-prep, используя праймер hU6-вперед и определить колоний с правильной вставки sgRNAs, совместив с последовательностью, показанный в шаге 1.2.1. Грунтовка последовательность показано в таблице 1. Плазмиды, используемые в данном исследовании были названы pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-КРР и pU6-sgControl-Cbh-Cre.
    8. Прививать правильно определил колоний и очистить бесплатно эндотоксина плазмидной ДНК для электропорации в утробе матери с помощью комплекта, например, от Qiagen. Элюировать ДНК с бесплатно эндотоксина TE-буфера разводят в ddH2O в 1:10 (10% TE буфера). Концентрации ДНК плазмиды должен быть выше, чем 2 мг/мл.
      Примечание: Не используйте регулярные комплект макси prep для подготовки ДНК. Хранить плазмида решения на 4 ° C для регулярного использования краткосрочных (до 4 недель), или Алиготе соответствующий объем около 25 мкл и держать при-20 ° C для длительного хранения.

2. Проверьте работоспособность с помощью системы плазмида EGxxFP sgRNAs

Примечание: Эффективность sgRNAs обычно проверяется сюрвейера или T7E1 (T7 эндонуклеазы I) анализов. В этом протоколе используется простой и эффективный альтернативный подход. Ключом такой подход заключается в использовании плазмида pCAG-EGxxFP, который содержит перекрывающиеся фрагменты EGFP, разделенных последовательность ДНК, содержащие sgRNA, ориентация сайта17. Выражение pCAG-EGxxFP вместе с sgRNA и Cas9 в transfected клеток Cas9-опосредованной двойной нити перерыв (DSB) в последовательности целевых объектов ремонта эндогенного гомологии зависимых механизмов, который восстанавливает EGFP выражение кассета.

  1. Дизайн грунтовки усилить геномной региона по центру с sgRNA, ориентация последовательности. Ампликон ПЦР составляет примерно 500 bp. В этом эксперименте Ассамблея ДНК был применен для клонирования PCR-усиливается фрагмент в плазмиду pCAG-EGxxFP.
    Примечание: в качестве альтернативы, соответствующее ограничение сайты могут добавляться к 5' концу праймеры PCR. Имеющиеся ограничения сайтов в векторе pCAG-EGxxFP, BamHI, NheI, PstI, Сали, EcoRI и EcoRV.
  2. Усилить геномной ДНК с дизайном грунты, используя форму и параметры ПЦР ниже. Загрузить образец (19.7 мкл H2O; 0,3 мкл 10 нг/мкл геномной ДНК мыши; 2,5 мкм мкл 10 EGxxFP-Top2b-F; 2,5 мкм мкл 10 EGxxFP-Top2b-R, 25 мкл 2 X мастер смесь ПЦР; 50 мкл общий объем) на агарозы 1% гель и гель Очистить ПЦР фрагментов с помощью геля добыча комплект. Используйте следующие реакции условий: 95 ° C 3 мин; затем 35 x циклов 98 ° C за 20 сек, 60 ° C 15 s, 72 ° C для 20 s и 72 ° C в течение 1 мин; 4 ° C, на неопределенный срок.
    Примечание: В этом эксперименте, был усилен один регион в Top2b экзона 1; Поиск последовательностей праймера в таблице 1.
  3. Дайджест pCAG-EGxxFP вектор с энзимами ограничения BamHI и EcoRI за 2 ч при 37 ° C, затем загрузить образец на агарозы 1% гель и гель очищение вектора позвоночника, используя набор гель добыча. Использование следующих реагентов (общий объем 50 мкл): плазмида X µL (3 мкг); 2 мкл BamHI; 2 мкл EcoRI; 5 мкл 10 x буфер; X µL ddH2O.
  4. Настройка реакции ДНК Ассамблеи18 согласно инструкциям производителя и превратить в DH5α сведущее Escherichia coli.
  5. Прививать две колонии, каждый в 2 мл среды фунтов при 37 ° C не менее 6 ч, выполнять мини-prep ДНК изоляции с помощью комплекта, например, от Qiagen и определить колоний с правильной вставки (в дальнейшем именуемый pCAG-EG-Top2b-FP) с использованием Сэнгер Виртуализация с EGxxFP-Top2b-F грунт.
  6. Transfect HEK293T клеток.
    1. Семя HEK293T клетки в 24-ну плиту 24 h перед transfection.
      Примечание: Клетки были культивировали в инкубаторе клеток 37 ° C с 5% CO2, в среде DMEM с глютамин добавки, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Убедитесь, что клетки являются 60% притока в день transfection. В этом эксперименте мы использовали самодельные клетки HEK293T, стабильно выражая SpCas9 для тестирования pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Однако wildtype HEK293T клетки может использоваться при условии вектора выражения SpCas9.
    2. Transfect HEK293T клетки, с помощью polyethylenimine (PEI) реагента. Transfect клетки с 120 нг/колодец pCAG-EG-Top2b-FP плазмида12 и 120 нг/колодец pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre или pU6-sgTop2b-2-Cbh-КРР в пластине 24-хорошо. Смешать плазмида ДНК и 1.8 мкл Реагента PEI в 80 мкл unsupplemented DMEM среды с глютамином дополнить и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре после vortexing.
    3. 6 ч после трансфекции, удалите среды и замените свежей среды.
    4. Контролировать наличие живых клеток GFP+ 48 ч после трансфекции с помощью микроскопа флуоресценции при 20-кратном.
      Примечание: Количество ячеек GFP+ указывает на определение эффективности sgRNA. Результаты эффективных и неэффективных sgRNAs (sgTop2b-1 и sgTop2b-2, соответственно) показано на рисунке 2А.

3. выполнить в утробе матери Электропорация

  1. Разводят 6-8-week-old мышей и подготовить инструменты для электропорации в утробе матери . Крест мужской гомозиготных Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мышей с самок мышей CD-1. Время беременности CD-1 мышей от дня Вагинальные вилка обнаружения (E0.5). Эмбрионов, electroporated в день E13.5.
    1. Тянуть боросиликатного стекла капилляров (внутренний диаметр: 0,6-0,8 мм) с микропипеткой съемник. Используйте следующие параметры: P = 500, тепло = 560, тянуть = 150, Vel = 75, время = 250. Ярлык кончик капилляра с черными чернилами для лучшей визуализации во время инъекции. Трим капиллярного конусности под стереомикроскопом, с помощью линейки и острые иглы пинцета и обрежьте кончик длиной около 6 мм.
    2. Сохранять единство капилляров держать эксперимент воспроизводимость. Создание одностороннего скошенный край во время обрезки. Наконечник должен быть столь резким, как можно легко проникновения в стенке матки и во избежание повреждения тканей эмбриона.
      Примечание: в качестве альтернативы используйте микро точильщика для регулировки угла 35°19. Капилляров может храниться при комнатной температуре в 10 см Петри возбудителя свободных условиях.
    3. Автоклав хирургических инструментов.
    4. Смесь sgRNA плазмид в равных частях с pT2K-IRES-Люк до конечной концентрации по крайней мере 1 мкг/мкл для каждого плазмиды и цвет плазмида решение с быстрым Грин (конечной концентрации 0,05%). Подготовьте раствор 1% быстро зеленый с эндотоксинов бесплатная дистиллированная вода и фильтр через 0,22 мкм фильтр для удаления частиц красителя из решения.
      Примечание: Сопредседатель transfection pT2K IRES-Люк необязательно, но позволяет выявить жизнеспособные electroporated животных после рождения с помощью томографии биолюминесценции. Пожалуйста, смотрите шаг 3.5. Подготовьте достаточное количество плазмида микс для общего числа беременных мышей, чтобы эксплуатироваться. Использовать около 15-20 мкл смесь на мышь (~ 12 эмбрионов). Немедленно приступайте к операции.
  2. Подготовьте мышей для хирургии.
    1. Анестезировать беременных мышей CD-1 с изофлюрановая. Побудить анестезии в коробку с 3-4 изофлюрановая vol-% (скорость потока кислорода: 1.5 Л/мин) и поддерживать его с 2 vol-% во время операции через носовой конус.
      Примечание: Полная хирургия не следует принимать дольше, чем 30 мин уменьшить количество вводят и electroporated эмбрионы, при необходимости. Используйте стерильные перчатки для хирургии.
    2. Поместите курсор мыши на его обратно на грелку и отрегулировать анестезии.
    3. Придать обезболивающее (Метамизол, 800 мг/кг массы, тела подкожно (с.к.), 24 h депо).
      Примечание: Вы можете использовать другие уполномоченные анальгетиков чем Метамизол.
    4. Примените Глазную мазь предотвратить сухость глаз во время операции.
    5. Fix конечностей клейкой лентой и стерилизовать живота с дезинфицирующим средством. Покрытие мыши с марлей, оставляя только хирургические области подвергаются. Распространилась на 70% спирте хирургические области и марлей.
    6. Сделать разрез кожи около 2 см в длину и аккуратно разрыв с прямо хирургические ножницы. Найдите linea alba и сделать немного меньше второй надрез через брюшину, используя ткань ножницами с тупым кончиком.
    7. Смачивать открытые брюшной полости с подогретым стерильные 1 x PBS.
    8. Тщательно извлечь рога матки из брюшной полости с помощью щипцов кольцо. Слегка потяните, захватывая стенке матки исключительно на разрыв между желтком мешки двух соседних эмбрионов. Во избежание какого-либо давления на эмбрион потянув его через разрез. Увеличить разрез, в случае необходимости и проявлять особую осторожность, чтобы расположить маточные рожки на животе пока не сжатия потока крови через маточные артерии.
      Примечание: В некоторых случаях рекомендуется извлечь один рога матки в то время, и заменить его перед второй рога матки.
  3. Инъекции и электропорации плазмидной ДНК
    1. Аспирационная примерно 15 мкл цветных плазмида-решения с подготовленной стеклянный капилляр. Избегайте любых пузырьков воздуха в ходе этого процесса.
      Примечание: Плазмида решение может засорить кончик легко если его концентрация является высоким. Протестируйте капилляра, выпустив некоторые ДНК прямо перед инъекцией.
    2. Аккуратно провести эмбриона с щипцами кольцо и найдите область шеи.
      Примечание: Если эмбрион находится в состоянии трудно внедрить, пропустить его и перейти на следующий эмбриона. Повышение статуса эмбриона может увеличить шансы ущерба для них.
    3. Медленно Пирс с кончика ранее подготовленные стеклянный капилляр в четвертый желудочек, проникая через задний спинной мозг и затем впрыскивают около 1 мкл плазмида микс. Убедитесь, что окрашенная ДНК не просочилась из мозга и виден как алмаз формы структура.
      Примечание: При необходимости, использовать 2,5 увеличительные стекла для лучшей визуализации четвертого желудочка и окружающих кровеносных сосудов. Доставить электрических импульсов сразу же после инъекции для предотвращения диффузии плазмида-решения для других желудочков.
    4. Применять электрические прямоугольных импульсов (5 импульсов, 32 МВ, 50 мс на 950 ms-off) с щипцами как Платиновый пинцетом (см. Таблицу материалы). Боков место электроды с отрицательным полюсом, охватывающих уха и положительный полюс в мозжечковой зачаток наведении на стенке матки. Используйте 5 мм в диаметре электродные пластины для эффективного электропорации E13.5 эмбрионов.
      Примечание: Увеличение выживаемости потомства, манипулируяrd менее чем 2/3 от общего количества эмбрионов за плотины. Избегайте эмбрионов слишком близко к шейке матки. Если манипулировать, они могут вызвать осложнения во время родов и поставить под угрозу весь помет. Если электроды находятся слишком близко к сердце эмбриона, это может привести к остановке сердца.
  4. Пост электропорация и послеоперационный уход
    1. Осторожно поместите маточные рожки обратно в брюшной полости и заполнить с предварительно разогретую стерильные 1 x PBS. Пусть маточные рожки слайд в естественном положении.
    2. Закрытие брюшины и кожи отдельно с простой непрерывный шов.
      Примечание: Проявлять особую осторожность, чтобы не проткнуть стенку матки, когда ушивание брюшины.
    3. Свертывание анестезии и поместите животное живот вниз в новой клетке.
    4. Мониторинг животных во время бодрствования фазы и снова 24 ч после операции. Место клетки под лампой Отопление, если дрожь не улучшится в течение 15 мин-сроки и животное не начать ухаживания.
    5. Подтвердите успешное электропорации Люцифераза изображений.
      1. Убедитесь, что эксплуатация плотин падение эмбрионов на время (на E19.5).
        Примечание: Дата рождения может быть отложено на следующий день вероятно из-за операции.
      2. Анестезировать electroporated щенков (P5-P7) с 2,5% изофлюрановая и вводить (внутрибрюшинного (и.п.)) с D-Люциферин (3 мг/кг массы тела) 5 мин до изображений.
      3. Обнаружить Люцифераза сигналов в electroporated щенков, с помощью томографа биолюминесценции.
        Примечание: Время экспозиции 1 мин является достаточной для обнаружения сигнала Люцифераза. Сияние (/sr p/s/см2) составляет приблизительно > 1 x 10-6.

4. подготовить Cryosections от Electroporated Cerebella

  1. Усыпить P7 щенков electroporated и вскрыть из мозжечка.
    Примечание: Сигнал GFP можно наблюдать с помощью epifluorescent стереоскоп.
  2. Исправить cerebella на ночь в 5 мл на мозг 4% ПФА в PBS на 4 ° C.
  3. Передача фиксированного cerebella ночь в 10 мл на мозг 30% сахарозы в ФБР при 4 ° C.
    Примечание: Ткани должен достичь нижней части 15 мл после инкубации в растворе сахарозы.
  4. После впитывая оставшийся раствор сахарозы с куском бумаги фильтр целлюлозы, погружать мозжечка оптимального раскроя температуры (OCT) в одноразовых пластиковых плесень и заморозить его на сухой лед. Криогенный блок может храниться при температуре-80 ° C до использования.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  5. Нарезать секции с 10 мкм криогенный блок толщины с помощью криостат и сохранить разделы на-80 ° C до использования.
    Примечание: Один можно подтвердить экспрессия гена GFP в разделах, после промыть OCT соединение с PBS.

5. иммуноокрашивания Cryosections

  1. Сухие слайды на технические для 30 мин и мыть дважды за 10 мин в PBS.
  2. Круг разделы с помощью жидкого блокатор пера и инкубировать в подразделах блокирования решения (10% нормальной осла сыворотки в PBS, содержащие 0,1% тритон-X100) за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Добавление первичного антитела против молекул интерес (например, GFP и топоизомеразы II beta (Top2B) в этом исследовании) в решении блокировки и инкубировать на ночь при 4 ° C.
    Примечание: Имена и концентрации антитела, которые используются, перечислены в Таблице материалов. В целях усиления сигналов GFP, антитела анти GFP может использоваться при необходимости вместе с других антител.
  4. Промойте слайды с 0.1% тритон содержащих PBST 3 X 10 мин инкубировать в разделах 1 ч при комнатной температуре конъюгированных Флюорофор вторичное антитело разводят в блокировки раствор, содержащий DAPI.
  5. Вымойте слайды в PBS 3 X 10 мин горе слайды и хранить при 4 ° C до изображений.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

6. обработка изображений и анализ

  1. Изображение на разделы, используя конфокального микроскопа при 20-кратном.
  2. Подсчитать количество положительных клеток GFP потери выражения целевого белка. Представитель изображение будет показано на рисунке 2B.
  3. Проверьте молекулярных фенотип после аблации целевых генов в ВНП и их потомков, immuostaining12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В естественных условиях функционального анализа крайне важно для определения ячеек, в которые были введены экзогенных gene(s). Хотя выражение маркера такие как GFP-пролиферирующих клеток может быть создана для длительного периода времени, сигнал последовательно теряется в пролиферирующих клеток. Иллюстрацией этого эффекта показана на рисунке 1. Чтобы обойти потерять след transfected клеток в LOF анализов, мы разработали новый подход путем объединения...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью электропорации exo внутриутробно , мы уже ранее сообщали, что на основе малых интерферирующих РНК в vivo функциональный анализ Atoh1 на ранней стадии мозжечковой гранулы ячейки дифференцировки8. Из-за малых интерферирующих РНК разрежения/деградации и воздействия эмбрионов за пределами стенке матки фенотипического анализа клеток гранул electroporated был ограничен эмбриональных стадий. Однако текущий метод включен анализ фенотипа послеродовой животных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы ценим Лаура Sieber, Анна Нойербург, Ясин Harim и Петра Шретер для оказания технической помощи. Мы также благодарим Drs. K. Райфенберг, K. Dell и P. Prückl за полезную помощь для экспериментов на животных в DKFZ; Imaging основной зал DKFZ и Carl Zeiss изображений центра в DKFZ для воображения confocal микроскопии. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft, ка 4472/1-1 (д.к.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 488 Goat anti-ChickenThermoFisherA110391:400 разведение
Alexa 568 Donkey anti-MouseLife TechnologiesA-100371:400 разведение
Alexa 594 Donkey anti-RabbitThermoFisherA212071:400 разведение
Alexa 647 Donkey anti-RabbitLife TechnologiesA315731:400 разведение
щелочное Фосфатаза (FastAP)ThermoFisherEF0654
Автоклавная лентаKisker Biotech150262
BamHI (HF)NEBR3136S
BbsI (FastDigest)ThermoFisherFD1014
Целлюлозная фильтровальная бумага (Whatman)Sigma-AldrichWHA10347525
тканьTork530378
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM800
D-Luciferinbiovision7903-1
DAPISigma-AldrichD9542разведение 1:1000
Одноразовые пластиковые формы (Tissue-Tek Cyromold)VWR4566
DMEM GlutamaxThermoFisher31966047
сыворотка ослаSigma-AldrichD9663
EcoRI (HF)NEBR3101S
Electro Square PoratorBTXECM830
Endofree Maxi KitQiagen12362
ЭтанолMerck107017
глазная мазь (Bepanthen)Bayer81552983
Fast GreenMerck104022
FBSThermoFisher10270-016
Фильтр (0.22 &; m)MerckF8148
Флуоресцентный клеточный имиджер (ZOE)Biorad1450031
Щипцы прямыеFine Science Tools91150-20
Марля (X100 ES-pads 8f 10 x 10 см)Fisher Scientific15387311
GFP антителоAbcamab139701:1000 разведение
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Стеклянный капилляр с нитью накалаNarishigeGD1-2
ГрелкаThermoLux463265 / -67
Программное обеспечение для обработки изображений (ImageJ и Fiji)Шприц NIH-Инсулин
(B. Braun OMNICAN U-100)Carl RothAKP0.1
IsofluraneZoetisTU061219
IVIS Lumina LT Series III ШтангенциркульPerkin ElmerCLS136331
Kalt Шовные иглыFine Science Tools12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY смесьKapa BiosystemsKK2601
Ki67 антителоAbcamab155801:500
разведение Световая указкаPhotonicPL3000
Блокатор жидкости РучкаKisker BiotechMKP-1
MetamizolWDT-Microgrinder
NarishigeEG-45
MicroinjectorNarishigeIM300
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
Программное обеспечение для микроскопа ZEN
шелковая шовная нить (0,12 мм)Fine Science Tools18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek)VWR4583
p27 антителоBD bioscience6102411:200 разведение
параформальдегидаRoth335,3
PBS ( 1x)Life Technologies14190169
pCAG-EGxxFPAddgene50716
ПолиэтилениминSigma-Aldrich408727
pX330 плазмидаAddgene42230
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
Набор для быстрой лигированияNEBM2200S
Кольцевые щипцыFine Science Tools11103-09
Slides (SuperFrost)ThermoFisher10417002
программное обеспечение для биостатистики (Prism 7)Программное обеспечение GraphPad,Inc-Spitacid
, EcoLab3003840
стереомикроскопNikonC-PS
СахарозаSigma-AldrichS5016
Хирургические ножницыFine Science Tools91460-11
Хирургические ножницы с тупым кончикомFine Science Tools14072-10
Шовный материал (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))SMI220340
T4 Буфер для лигирования ДНКNEBB0202S
T4 PNKNEBM0201S
Тканевые ножницы Тупой (11,5 см)Fine Science Tools14072-10
TOP2B антителоSanta Cruzsc130591:200 разведение
Трипсин (2,5 %)Пинцет ThermoFisher15090046
с 5 мм и дисковыми электродами Oslash; PlatinumXceltis GmbHCUY650P5
VaporizerDrä Герверк АГGS186
Zeiss-Нестерильная

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  2. Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391(2015).
  3. Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
  4. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  5. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
  6. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
  7. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
  8. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
  9. Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
  10. Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
  11. Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
  12. Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758(2017).
  13. Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  14. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  16. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  18. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
  19. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303(2016).
  20. Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Loss Of FunctionIn Utero ElectroporationCerebellar Granule CellsGene Transfer MethodCas9 GFP ReporterPlasmid Construct DeliveryImmunohistochemistry AnalysisFluorescent Cell ImagingCryosection PreparationBrain Tumor Modeling

Related Articles