Освещение пути к Caspase активации с помощью Bimolecular флуоресценции дополнения

Семья протеазы caspase известны за их решающую роль в апоптозе и врожденный иммунитет ¹. Из-за их важности, определения того, когда, где и как эффективно конкретных caspases активируются может обеспечить решающую понимание механизмов caspase пути активации. Изображений на основе протокола, описанные здесь позволяет визуализации первых шагов в каскад активацию caspase. Этот метод использует динамический: протеин взаимодействия, активацию caspase диск.

Caspases можно разделить на две группы: инициатор caspases (caspase-1, -2, -4, -5, 8, -9, -10 и -12) и палач caspases (каспазы-3, -6 и -7). Палач caspases присутствуют в ячейке как предварительно димеры и активируются расщепление между больших и малых субъединица ². При активации, они прилепится многочисленных структурных и регламентационных белки, что приводит к апоптозу ³. Инициатор caspases являются первым caspases активироваться в пути и как правило сработает активировать caspases палача. В отличие от caspases палача инициатор caspases активируются димеризации ^4,5. Этот димеризации способствует набору неактивных мономеров для конкретных большой молекулярный вес комплексы, известный как активации платформ. Ассамблея активации платформ регулируется ряд конкретных: протеин взаимодействия. Эти опосредовано сохраненных белков взаимодействия мотивы в proform caspase инициатор и включают смерть домен (DD), смерть эффекторных домен (DED) и caspase набора доменов (карта) ⁶ (рис. 1A). Активации платформ, как правило, включают белка рецептора и адаптер белка. Обычно, рецептор активируется при Связывание лиганда, вызывая конформационные изменения, что позволяет для олигомеризации многочисленных молекул. Рецептор затем либо новобранцев caspase непосредственно или адаптер молекулы, которые в свою очередь принести caspase комплекса. Таким образом многочисленные caspase молекулы вступают в непосредственной близости, разрешительные димеризации. Это известно как модель индуцированных близости ⁷. После димерной, caspase подвергается autoprocessing, который служит для стабилизации активной фермента ^4,8. Например Ассамблея Апоптосома Apaf1 инициируется c тситохрома после его освобождения из митохондрий в процессе, называемом митохондриальной внешней мембраны permeabilization (MOMP). Apaf1 в свою очередь новобранцев caspase-9 путем взаимодействия, при посредничестве карты присутствует в обоих белков ⁹. Аналогичный результат взаимодействия протеина в Ассамблее CD95 смерти заставить сигнальный комплекс (диск), приводит к активации caspase-8; PIDDosome, который можно активировать caspase-2; и различные Инфламмасома комплексы, которые инициировать активацию caspase-1 ^10,,1112. Таким образом инициатор caspases набираются для конкретных активации платформ общий механизм результате индуцированного близости и димеризации, без которого не произойдет активации.

Caspase Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) является на основе изображений assay который был разработан для измерения этот первый шаг в активировать caspases инициатора, позволяя прямой визуализации caspase индуцированной близости после активации платформы Ассамблеи. Этот метод использует свойства Сплит флуоресцентный белок Венеры. Венера является ярче и более фотостабилен версии желтого флуоресцирующего белка (рекламы ЯФП), которые могут быть разделены на два номера люминесцентные и слегка перекрывающихся фрагментов: N-го Венеры (Venus N или VN) и C-конечная Венеры (Venus C или VC). Эти фрагменты сохраняют способность сворачивают и стать флуоресцентные в непосредственной близости от ¹³. Каждый фрагмент Венера сливается с prodomain каспазы, который является минимальным часть caspase, который привязывает к платформе активации. Это гарантирует, что caspases не сохраняют ферментативную активность и поэтому параллельный анализ течению событий, связанных с эндогенного события можно. Венера фрагменты, сворачивают при caspase prodomains набираются для активации платформы и проходят индуцированных близости. (Рис. 1B). Результате флуоресценции Венеры может использоваться конкретно и точно контролировать субцеллюлярные локализации, кинетика и эффективности Ассамблеи инициатором caspase активации платформ в одиночных клетках. Визуализации данных могут быть приобретены confocal микроскопии или стандартные флуоресцентной микроскопии и может быть адаптирована к ряду различных микроскопии подходов, в том числе: промежуток времени визуализации для отслеживания активацию caspase в режиме реального времени; высокое разрешение изображения для точного определения субцеллюлярные локализации; и конечную точку количественная оценка эффективности активации.

Этот метод был впервые разработан для расследования активацию caspase-2¹⁴. В то время как платформы активацию caspase-2 считается PIDDosome, состоящий из рецептора Паспортный (белок p53-индуцированной с доменом смерти) и RAIDD (RIP-связанные ICH-1/CAD-3 гомологичных белок с доменом смерти), адаптер PIDDosome независимый активацию caspase-2 было сообщено. Это свидетельствует о том, что дополнительные активации платформ для caspase-2 существуют ^15,16. Несмотря не зная полного компоненты платформы активацию caspase-2, caspase БМФЦ техника позволила успешно допроса caspase-2 сигнальных путей на молекулярном уровне ^14,17. Мы также успешно адаптировать этот протокол для воспалительных caspases (caspase-1, -4 и -5 -12) ¹⁸ и в принципе, такой же подход должен быть достаточно аналогичным образом проанализировать каждый из оставшихся caspases инициатора. Этот протокол также может быть адаптирована для изучения других путей были димеризации основных активируя сигнал. К примеру стат белки активируются димеризации после фосфорилирования Janus киназа (Як) ¹⁹. Таким образом система БМФЦ может использоваться для визуализации для стат активации, а также многих других путей, регулируется динамических белковых взаимодействий. Следующий протокол предоставляет пошаговые инструкции для введения репортеров в клетки, а также методологий для захвата изображений и анализа.

1. Подготовка клеток и культуры блюда

Примечание: Выполните действия 1-3 в культуре ткани Ламинарный шкаф. Надевайте перчатки.

1. При использовании стекла дно блюда, слой стекла с фибронектин. Перейдите к шагу 1.2 при использовании пластиковых блюда.
   1. Сделайте раствор 0,1 мг/мл фибронектин: развести 1 мл раствора фибронектин 1 мг/мл в 9 мл ПБС.
   2. Покрытие стекла нижней части каждой скважины с 0,5-1 мл фибронектина и инкубировать в течение 1-5 мин при комнатной температуре.
   3. С помощью пипетки, фибронектин решение собирать и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Фибронектин раствор может быть использован несколько раз.
   4. Мойте стекло один раз с 1-2 мл 1 X PBS и аспирационная от PBS.
2. Пластина 1 х 10⁵ клеток на хорошо 6-ну плиты в 2 мл соответствующую ячейку культуры средств массовой информации (см. в таблице 1 для числа клеток для использования для различных размеров колодцев). Если используется линия клетки, которая стабильно выражает caspase БМФЦ компоненты (см. обсуждение), тарелка 2 x 10⁵ клеток и перейдите к шагу лечения (шаг 3).
3. Позволяют клеткам придерживаться блюдо на ночь при 37 ° C в инкубатор культуры ткани.

2. transfection клетки представить caspase БМФЦ компонентов

1. Transfect клетки с соответствующим трансфекции реагента.
   Примечание: Этот протокол определяет инструкции для Lipofectamine 2000, который был оптимизирован для минимальных токсичности. Этот протокол был успешно используется в клетки Hela, MCF7 клетки и клетки LN18. При использовании дополнительных реагентов трансфекции следовать инструкциям производителя и оптимизировать при необходимости.
   1. Добавьте 12 мкл Реагента трансфекции 750 мкл сокращение сыворотке СМИ в стерильную пробирку.
   2. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
   3. Добавить 10 нг репортер плазмида (плазмида кодирования флуоресцентный белок, например красный флуоресцирующий белок [запрос], который будет ярлык transfected клеток) в стерильных 1,5 мл трубку для каждой скважины, котор нужно transfected.
   4. Добавить 20 нг каждого caspase БМФЦ плазмида (например, 20 нг caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC и 20 нг C2 Pro-VN) в каждую пробирку (Таблица 2).
   5. Принесите каждой трубы до суммарный объем 100 мкл, добавив сокращение сыворотке СМИ.
   6. С помощью пипетки p200, добавьте 100 мкл раствора реагента трансфекции из шага 2.1.2 плазмида смесь прикапывают образом.
   7. Инкубируйте плазмида трансфекции реагент микс 20 мин при комнатной температуре.
   8. Аспирационная СМИ из клеток с помощью пипетки или с всасывания и затем, используя пипетку p1000, Пипетка 800 мкл сыворотки свободных средств массовой информации осторожно вниз стороне хорошо.
   9. С помощью пипетки p200, добавьте 200 мкл, комплекса ДНК липидов прикапывают в каждой скважине.
   10. Инкубируйте клетки культуры ткани инкубатора при 37 ° C 3 h.
   11. Стараясь не нарушить монослоя, удалить сыворотки свободные средства массовой информации, содержащие комплексов ДНК липидов, стремление с помощью всасывания или с пипеткой.
   12. Пипетка 2 мл подогретым (37 ° C) полный рост СМИ нежно вниз стороне каждой скважины.
2. Инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубатор культуры ткани за 24-48 ч для оптимального белков.

3. индукция активацию caspase

1. Относиться с наркотиками или стимул, который индуцирует caspase активации около 24 ч после transfection.
   1. Добавьте желаемой концентрации препарата в предварительно разогретую (37 ° C) изображений массовой (полный рост дополнена 2-меркаптоэтанол [55 мкм] и Hepes [20 мм, pH 7,2-7, 5]) и перемешать аккуратно (Таблица 3).
   2. Аспирационная СМИ из клеток с помощью пипетки или с всасывания и затем, используя пипетку, Пипетка 2 мл раствора от 3.1.1 нежно вниз стороне хорошо.
   3. Добавьте изображения СМИ без наркотиков одной скважиной как необработанных элемента управления.
2. Инкубировать клетки культуры ткани инкубатора при 37 ° C или перейдите к шаг 4.3 для покадровой эксперимента.

4. Caspase БМФЦ сбора данных

1. Caspase БМФЦ для приобретения точки один раз
   1. Включите микроскоп и флуоресцентный источник света следуя инструкциям производителя.
   2. Найти клетки под ППП фильтра и сосредоточиться на Репортер ген флуоресценции.
   3. Используя руку Талли счетчик, счетчик все ППП положительных клеток в поле зрения. Запишите номер.
   4. При сохранении же зрительного поля, перейдите на GFP фильтр (или рекламы ЯФП фильтр, если таковые имеются) и, используя руку Талли счетчик, подсчитать количество эритроцитов, которые также являются зеленый (Венера позитивных). Переключаться между двумя фильтры, чтобы убедиться, что только красные клетки, оцениваются для Венеры позитивность. Запишите номер (рис. 3).
   5. Рассчитывать по крайней мере 100 ППП положительных клеток от каждой из трех отдельных областей пластины.
   6. В каждой области вычислить процент Венеры положительных transfected клеток (то есть красные клетки, которые также являются зеленый). Средняя полученный процент чтобы получить стандартное отклонение.
2. Трехмерных изображений caspase БМФЦ
   1. Поверните на микроскопе после инструкции производителя и запуска приобретения программного обеспечения.
   2. Выделите 60 x 63 x нефти цель и поместите каплю масла на цель
   3. Место культуры блюдо на микроскопа, используя правильный пластины держателя.
   4. С помощью эпифлуоресцентного источник света и кусок глаз Микроскоп или конфокальный лазеры и на экране компьютера, перейдите к области интереса.
   5. Сосредоточиться на флуоресценции репортер, с помощью лазерного ППП или фильтр.
   6. Если эпифлуоресцентного использовался вплоть до этого момента, источник света переключиться конфокальный лазеры и визуализировать живой клетки приобретенного камеры и отображаемые на приобретение программного обеспечения на экране компьютера.
   7. С помощью джойстика управления и фокус колесо, Настройте фокус и положение клетки так, что клетки находятся в центре видоискателя. Выберите ячейки, которые отделены друг от друга и не являются перекрывающимися.
   8. Потребляемая мощность лазера процент до 50% и время воздействия на 100 мс для Венеры и ППП как отправной точки для определения оптимальных параметров для эксперимента.
   9. Включите видеосъемки и проверить получившееся изображение и сопровождающие отображения гистограммы для обоих каналов.
   10. Если сигнал низкий, и изображение будет трудно разглядеть, увеличивайте время мощности и/или воздействия лазера процент с шагом до тех пор, пока сигнал в изображении выглядит хорошо.
   11. Убедитесь, что сигнал не достигают насыщения. Проверка отображения гистограммы, чтобы убедиться, что собственный пик является видимым для каждого Флуор. Если пик охватывает весь гистограммы, ввод ниже параметров по мощности и воздействия лазера (рис. 2).
   12. Визуализируйте клетки управления (необработанных или не transfected) на тех же условиях, что обеспечивает конкретный сигнал.
       Примечание: Один цвет transfectants также может использоваться для управления кроссовер, но если сигналы являются пространственно собственный (например митохондриальной против цитозольной) это не является необходимым.
   13. Выберите или откройте модуль Z стека в Микроскоп программного обеспечения.
   14. Используя Регулятор фокуса, приблизительное положение фокуса, соответствующий центр ячейки.
   15. Отрегулируйте фокус в одном направлении, до тех пор, пока ячейка больше не виден, выберите это в качестве верхней позиции.
   16. Отрегулируйте фокус в противоположном направлении до тех пор, пока ячейка снова больше не видна и выберите это в качестве нижней позиции.
   17. Выберите оптимальный шаг размер (обычно около 20 мкм) и начать приобретение поручить камеры автоматически принять одно изображение в каждом канале, в каждом из 20 мкм шагов между верхней и нижней позиции.
   18. Используйте 3D-рендеринга программного обеспечения для воссоздания 3D изображения (Рисунок 4фильм 1).
3. Промежуток времени визуализации caspase БМФЦ
   1. По крайней мере за 1 час до эксперимента, включите микроскопом и установите температуру до 37 ° C.
   2. Выберите 40 x, 60 x или 63 x нефти цель и поместите каплю масла на цель.
   3. Место культуры блюдо на микроскопа, используя правильный пластины держателя.
   4. Если доступен источник₂ CO, место устройства доставки CO₂ (обычно оргстекла крышка прилагается к трубе, которая обеспечивает CO₂) поверх пластины держателя. Уровень CO₂ до 5% и включите контроллер₂ CO из программного обеспечения. Если не доступен источник CO₂ , включают в себя 20 мм Hepes в буфер средств массовой информации.
   5. Перейдите к полю transfected клеток и визуализировать живой клетки приобретенного камеры и отображаемые на приобретение программного обеспечения на экране компьютера, с помощью лазера ППП.
   6. Следующие шаги 4.2.8-4.2.12, введите настройки процент лазер сила и выдержка времени для ППП лазер. Держите эти значения как низкий, как можно еще будучи в состоянии обнаружить флуоресцентного сигнала.
   7. Используя положительный контроль образца (см. таблицу 3 примеры), выполните шаги 4.2.8-4.2.12 для ввода параметров процент лазер сила и выдержка времени для рекламы ЯФП лазерного света. Держите эти значения как низкий, как можно еще будучи в состоянии обнаружить сигнал Венеры.
   8. Для каждой скважины пластины выберите несколько различных позиций, которые содержат одну или несколько ячеек, выражая репортер.
   9. Введите временной интервал между каждого кадра отснятого и общее количество кадров, которые необходимо принять. Убедитесь, что есть время, чтобы приобрести все выбранные позиции, прежде чем принимать следующий кадр.
   10. Повторное посещение каждой позиции и исправить и обновить фокус при необходимости.
   11. Для коррекции фокуса дрейф, которые могут возникнуть в результате изменения температуры или внешних вибраций, включите систему коррекции дрейф фокус (если доступно).
   12. Начать промежуток времени и сохранить данные.
   13. Анализировать данные с помощью имеющихся изображений программное обеспечение (рис. 5фильм 2).

На рисунке 3показан пример caspase-2 БМФЦ индуцированных повреждений ДНК. Камптотецина, Топоизомераза I ингибитор, был использован для активации ДНК повреждения и caspase-2. MCherry красный флуоресцирующий белок использовался в качестве репортера чтобы показать, что клетки Экспресс БМФЦ зонд и помочь визуализировать общее количество клеток. Венера флуоресценции показано зеленым цветом и представляют большой puncta caspase-2 индуцированной близости. Эти клетки могут засчитываться для определения доли Венеры положительных клеток. Выводы о субцеллюлярные локализации также могут быть сделаны из таких изображений. В этом примере показано caspase-2 индуцированные близости был обнаружен в ядрышко, также как и в цитоплазме 17. Для обеспечения визуализации высокого разрешения субцеллюлярные локализации комплекс активацию caspase, единичных клеток может отражаться в трех измерениях. На рисунке 4 показаны два способа представляют такие 3D изображения. Первый заключается в создании 3D-реконструкции ячейки. В примере камптотецина индуцированной БМФЦ caspase-2 в зеленый и ядро в красный цвет. 3D реконструкция показывает относительную локализации обоих флуорофоров всей клетки. Этот тип отображения результатов является особенно эффективным, когда представил, как фильм, вращающихся ячеек вокруг одной оси (фильм 1). Вторая группа-это ортогональный вид той же клетке. Это обеспечивает xy, xzи yz визуализации ячейки в определенной точке в ячейке. Изображение результатов таким образом может быть больше подходит для презентации бумаги как в статье журнала, как это легче интерпретировать 3D данные представлены в формате 2D. На рисунке 5 показан пример покадровой съемки БМФЦ caspase-2 в линии клеток глиобластомы относились с Бортезомиб ингибитором протеасом (см. также фильм 2). График показывает увеличение средней интенсивности Венеры в клетку, в среднем через ряд клеток (адаптировано из 20). Этот тип данных может также отображаться как число следов одну ячейку на одном графике. В этом примере показано начала caspase индуцированной близости — около 2 ч, после лечения.

Рисунок 1: схема caspase структуры и методологии bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). (A) общая структура caspase инициатора. Prodomain, крупных и мелких подразделений и сохраняется QACRG мотив, который содержит активный сайт хвоща изображены. (B) БМФЦ использует Сплит флуоресцентные белки, которые самостоятельно не флуоресцентные, но можно связать реформировать флуоресцентные молекулы когда плавленый взаимодействуя белками. Для caspase БМФЦ, prodomain (Pro) или полноразмерные caspase сливается с N-терминальный половина (Венера-N) и C-терминал половины Венеры (Venus-C). В их мономерном состоянии протеины сплавливания caspase не флуоресцентные. После набора для активации платформы, такие как PIDDosome как показано здесь, Ассоциация две половинки Венеры соблюдается, представляющие caspase индуцированной близости, которая измеряется как увеличение в флуоресцировании Венеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: представитель изображение для признания насыщенность с помощью отображения гистограммы. Приведены примеры оптимальных (верхняя группа) и насыщенных сигналов (нанижней панели). Венера (желтый пик) и ППП (красный пик) сигналы отображаются. Ось x указывает интенсивность и оси y число пикселей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Caspase-2 bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) после повреждения ДНК. Клетки HELA, выражая компоненты БМФЦ caspase-2 были остается необработанной (A) с камптотецина (100 мкм) или (B) при наличии qVD-OPH (20 мкм). mCherry был совместно выразили как флуоресцентные репортер. Представитель изображения показывают ячейки (красный) с БМФЦ caspase-2 (зеленый) в камптотецина лечение клетки 16 h после лечения. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: локализация caspase-2 bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). Клетки HELA, выражая caspase-2 БМФЦ компонентов и флуоресцентные ядерной репортер относились с камптотецина (20 мкм) в присутствии qVD-OPH (20 мкм). 3D реконструкций в составе от 0,1 мкм серийный конфокальный изображений через z-плоскости клетки были сделаны после 24 ч и показать ядро в красный и caspase-2 БМФЦ зеленым цветом. Левая панель показывает реконструкция рендеринга 3D максимальная интенсивность проекции (см. также фильм 1). Правой панели отображаются ортогональных срезов той же клетке. Поле среднего (синий) в плоскости xy , поле справа (желтый) представляет собой плоскость yz , и приставка (белый) плоскости xz . Плоскости yz и xz пересекаются согласно перекрестие. Масштаб бары представляют 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: покадровый caspase bimolecular флуоресценции взаимодополняемости (БМФЦ) (A) transfected клеток глиобластомы LN18 с компонентами БМФЦ caspase-2 и флуоресцентные митохондриальной красный маркер (DsRed Мито, красный) лечили Бортезомиб (15 Нм) при наличии qVD-OPH (20 мкм). Клетки были размещены на конфокального микроскопа при 37 ° C и изображения были взяты каждые 2 мин за 8 ч. изображения представитель клеток от промежуток времени показывают, что индуцированных близость этих двух компонентов БМФЦ caspase-2 привело к увеличению в флуоресцировании Венеры ( Зеленый) с течением времени. (B) была измерена средняя интенсивность Венеры в каждой ячейке в каждый момент времени. Венера флуоресценции увеличилась с течением времени после лечения, Бортезомиб. Отдел в необработанной управления указал условия низкий или ничтожно малый токсичности от лазерного света (рисунок адаптировано из 20). Масштаб представляют 20 мкм. Ошибка бары представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) 8 (контроль) и 14 (Бортезомиб) отдельных клеток (см. также фильм 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: руководящие принципы для количества клеток к пластине. Если с использованием клеток, стабильно выражая caspase bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) компонентов, пластины двойной суммы, показанные здесь.

Таблица 2: рекомендуемые объемы реагентов, используемых для переходных transfection. Примечание: количество плазмида предложил является только отправной точкой. Если сигнал не обнаружен, рекомендуется Титруйте плазмиды от 20-200 ng за хорошо 6-ну плиты.

Таблица 3: примеры положительных элементов для caspase bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). Условия и ожидаемые результаты основаны на опубликованных данных с использованием Pro создает 14,17,18. Наряду с БМФЦ плазмид (шаг 2.1.4) следует transfected совместно выразили плазмиды

Фильм 1: 3D локализация caspase-2 bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). 3D-реконструкции, вращается вокруг y-ось конфокальный изображений через z-плоскости НеЬа клетки, выражая caspase-2-БМФЦ компоненты и флуоресцентные ядерной репортер лечили камптотецина (20 мкм) для 16 h. Фильм показывает БМФЦ caspase-2 (зеленый) и ядро (красный). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Фильм 2: покадровый caspase-2 bimolecular флуоресценции взаимодополняемости (БМФЦ). LN18 клеток глиобластомы transfected с компонентами БМФЦ caspase-2 и относились с Бортезомиб (15 Нм) были образы каждые 2 мин за 8 ч. Фильм показывает БМФЦ caspase-2 (зеленый) и митохондриях (красный). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.