Method Article

Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке

DOI:

10.3791/57318

⸱

March 28th, 2018

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Два разных 3' быстрого амплификация cDNA концы (3' гонки) протоколы описанных здесь делают использование двух разных ДНК полимеразы для сопоставления последовательности, которые включают сегмент кадр открытом чтения (ORF), стоп-кодон, и всего 3' УТР Стенограмма с помощью РНК полученные от разных рак клеточных линий.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Созревание эукариотические мРНК включает в себя 3' конца образование, которое включает в себя добавление poly(A) хвост. Для того, чтобы карта 3' конца гена, традиционным методом выбора является 3' быстрого амплификация cDNA концы (3' гонки). Протоколы для 3' гонки требуют тщательного проектирования и выбора вложенных грунтовки в течение 3' непереведенные региона (3' УТР) целевого гена интереса. Однако с несколькими изменениями протокол может использоваться для включения всего 3' УТР и последовательности в рамках открытого чтение (ORF), обеспечивая более полное представление о взаимосвязи между ОРФ и 3' УТР. Это в дополнение к идентификации сплайсингу сигнала (ССА), а также на сайте расщепления и сплайсингу, предоставляемый обычных 3' гонки. Расширенный 3' РАСЫ может обнаружить необычные 3' необычных, включая гена сплавливания в течение 3' УТР, и последовательность информация может использоваться для прогнозирования потенциальных Мирна привязки сайтов, а также AU богатые дестабилизирующих элементов, которые могут повлиять на стабильность транскрипт.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Формирование 3' конца является важнейшим шагом в мРНК созревания, который включает расщепления пре мРНК вниз по течению ПА с последующим добавлением ~ 250 untemplated adenines, которые составляют1,хвост poly(A)2. Poly(A) привязки белка (РАВР) связывается с poly(A) хвост, и это защищает мРНК Стенограмма от деградации и облегчает перевод1.

Текущие оценки показывают, что 70% генов человека несколько перевал и таким образом пройти альтернативный сплайсингу, что приводит к несколько 3' конца3. Таким образом важно определить, где хвост poly(A) придает остальной части 3' УТР, а так же определить PAS, используемые любой данной транскрипт. С появлением следующего поколения секвенирования привело к одновременной идентификации 3' необычных и перевал тысяч генов. Это увеличение возможности виртуализации требуется разработка bioinformatic алгоритмов для анализа данных, связанных с альтернативными сплайсингу 3' конца. Для обнаружения de novo или проверки системы служебной аттестации и следовательно сопоставления 3' конца отдельных генов из последовательности данных большого объема 3' гонки остается метод выбора4,5. Последовательностей, обычно включаются в cDNA продукции 3' РАСЫ включают только часть 3' УТР, содержащий poly(A) хвост, на сайте расщепления, ССА и последовательности вверх по течению ССА. В отличие от PCR, который требует разработки и использования конкретных прямого и обратного праймеров гена, 3' гонка требует только два гена конкретных вложенных вперед грунтовки. Следовательно PCR требует более детального знания нуклеотидной последовательности гена, усиленные4,6большого региона. С 3' гонка использует то же обратный грунтовка, что цели, poly(A) хвост для всех polyadenylated РНК стенограммы, только вперед грунтовки должны быть ген конкретные, таким образом, только требует знания значительно меньше региона мРНК. Это позволяет амплификацию регионов, чьи последовательности не являются полностью характеризуется4,7. Это позволило 3' гонки использоваться не только для определения 3' конца гена, но также определить и охарактеризовать крупных регионах вверх по течению ССА, которые составляют значительную часть 3' УТР. Объединив 5' гонки с модифицированных 3' раса, которая включает в себя большие части 3' УТР и фланкируя регионов, можно полностью последовательности или клонировать весь мРНК Стенограмма от 5' конца его 3' конца8.

Пример этого применения модифицированных 3' гонка является недавнее идентификация Роман CCND1-MRCK фьюжн гена Стенограмма от линии Мантия клеточная лимфома клетки и больных раком. 3' УТР состояла из последовательностей из как CCND1 , так и MRCK генов и был непокорным Мирна правила9. Два вложенных CCND1 конкретных вперед грунтовки дополняют региона непосредственно прилегающих и вниз по течению от CCND1 остановки кодон. Хотя весь транскриптом последовательности вместе с конкретными bioinformatic инструменты могут использоваться для обнаружения гена сплавливания в течение 3' УТР10, многие лаборатории могут не хватает финансовых ресурсов или bioinformatic опыт, чтобы сделать использование этой технологии. Следовательно 3' гонка является альтернативой для de novo идентификации и проверки Роман фьюжн генов, связанных с 3' УТР. Учитывая резкое увеличение числа зарегистрированных фьюжн генов, а также прочитать транскрипты, 3' гонка стала мощным инструментом в характеристике генных последовательностей11,12. Кроме того недавние исследования показали, что различные последовательности в течение 3' УТР, а также длина 3' УТР может повлиять на стенограмму стабильность мРНК, локализации, переводимости и функции13. Отчасти объясняется повышенный интерес в сопоставлении транскриптом, наблюдается увеличение числа различных ДНК-полимеразы, разрабатываются для использования в лаборатории. Важно определить, какие типы изменений можно внести 3' гонка протокола для того, чтобы использовать доступные репертуар полимераз.

Эта работа, доклады адаптации 3' гонки на карте всего 3' УТР, PAS и 3' конца расщепления сайт ANKHD1 транскрипт с помощью вложенных грунтовки в рамках секции ANKHD1 транскрипт и два разных полимераз.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Носите пальто лаборатории, перчатки и защитные очки во все времена во время выполнения всех процедур в этом протоколе. Убедитесь, что контейнеры/пробирки, содержащие фенол и гуанидина реагент Изотиоцианаты открыт только в сертифицированных капот и утилизации отходов фенола в указанный контейнер. Используйте DNAse/РНКазы свободный стерильных трубок, советы и реагенты.

1. клеточная культура

  1. Растут линии клетки HeLa и два подвеска мантии Сотовый лимфома клеточных линий, Granta-519 и Jeko-1, в среде DMEM, содержащие 10% FBS и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C. Разбавьте 1:10 клеток и рассчитывать, с помощью счетчика частиц14.
  2. Для извлечения РНК тарелка 500000 клеток/хорошо в 6 хорошо пластины (2 мл СМИ за хорошо). После инкубации в течение 24 ч Соберите РНК из клеток.

2. РНК добыча

  1. Клетки для сбора урожая
    Примечание: За исключением шаг центрифугирования, выполните все перечисленные в культуре ткани капюшоном для поддержания стерильности.
    1. Для подвески клеток (Jeko-1 и Granta-519):
      1. Передать 15 мл, клетки (совместно с 2 мл СМИ) и центрифуги в 1725 x g 5 мин аспирата СМИ и оставьте ячейку Пелле в нижней части трубки.
      2. Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл 1 x Buffered фосфатный (PBS). Добавьте 500 мкл Реагента Изотиоцианаты фенола и гуанидина монофазные каждого образца в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Хорошо перемешать и оставить при комнатной температуре (RT) за 5 мин при этом инвертирование пробки microcentrifuge каждые 1 мин.
    2. Для адэрентных клеток (HeLa):
      1. Аспирационная СМИ культуры клеток от каждой скважины. Добавьте 1 mL PBS в каждой скважине смыть мусора.
      2. Удаление PBS и добавьте 500 мкл Реагента Изотиоцианаты фенола и гуанидина монофазные каждой скважины.
      3. Инкубируйте на RT на 5 мин с плавное покачивание. Переезд в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  2. Лизис клеток
    1. Заморозить смесь клеток Изотиоцианаты фенола и гуанидина при-20 ° C для 1 h.
      Примечание: Смеси можно оставить при-20 ° C на ночь или пока он не понадобится.
    2. Оттепель фенола и гуанидина смесь Изотиоцианаты клеток на льду. Добавьте 100 мкл хлороформ microcentrifuge трубки в капюшоне ПЦР. Вихрь образца для 10-15 s до тех пор, пока смесь не розовый и непрозрачным. Проинкубируйте образцы на льду (при 4 ° C) для 15 мин.
    3. Центрифугуйте образцы для 15 мин при 20800 x g и 4 ° C. Осторожно удалите верхний бесцветный водной фазе (~ 200 мкл) и передачи в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  3. РНК осадков
    1. Добавьте равное количество изопропиловый спирт для каждого образца. 1 мкл coprecipitant (см. Таблицу материалы) для каждого образца в качестве носителя для РНК и помогают визуализировать РНК в последующих шагах. Инкубируйте образца при температуре-80 ° C для по крайней мере 4 ч. Для достижения наилучших результатов Инкубируйте на ночь-80 ° c.
    2. Передать образец охлажденной центрифуге. Центрифуги для 35 мин при 20 800 x g / 4 ° C; РНК будет отображаться как голубое пятнышко на нижней части трубки. Осторожно удалите изопропиловый спирт из образца. Добавьте 500 мкл 80% этанола и Ресуспензируйте гранулы, кратко vortexing для 3 s.
    3. Центрифуга образца на 20 800 x g на RT на 5 мин удалить все этанола из образца. Пусть пример воздушно-сухой для около 10 мин Ресуспензируйте образца в 35 мкл РНКазы свободной воды. Место на блоке тепла (65 ° C) на 5 минут, чтобы обеспечить полностью РНК в растворе и сразу же поместить трубку на льду.
    4. Определите концентрацию общего РНК с помощью спектрофотометра, как описано ранее, за исключением использования 1.5 мкл пример РНК вместо 1 мкл15. При необходимости выполните 1 мкг всего РНК на геле агарозы 1% для определения целостности РНК.

3. DNase лечение

  1. После количественного определения РНК выполните DNAse лечение всего РНК ухудшить любые геномной ДНК. Для каждого образца добавьте следующие реагенты из комплекта свободных РНКазы DNAse сделать 20 мкл общая реакция Смешайте в отдельной microcentrifuge трубки:
    1. Смешайте 2 мкл DNase 10 X буфер реакции с 4,4 мкг всего РНК. Довести до в общей сложности 14 мкл с водой.
    2. 2 мкл DNAse РНКазы бесплатно. Инкубируйте при 37 ° C за 30 минут в присутствии 2 мкл АБС битор РНКазы (от обратного транскрипции Кит).
    3. Добавьте 2 мкл стоп решения и тепла на блоке тепла для 10 мин при 70 ° C для инактивации ферментов DNAse.
      Примечание: DNAse лечение является обязательным.

4. синтез cDNA

Для окончательной реакции объем 50 мкл:

  1. Для окончательной реакции объем 50 мкл: 22 передачи мкл DNase лечение РНК к новой пробке или передачи 4 мкг всего РНК с добавлением воды до общего объема 22 мкл к новой пробке. 2 мкл T7 oligo dT25 грунт, от 10 мкм грунтовочный раствор. Последовательность для dT25 T7 oligo грунтовка 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  2. От обратного транскрипции Кит добавить 2 мкл АБС битор РНКазы (20 U/мкл), 8 мкл буфера реакции 5 x, 4 мкл дНТФ 10 мм и 2 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл).
    Примечание: Настройка реакции без обратной транскриптазы в качестве отрицательного контроля.
  3. Инкубируйте на 42 ° C в течение 1 ч. передачи прямо на льду. Тепловые трубки при 75 ° C за 5 мин и поместить трубку на льду.

5. грунтовка Поиск Транскрипт гена Fusion

  1. Конструкция праймера
    1. Скачать последовательность кДНК из ансамбля генома браузер (ENST00000360839.6/NM_017747) и определить область в пределах ORF целевой Стенограмма (ANKHD1) вверх по течению стоп-кодон. Скопировать и вставить весь регион (до 700 нуклеотидов), содержащих последовательности вверх по течению стоп-кодон в регионе запись последовательности программного обеспечения дизайн праймера (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Выберите параметр пользовательский дизайн Показать и выберите 10 количество грунтовки система должна генерировать (результаты для возврата) и оставьте все остальные параметры присвоено значение по умолчанию.
    3. Выберите пять вперед грунты и два Обратный грунты, которые не перекрываются. Заказать грунты и воссоздания РНКазы/DNAse свободной водой до конечной концентрации 10 мкм. Подробнее об общих грунтовка дизайн для ПЦР покрыты других16.
  2. ПЦР для выявления потенциальных Праймеры для использования в последующих 3' гонки
    Примечание: Чтобы определить окончательный вперед Праймеры для использования в реакции, тест разработан праймеры, создав различные сочетания прямых и обратных праймеров для регулярного ПЦР в капюшоне ПЦР.
    1. Передать свежие 0,5 мл ПЦР-пробирку cDNA (2 мкл). Добавьте 1 мкл вперед грунтовка и 1 мкл обратный праймера (от 10 мм грунтовочный раствор). Сделайте до 12,5 мкл, добавив 8.5 мкл воды, свободной от нуклеиназы. 12,5 мкл 2 x ПЦР гель Мастер микс.
    2. Используйте следующие тепловой Велоспорт условия PCR: 95 ° C в течение 2 мин, после чего 29 циклов 95 ° c за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 1 мин установлен окончательный цикл на 68 ° C за 7 мин.
    3. После ПЦР запустите продукцию на окрашенных бромидом ethidium гель агарозы 1%. Подробная информация о электрофореза как описано несколько модификаций17.
      1. Растворите 1 g агарозы в 100 мл буфера Tris-ацетат (ТЭ) в 250 мл флакон. Отварить в микроволновую печь.
      2. Оставить, чтобы охладить в течение 1 мин и 7,5 мкл раствора бромид ethidium (10 мг/мл бульона) в зонта. Смешайте хорошо закрученного колбу и вылить в горизонтальной гель аппарат. Оставьте на RT в вытяжной шкаф для по крайней мере 30 минут, чтобы позволить гель для закрепления.
      3. Покрытие гель с 1 x TAE буфера и загрузить 10 мкл продукта ПЦР на гель агарозы вместе с 3-5 мкл лестница ДНК молекулярной массой. На 175 V за 10 мин визуализировать и продуктов с использованием формирователь изображений и если необходима дальнейшая разделения продуктов, Побегите гель для еще 5-10 мин.
  3. Выбор вложенных Праймеры для 3' гонки
    1. Анализировать результаты ПЦР геля агарозы для выбора грунты, которые имеют собственный, сильный, одной группы ПЦР. Используйте 5'-большинство грунт (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') вместе с T7 oligodT25 грунт в первый PCR запуска.
    2. Выберите вложенные грунт, который расположен ниже по течению от первого праймера (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') и использовать его с праймером T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') во втором наборе реакций PCR.

6. Оптимизация 3' гонки на карте 3' УТР, с использованием двух различных ферментов

Примечание: Наблюдается увеличение разнообразия ДНК полимеразы используемые для ПЦР; Таким образом мы хотели, чтобы определить стандартные условия, которые могут применяться даже при использовании разных ферментов для 3' гонка ПЦР-реакции. Обратный Праймеры для любого Стенограмма являются неизменным; Единственные изменения находятся в вложенные вперед грунты, которые являются специфическими для целевого транскрипт.

  1. Протокол 1:3 ' гонка с использованием измененных ДНК-полимераза из Pyrococcus furiosus (ОРП)
    1. Первый PCR
      1. Передача 1 мкл cDNA в ПЦР-пробирку и 5 мкл 10 x Pfu реакции буфера. Добавьте 1 мкл первого вложенного вперед праймера, 1 мкл T7 грунтовка oligodT25 и 1 мкл дНТФ (из раствора 10 мм).
      2. Сделайте до 49 мкл общий объем, добавив 40 мкл воды. 1 мкл Pfu ДНК полимеразы и хорошо перемешать. Запустите PCR, используя профиль ПЦР в таблице 1.
    2. Второй ПЦР
      1. Передать новые ПЦР-пробирку 2 мкл продукции от первого ПЦР и смешать с 5 мкл 10 x PfuUltra II реакция буфера. Добавьте 1 мкл второй вложенных праймера PCR, 1 мкл T7 праймера и 1 мкл дНТФ (10 мм раствор).
      2. Сделайте до 49 мкл общая реакция тома путем добавления 39 мкл воды. 1 мкл Pfu ДНК полимеразы. Запустите PCR, используя один и тот же профиль PCR как первый PCR установки (Таблица 1).
  2. Протокол 2:3 ' гонка с помощью химерных ДНК-полимеразы, состоящий из домена связывания ДНК сливается с Pyrococcus-как корректура полимеразы PCR Мастер микс
    1. Первый PCR
      1. Передача 1 мкл cDNA в ПЦР-пробирку. Добавьте 1 мкл первый грунтовочный слой вложенных вперед и 1 мкл T7 oligodT25 праймера. Сделайте до 25 мкл, добавив 22 мкл воды.
      2. 25 мкл 2 x ПЦР мастер смесь и хорошо перемешать. Использование ПЦР Велоспорт условия, описанные в таблице 2.
    2. Второй ПЦР
      1. Передать 2 мкл продукции от первого ПЦР новый ПЦР-пробирку. 1 мкл второй вложенных праймера PCR вместе с 1 мкл T7 обратный праймера.
      2. Сделайте до 25 мкл, добавив 22 мкл воды. 25 мкл 2 X ПЦР Мастер микс. Запустите PCR, используя один и тот же профиль PCR как первый PCR установки (Таблица 2).

7. Проверьте второй продукт PCR 3' гонки.

  1. Принимать 5-10 мкл второй продукт PCR (а также продукт от первого раунда ГКДЗ Если стенограмма обильно выражается) и запустите на геле агарозы. Настройка гель и запустить как описано электрофореза (шаги 5.2.3.1 для 5.2.3.3). Визуализируйте результаты на формирователь изображений.

8. продукт очистки и последовательности

  1. Очищение геля продукты PCR от второй ПЦР с использованием геля и ПЦР фрагментов ДНК Clean-Up системы согласно протоколу производителя.
  2. Выполнять Сэнгер последовательности (в качестве альтернативы, отправить гель очищенная образцы продуктов ПЦР и соответствующей последовательности грунтовки в лабораторию последовательности). Анализ последовательности данных после Сэнгер последовательности.
  3. Скачать программное обеспечение анализа последовательности (см. Таблицу материалы) и импортировать файлы трассировки в программное обеспечение. Использование отдельных чистая база QVs (значения качества) для получения базы вызова информации18. Скачайте хроматограммы с высоким качеством трассировки для просмотра.
    Дополнительно: Гель очищенный продукт можно клонировать с помощью соответствующей клонирования kit и изолированные клоны, отправлены для Сэнгер последовательности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поиск вложенных вперед грунтовка:

Гель агарозы от Рисунок 1 показывает два отдельных продуктов ПЦР гель (дорожки 1 и 2), которые используют то же вперед грунтовка, но разные обратный грунтовки. Майна 3 имеет собственный продукт PCR и имеет собственный прямого и обратного грунтовка. Идеальный Праймеры для реакции PCR на основе являются те, которые дают один собственный продукт PCR (3 по...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на появление массивной параллельной последовательности технологий, на основе гена в геном, 3' гонки по-прежнему остается наиболее простой и экономичный метод для идентификации PAS и нуклеотидов, прилегающих к poly(A) хвост. Адаптация, описанные здесь расширяется с помощью 3' гонки как усиливать, так и карта последовательности, которые включают часть ORF, стоп-кодон и всего 3' УТР Стенограмма мРНК ANKHD1 . Основным преимуществом 3' гонка является, что с несколько незначительных адаптации, можно клонирова...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы признать Bettine Gibbs за ее техническую помощь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HeLa клеткиATCCCCL-2Клеточная линия рака шейки матки.
Jeko-1 клеткиATCCCRL-3006Клеточная линия мантийноклеточной лимфомы.
Granta-519 клеткиDSMZACC-342Клеточная линия мантийноклеточной лимфомы.
Фетальная бычья сывороткаSigma AldrichF6178Фетальная бычья сыворотка для клеточной культуры.
Пенициллин/стрептомицинThermoFisherScientific15140122антибиотик и антимикотик.
ГликоБлюАмбионAM9545Сопреципитант.
марки DMEMThermoFisherScientific10569044Gibco с GlutaMAX.
Нуклеаза Free-WaterThermoFisherScientificAM9938Ambion DNаза и РНКаза свободная вода (не обработана DEPC).
Дульбекко s Фосфатно-буферный растворCorning21-0301X PBS.
ХлороформСигма  AldrichC7559-5VL
2-пропанолSigma AldrichI9516
Реагент СпиртSigma Aldrich793175раствор этанола
бромида этидииSigma AldrichE1510
TRIzolРеактив ThermoFisherScientific15596026Монофазный фенол и реагент гуанидинизотиоцианат.
2X Extender PCR-to-Gel Master MixAmrescoN8672X PCR-to-Gel Master Mix  содержащий загружающий краситель, используемый в рутинных быстрых ПЦР-анализах и поиске праймеров.
10mM dNTPAmrescoN557
RQ1 РНКаза ДНКазаPromegaM6101Dnase набор для лечения.
Гелевый краситель оранжевый (6X)New England BioLabsB7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с HF буферомThermoFisherScientificF531S2X PCR MasterMix, содержащий химерную ДНК-полимеразу, состоящую из связывающего домена ДНК, слитого с пирококкоподобной корректурной полимеразой и другими реагентами.
PfuUltra II Fusion HS ДНК-полимеразаAgilent Technologies600670Модифицированная ДНК-полимераза из Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Набор для обратной транскрипцииThermo FischerK1691Используется для  обратной транскрипции мРНК в  синтез кДНК. В комплект входит  Ингибитор риболок РНКазы, обратная транскриптаза RevertAid M-MuLV и другие реагенты, перечисленные в рукописи.
Размер пефекта 1Kb лестница5 Prime2500360Молекулярная масса ДНК лестница.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage IIIAlpha InnotechИспользуется для визуализации окрашенного агарозного геля бромида этидия.
Низкомолекулярная лестницаEngland BioLabsN3233LЛестница молекулярной ДНК.
Вихревой смесительMidSciVM-3200
Мини центрифугаMidSciC1008-R
Сухая ваннаMidSciDB-D1
NanoDrop 2000CThermoFisherScientificND-2000CСпектрофотометр.
Широкие мини-подлодки; Система горизонтального электрофорезаBioRad1704469Электрофорез Аппаратура-аппарат для настройки геля
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050Блок питания для гелевого электрофореза.
AgaroseDot ScientificAGLE-500
Мастерамплифик ГрадиентЭппендорф950000015ПЦР термоамплификатор.
ЦентрифугаEppendorf5810 R
ЦентрифугаEppendorf5430R
Wizard SV Система очистки ДНК гелем и фрагментами ПЦРPromegaA9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, с One Shot  ТОП10 химически компетентных клеток кишечной палочкиThermoFisherScientificK280020
Станция подготовки MyPCR MystaireMidSciMY-PCR24Hood, предназначенная для работы с ПЦР.
Вытяжной шкаф Hamilton SafeAire IIThermoFisherScientificВытяжной шкаф.
Beckman Coulter Z1  Частицы  СчетчикBeckman Coulter6605698счетчик частиц. Для подсчета ячеек перед нанесением покрытия  для экстракции РНК.
Прикладные биосистемы Программное обеспечение для сканирования последовательностей v2.0Прикладные биосистемы (через ThermoFisherScientific)Программное обеспечение для анализа данных секвенирования по Сэнгеру.
Среды для культивирования клеток New

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284(2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Prime RACEMappingPolyadenylation SignalNested PrimersOpen Reading FrameThree Prime UTRCancer DiagnosisGene Fusion DetectionRNA IsolationPCR Amplification

Related Articles