Method Article

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы покажем процесс создания строки данио рерио репортер сотовой электрического напряжения для визуализации эмбриональное развитие, движение, и рыбы опухолевых клеток в естественных условиях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шапкой, эндогенного электрической сигнализации при посредничестве ионных каналов и насосы расположены на клеточной мембраны, играет важную роль в сигнализации процессов возбудимых нейронов и мышечных клеток и многие другие биологические процессы, такие как эмбриональные развития кучность. Однако существует необходимость в естественных условиях мониторинг электрической активности в позвоночных эмбриогенеза. Достижения генетически закодированный напряжение люминесцентных индикаторов (Гевиш) сделали возможным предоставить решение для этой проблемы. Здесь мы опишем, как для создания трансгенных напряжения Индикатор данио рерио, используя установленные напряжения Индикатор, ASAP1 (ускорения датчик потенциалы действия 1), в качестве примера. Комплект Tol2 и вездесущие данио рерио промоутер, ubi, были выбраны в этом исследовании. Мы также объяснить процессы шлюза сайта клонирования, Tol2 на основе transposon данио рерио трансгенез и процесс обработки изображений для ранней стадии рыбы эмбрионов и рыбы опухоли с помощью регулярных epifluorescent микроскопы. С помощью этой линии рыб, мы обнаружили, что есть изменения клеточного электрического напряжения во время эмбриогенеза у рыбок данио и движение личинок рыб. Кроме того было отмечено, что в несколько данио рерио злокачественные периферических нервов оболочки опухоли, опухоль, которую клетки были обычно поляризованных по сравнению с окружающих нормальных тканей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шапкой относится к эндогенной электрической сигнализации при посредничестве ионных каналов и насосы расположены на клеточной мембраны1. Ионный обмен через клеточную мембрану и спаренных электрические потенциальных и текущих изменений, необходимы для сигнализации процессов возбудимых нейронов и мышечных клеток. Кроме того шапкой и градиентов ионов имеют целый ряд других важных биологических функций, включая хранение энергии, биосинтез и метаболит транспорт. Биоэлектрических сигналов был также обнаружен как регулятор формирования эмбриональных шаблон, например осей тела, клеточного цикла и дифференциации клеток1. Таким образом крайне важно для понимания многих врожденных заболеваний человека, которые в результате неправильного регулирования этого типа сигнализации. Хотя фиксации широко используется для записи одной клетки, это еще далеко не идеально подходит для одновременного контроля за несколько ячеек во время эмбрионального развития в естественных условиях. Кроме того чувствительных малые молекулы напряжения также не идеально подходит для приложений в естественных условиях из-за их особенностей, чувствительности и токсичность.

Создание целого ряда генетически кодировке напряжение люминесцентных индикаторов (Гевиш) предлагает новый механизм для преодоления этой проблемы и позволяет легко приложения для изучения эмбрионального развития, даже несмотря на то, что они были первоначально предназначены для мониторинга нейронных клетки2,3. Один из имеющихся в настоящее время Гевиш является ускоренное датчик потенциалы действия 1 (ASAP1)4. Он состоит из внеклеточная петля напряжения зондирования домена напряжения чувствительные фосфатазы и циркулярно перестановкой Зеленый флуоресцирующий белок. Таким образом, ASAP1 позволяет визуализировать сотовых электрическая потенциальных изменений (поляризации: ярко-зеленый цвет; деполяризации: темно-зеленый). ASAP1 имеет 2 мс вкл и Выкл кинетики и можно отслеживать подпорогового потенциальных изменений4. Таким образом этот генетический инструмент позволяет на новый уровень эффективности в биоэлектрические мониторинг в реальном времени в живых клетках. Углублению понимания роли шапкой в эмбриональном развитии и многих заболеваний человека, таких как рак, будет проливают новый свет на основных механизмов, который имеет решающее значение для профилактики и лечения заболеваний.

Данио рерио доказали мощный животных модель для изучения биологии развития и человеческих заболеваний, включая рак5,6. Они разделяют 70% orthologous генов с людьми, и они имеют аналогичные позвоночных биологии7. Данио рерио обеспечивают сравнительно легко ухаживать, большой сцепление размера яйца, шансов справиться с возникающими генетики, легко трансгенез и прозрачные внешние эмбрионального развития, которые делают их улучшенные системы в vivo изображений5,6. С большим источником мутант рыбы линии уже присутствует и полностью виртуализированного генома данио рерио обеспечит относительно неограниченный спектр научных открытий.

Расследовать в естественных условиях в реальном времени электрической активности клеток, мы воспользоваться zebrafish модель системы и ASAP1. В этом документе мы описывают как включить биосенсор флуоресцентные напряжения ASAP1 в геноме данио рерио, с помощью Tol2 transposon трансгенез и визуализировать сотовой электрической активности во время эмбрионального развития, Движение личинок рыбы и в живых опухолевых .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио размещаются в объекте животных АААЛЖ одобрил, и все эксперименты были проведены согласно протоколов, одобренных Purdue животное уход и использование Комитета (PACUC).

1. Tol2 Transposon плазмидные конструкции подготовка

Примечание: Tol2, transposon, которая была обнаружена в оризии рыбы, широко использовался в данио рерио исследований сообщества8,9. Он успешно принят к участкам на основе рекомбинации клонирования системы шлюза и известен как Tol2 комплект10. Tol2 комплект обеспечивает более удобный способ создания конструкции пользовательское выражение, а также повышения эффективности трансгенез. Таким образом это было непростое решение воспользоваться этой системы, и создания вездесущие ASAP1 выражение данио рерио линии с использованием проверенных убиквитин промоутер водить ASAP111.

  1. Создание конструкцию среднего запись ASAP1: pDONR221-ASAP1
    1. Приобрести генетически закодированный напряжения датчика ASAP1 конструкции, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (плазмида #52519), от Addgene. Для того чтобы усилить кодирования региона ASAP1, создан ПЦР с помощью заказной грунтовки (attB1-ASAP1F и attB2-ASAP1R) с attB последовательностей в конце 5' праймеров (рис. 1). Phusion ДНК-полимеразы был выбран для его высокой эффективности, и условия PCR были оптимизированы, основанный на ранее опубликованные протокол12.
    2. Загрузить продукты PCR 50 мкл в 1%, TAE гель с помощью регулярных пипетки с 200 мкл советы и провести электрофорез на 160 V в бак горизонтального гель для около 30 мин.
    3. Проверить под transilluminator УФ гель (353 Нм), акцизы, нужный диапазон с помощью лезвия/скальпеля под УФ transilluminator как ранее опубликованные13,14и положил содержащие гель образца ДНК в microcentrifuge чистой 1,5 мл трубка.
    4. Выполните очищение геля для продуктов ПЦР ASAP1. Восстановить ДНК в подакцизным гель с использованием коммерческих ДНК гель очистки комплект инструкций производителя, а элюировать ДНК в 20 мкл воды. Возьмите 1 мкл пример и измерения концентрации ДНК с помощью спектрофотометра. Поток с использованием воды как пустой элемент управления15инструкции программного обеспечения.
    5. Взять 100 нг очищенный продукт PCR и смешать с 150 нг pDONR221 плазмид в 10 мкл TE буфера (10 мм трис, 1 мм ЭДТА рН 8,0)16. 2 мкл BP Clonase II в реакцию и инкубировать и реакции на ночь при комнатной температуре.
    6. На второй день 1 мкл протеиназы K в реакцию и инкубировать реакции при 37 ° C за 30 мин.
    7. Выполните преобразование. Передача реакции и смешайте его с 50 мкл Top10 сведущее Escherichia coli клетки и инкубации клеток на льду за 30 мин. Затем, передачи реакции трубку в ванну воды 42 ° C за 1 мин немедленно снять трубку и инкубировать на льду на 2 мин. Затем положите трубку в шейкере 37 ° C и проинкубируйте 1 ч.
    8. Вынуть трубку и плиты клетки на тарелку канамицин фунтов. Далее Инкубируйте пластину на ночь (16-18 ч) при температуре 37 ° C.
    9. Выбрать один и хорошо разделенных колоний и прививать им в 14 мл клетки культуры пробирки с 3 мл среды фунтов. Культура их на ночь при 37 ° C в шейкере со скоростью вращения 250/мин (вращения в минуту).
    10. Выполняйте с использованием коммерческих алкалический комплекта после его инструкция ручной17алкалический.
    11. Последовательность 3-4 плазмид с Сэнгер последовательности для выявления положительных pDONR221-ASAP1 клонов, используя M13F и M13R грунты последовательности.
  2. Создание Tol2 конструкции для микроинъекции: pDestTol2 -ubi-ASAP1
    1. Выберите последовательность проверки клон pDONR221-ASAP1 и меру его концентрации ДНК с помощью спектрофотометра следующее программное обеспечение инструкции с использованием воды как пустой управления15.
    2. Взять 100 мкг pDONR221-ASAP1 и смешайте его с 100 мкг Tol2 комплект 5-конец плазмида (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 мкг p3E-поля (Tol2 комплект #302) и 150 мкг pDestTol2pA2 (Tol2 комплект #394). Настроить общий объем до 8 мкл с использованием TE буфера (10 мм трис, 1 мм ЭДТА, рН 8.0) в 1,5 мл microcentrifuge трубки и смешайте хорошо краткое вихрь 2-5 s. Затем 2 мкл LR Clonase II плюс, и инкубировать и реакции на ночь при комнатной температуре.
    3. На второй день 1 мкл протеиназы K в реакцию с помощью пипетки 10 мкл и инкубировать реакции при 37 ° C за 30 мин.
    4. Выполнить преобразование и выявить позитивные клоны, как описано выше (1.1.7-11 меры).
    5. Измерение концентрации ДНК последовательности проверки pDestTol2-ubi-ASAP1 клон (рис. 1B) с помощью спектрофотометра15. Обычно концентрация составляет около 200ng/мкл.

2. Подготовка Tol2 Транспозаза мРНК и инъекционного раствора

  1. Полоска E. coli глицерин запас плазмида pCS2FA-Транспозаза (комплект #396 Tol2) на плиту LB (с 100 мкг/мл ампициллин) с помощью цикла стерилизации прививка. Инкубируйте пластины при 37 ° C в инкубаторе на ночь. На следующий день, выбрать один колонии и прививать его в 3 мл фунтов (ампициллин 100 мкг/мл) с помощью кончика пипетки стерилизовать 10 мкл. Культура на ночь при 37 ° C в шейкере со скоростью вращения 250 об/мин.
  2. Выполните алкалический культуры E. coli , с использованием коммерческих алкалический комплекта после его Инструкция по эксплуатации. Элюировать ДНК плазмиды в 30-50 мкл буфера TE на 1-ой минуте центрифуги на 14 000 об/мин и измерение его концентрации ДНК с спектрофотометром.
  3. Линеаризации 1-2 мкг плазмида с я не эндонуклеазы и очистить ДНК с ДНК, после я не его Инструкция по эксплуатации комплекта для чистки пищеварение. Элюировать ДНК в 5 мкл воды центрифугированием на 14 000 об/мин за 1 минуту. Ожидаемые концентрации — о 200-300 нг/мкл.
  4. Выполнять в vitro транскрипция с не я линеаризованных pCS2FA-Транспозаза как шаблон ДНК с помощью коммерческого SP6 транскрипции Кит.
  5. По окончании реакции очищайте Tol2 Транспозаза мРНК, с использованием коммерческих Очистка РНК комплект следуя инструкциям производителя. Наконец элюировать мРНК в 20 мкл RNAase свободной воды и измерить РНК концентрации в спектрофотометре. Ожидаемые концентрации идет о 1-3 мкг / мкл. образцы можно хранить в морозильной камере-80 ° C при необходимости.
  6. Подготовить микроинъекции решение путем смешивания 20 нг/мкл pDestTol2 -ubi-ASAP1 и Tol2 Транспозаза мРНК (100 нг/мкл) в пробки microcentrifuge, закупорить. Для предотвращения деградации нуклеиновых кислот, вызванные неоднократные оттаивания и снега, аликвота 6 мкл в трубку и хранить его в холодильнике-80 ° C для использования в будущем.

3. микроинъекции

  1. Настройка 4-6 разведения танки с по крайней мере 2 кобеля и 2 суки днем перед инъекцией. Эти рыбы не должны подаваться в послеобеденное время. Этот шаг будет уменьшить количество рыбных отходов и сэкономить время, чтобы очистить их на следующее утро, а также помогает стимулировать разведение ответ.
  2. Следующим утром, удалить подготовленные инъекционного раствора (pDestTol2 -ubi-ASAP1 конструкцию и Tol2 мРНК) из морозильной камеры-80 ° C и поместите его на льду.
  3. Вытяните разделителей в рыбоводстве танков и позволяют рыбы к спариванию. В общем рыбы откладывают яйца в течение 20-30 минут после потянув делителя. Если нет, подождите 1-2 часа дольше. Некоторые рыбы могут вообще не откладывают свои яйца. В этом случае повторите этот эксперимент для рыбы эмбриона коллекции.
  4. Во время ожидания, убедитесь, что есть иглы, подготовленных с наконечником, сломанной углом, создавая скошенный край с щипцами или нарушая на деликатную задачу стеклоочистителя.
    1. Тяните иглы от капиллярной стекла микропипеткой съемник, используя следующие параметры: тепло 545; Вытяните 60; скорость 80; время 250; давление 500. Сломать иглу с щипцами под областью диссекции (с правителем глаз кусок для оценки диаметра), удерживая щипцы под углом примерно 45 °. Желаемый иглы диаметром может быть переменной, в зависимости от параметра microinjector, но меньшего диаметра является предпочтительным для снижения смертности эмбрионов.
  5. Как только рыба положили яйца, собрать их в 10 см в диаметре Петри и довести их до области рассечение. Удалите все ненормальные эмбрионов и рыбных отходов.
  6. Накапайте оплодотворенных эмбрионов в подготовленный 3% агарозном инъекции плесень. Удалите излишки воды, чтобы помочь сохранить эмбрионы на месте.
  7. После того, как все строки будут заполнены с жизнеспособных эмбрионов, организовать их так, что отдельные ячейки все сталкиваются же сторону иглу, которая находится под углом около 45° по горизонтали. Это облегчит инъекции гораздо позже.
  8. Надев перчатки, используйте пипетки 20 мкл загрузки отзыв и удаление 5 мкл подготовленные конструкции из трубки на льду.
  9. Осторожно введите наконечник в задней части сломанной капиллярной трубки вплоть до где он начинает Таппер, чтобы получить как можно ближе к оконечности реагент. Если есть еще пузырьков воздуха, встряхните иглы, убедившись в том, чтобы не нарушать кончик.
  10. Вставьте иглу прямо в микроинъекции иглодержатель и тщательно затяните до тех пор, пока игла остается на месте. Отрегулируйте угол около 45 °.
  11. После того, как иглы подготовлен и придает, включите микроскоп и газа давление бака. Коммерческие CO2 танков вообще хороши для этой цели. Объем впрыска регулируется проведение и выброса давление: приблизительно 0.5 psi для проведения и 30 psi для отстрела. Будьте уверены проверить, что решение выходит при нажатии на педаль.
  12. С помощью микрометра стадии с капелькой минерального масла, регулировать громкость и потока раствора до ~ 150 мкм в диаметре (около 2 nL). Убедитесь, что обратное давление будет пусть небольшое количество капать из иглы. Если не достаточно противодавление, капиллярных действий приведет к жидкости для ввода иглы и уничтожить мРНК.
  13. После того, как иглы откалиброван, Начните впрыскивать конструкцию в одну ячейку оплодотворенных эмбрионов.
    Примечание: Это занимает большой объем практики, терпение и утонченность, благодаря клеточной мембраны, будучи жестких проткнуть. Важно придать решение в клетку, не желток, для создания трансгенных данио рерио. Это отличается от Морфолино инъекций. Не имеет значения, какой стороне игла попадает в камеру, пока конструкция идет в ячейке. Трансгенез будет иметь очень низкий уровень успеха, если вводится в желтке вместо ячейки. Стадии одноклеточных инъекции также имеет важное значение, или соматические Химера рыбы будут создаваться. Это уменьшит вероятность трансген, вдаваясь в зародышевых клеток.
  14. Используйте край гель вырез для обеспечения поддержки, который держит эмбриона на месте и позволяет иглой, чтобы применить давление без перемещения эмбриона. После того, как кончик иглы находится в одной ячейке, нажмите на педаль, чтобы освободить нужное количество раствора. Повторите этот процесс для всех эмбрионов.
  15. После завершения передачи эмбрионы вводят в обозначенные блюдо, промыв их из агарозы паз рыбы системы водой с одноразовой 3,4 мл передачи пипетки. Хранение эмбрионов в 28,5 ° C инкубатор, чтобы позволить им развивать. Проверить обратно на протяжении дня, удаляя мертвые рыбы эмбрионов и заменить воду с метиленовым синим 0.1% в воде рыбы.
  16. Около 6-8 часов после инъекции, принять 10 индивидуальные вводят рыба эмбрионов и подготовить геномной ДНК от них с помощью метода отчаянный18.
  17. Следующим утром, используйте рассечение микроскоп с источником света флуоресцирования разобраться эмбрионов, показаны GFP в тканях не желток. Эти рыбы эмбрионов должна содержать вводят конструкции.
  18. Выполните Tol2 акцизных пробирного проверить действие transposon, как описано ранее,19. Если подакцизным плазмиды могут быть обнаружены, держать вводят рыбы эмбрионов и поднять их. Если не подакцизным плазмиды могут быть обнаружены, повторите процесс синтеза и микроинъекции мРНК Tol2 до достижения позитивных результатов анализа акцизных Tol2.

4. Создание трансгенных ASAP1 рыбы, Tg (ubi: ASAP1)

  1. Поднимите вводят рыбы (поколения0 F) к взрослой жизни, как описано ранее в данио рерио книга20. Обычно это занимает около 4 месяцев.
  2. Возьмите один взрослый F0 рыба и крест с одиночным напротив пола wildtype рыбы. Соберите рыбу эмбрионов после разведения позже в тот же день. Держите собраны рыбы эмбрионов в инкубаторе 28,5 ° C в рыбе воды с 0,1% метиленовым синим.
  3. На третий день проверьте эмбрионов рыб под микроскопом флуоресцентные диссекции с фильтром GFP. Разобраться рыбу зеленый эмбрионов, если таковые имеются и поднять их до совершеннолетия как F1 поколения трансгенной рыбы, Tg (ubi: ASAP1).
    Примечание: Менделевское соотношение не ожидается, так как большинство родителей рыбы0 F зародышевой линии генетических химер.
  4. Крест один1 F взрослых рыб с wildtype рыбой и собирать рыбу эмбрионов. Сортировать рыбу зеленый эмбрионов и поднять их до совершеннолетия как F2 поколения рыб.
    Примечание: Зеленый и эмбрионов-зеленый рыбы должно быть близко к 1:1 Если существует один трансген.
  5. Для просмотра электрические потенциальные изменения в опухоли как злокачественные периферических нервов оболочки опухоли (MPNST), крест2 поколения F Tg (ubi: ASAP1) рыба с рыбой rpl35hi258/Вт . Известно, что видимые опухоли начинают быть найдены в 6-8 месяцев старых взрослых21,22.

5. Визуализация

  1. Для изображения zebrafish эмбриона, взять несколько F2 поколения основателя рыбы и пересекать их с wildtype рыбой в отдельных пар. Соберите рыбу эмбрионов на разных стадиях желаемого развития согласно данио рерио, постановка руководство23.
  2. На ранних стадиях эмбрионов рыб очистить и удалить chorions эмбрионы, тщательно используя пару щипцы под областью рассечение диаметром 10 см Петри блюдо с рыбой воды системы.
  3. Передача нескольких эмбрионов рыб на слайд кривыми стекла с 3% метилцеллюлоза, с помощью пипетки одноразовой передачи 3,4 мл. Отрегулируйте эмбрионов в желаемой позиции для просмотра клеточной активности GFP с помощью иглы под областью флуоресцентные рассечение.
  4. Для движущихся этапов рыбы эмбрионов (старше 12 Сомит стадии), используйте tricaine мезилата 0,05% чтобы анестезировать рыбы эмбрионов до их перевода в слайды. Вкратце рыба эмбрионы были объединены в tricaine мезилата 0,05% в воде рыбы до тех пор, пока они остановились, плавание и потери равновесия тела. Кроме того добавьте каплю tricaine мезилата 0,05% с метилцеллюлоза на слайде.
  5. Для менее чем 12 Сомит стадии рыбы эмбрионов используйте epi флуоресценции составной микроскоп с совместимые камеры и программное обеспечение для обработки изображений. Для старше 12 Сомит стадии рыбы эмбрионов используйте микроскопом рассечение флуоресценции.
  6. Для изображения опухолевых клеток напряжения, сначала определить рыба с MPNST опухолями. Затем анестезировать рыба с tricaine мезилата 0,05%. Для отображения всей горе, Положите рыбу в Петри диаметром 10 см. Чтобы просмотреть электрической активности клеток опухоли, рыб опухолей может расчлененный после всей горе изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В успешных инъекции, больше, чем эмбрионы вводят 50% рыбы будет отображать определенную степень зеленый флуоресценции в соматических клетках, и большинство из них будет положительным, Tol2 transposon акцизных пробирного (рис. 2). После 2-4 поколения исходящей крест с wildtype рыбы (до 50%, коэффициент ожидаемой Менделевское) флуоресцентных рыб, трансгенной рыбы были использованы для визуализации эксперимента для отслеживания клеточной мембраны потенциалов во ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя клеточные и тканевые деятельности на уровне электрические во время эмбрионального развития и болезней человека были обнаружены долгое время назад, в естественных условиях динамические электрические изменения и их биологической роли по-прежнему во многом неизвестным. Одна из основных задач является для визуализации и количественно электрические изменения. Технология зажима патч прорыв для отслеживания единичных клеток, но его применение к позвоночных эмбрионы ограничено, потому что они состоят из многих клет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Научно-исследовательская работа в этой публикации было поддержано, Национальный институт Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под награду номер R35GM124913, PI4D университет Purdue программы стимулирования и PVM внутренней конкуренции Программа фондов фундаментальных исследований. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения финансирования агентов. Мы благодарим Коити Kawakami для Tol2 конструкции, Майкл Лин для ASAP1 конструкции, и Леонард Zon для ubi промоутер построить через Addgene.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 мл пробирки для клеточных культурVWR60818-725Культура E.Coli
Резервуар для электрофореза AgaroseOwl B2DNA eletrophoresis
Agarose RAAmrescoN605-500GДля изготовления гелей для инъекций
Attb1-ASAP1-F PrimerIDT DNAGGGGACAAGTGTACAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		ASAP1 амплификация кодирующего участка для субклонирования
Attb2-ASAP1-R праймерIDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTGTCTCTCTGTGAAGCCA		ASAP1 амплификация кодирующего участка для субклонирования
Прицел для рассечения светлого поляNikonSMZ 745Дехорионация, микроинъекция, крепление
Цветная камераZeissAxioCam MRcЭмбрион рыбы Запись изображений
Вогнутое предметное стеклоVWR48336-001Для удержания эмбрионов рыб в процессе визуализации
Одноразовая пипетка для переноса 3,4 млThermo Scientific13-711-9AMЭмбрионы рыб и перенос воды
Эндонуклеазный фермент, не INEBR0189LДля линеаризации плазмидной ДНК
Эпифуоресцентный составной эндоскопZeissAxio Imager.A2Рыбы Визуализация эмбрионов
Эпифуоресцентный стерео дисксекционный эндоскопZeissStereo Discovery.V12Визуализация эмбрионов рыбы
Люменный источниксветадинамика X-cite seris 120Источник света для флуоресцентных микроскопов
Щипцы #5WPI500342Дехорионация и разрушение игл
Gateway BP Clonase II Ферментная смесьThermo Scientific11789020Gateway BP рекомбинационное клонирование
Gateway LR Clonase II Plus ферментThermo Scientific12538120Gateway LR рекомбинационное клонирование
Гель DNA Recovery KitZymo ResearchD4002ДНК очистка гелем
Загрузочный наконечникEppendorf930001007Для загрузки инъекционного раствора в капиллярные иглы
Метилцеллюлоза (1600cPs)Alfa Aesar43146Крепление для эмбрионов рыб
Метиленовый синийSigma-AldrichM9140Подавляет грибковые вспышки в чашках Петри
Пресс-форма для микроинъекцийАдаптивные научные инструментыTU-1Для подготовки лотка для пресс-формы для удержания эмбрионов рыб во время впрыска
МикроинъекторWPIПневматический пиконасос PV820Микроинжектор
МикроманипуляторWPIМикроинъектор MM3301RМикроинъекционный
пуллер МикропипеткаИнструмент SutterP-1000Для приготовления капиллярной иглы
Минеральное маслоAmrescoJ217-500млДля калибровки объема инъекций
mMESSAGE mMACHINE SP6 Набор для транскрипцииThermo ScientificAM1340мРНК in vitro Транскрипция
моноцветной камерыZeissAxioCam MRmЗапись изображений эмбрионов рыб
Набор для миниподготовки плазмидZymo ResearchD4020Подготовка небольшого количества плазмидной ДНК
Пластиковые чашки ПетриVWR25384-088Для удержания рыб или эмбрионов рыб во время процесса визуализации
РНК Clean & Концентратор-5Zymo ResearchR1015очистка мРНК после транскрипции in vitro
СпектрофотометрThermo ScientificNanoDrop 2000Для измерения концентраций ДНК и РНК
Stage MicrometerAm ScopeMR100Калибровка объема микроинъекций
ТермоамплификаторBio-RadT100Амплификация ДНК для клонирования генов
Тонкостенные стеклянные капиллярыWPITW100F-4Необработанное стекло для изготовления каппиллярной иглы
Tol2-exL1 праймерIDT ДНКGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 акцизный анализ
Tol2-exR праймерIDT ДНКACCCTCACTAAAGGGAAAAAGTol2 акцизный анализ
TOP10 Химически грамотный E. coliThermo ScientificC404006Используется для трансформации при клонировании генов
Трикаин мезилатSigma-AldrichA5040Для обезболивания рыб или рыбьих эмбрионов
УФ-транс-иллюминатор 302 нмUVPM-20VВизуализация ДНК
Водяная баняThermo Scientific2853Для процесса трансформации клонирования генов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
  3. Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
  4. St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
  5. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  6. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  7. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
  8. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  9. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  13. Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
  14. Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  18. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
  19. Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
  20. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
  21. Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139(2004).
  22. Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
  23. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  24. Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).
  25. Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
  26. Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).
  27. Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  28. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
  29. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  30. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles