Method Article

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы покажем процесс создания строки данио рерио репортер сотовой электрического напряжения для визуализации эмбриональное развитие, движение, и рыбы опухолевых клеток в естественных условиях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шапкой, эндогенного электрической сигнализации при посредничестве ионных каналов и насосы расположены на клеточной мембраны, играет важную роль в сигнализации процессов возбудимых нейронов и мышечных клеток и многие другие биологические процессы, такие как эмбриональные развития кучность. Однако существует необходимость в естественных условиях мониторинг электрической активности в позвоночных эмбриогенеза. Достижения генетически закодированный напряжение люминесцентных индикаторов (Гевиш) сделали возможным предоставить решение для этой проблемы. Здесь мы опишем, как для создания трансгенных напряжения Индикатор данио рерио, используя установленные напряжения Индикатор, ASAP1 (ускорения датчик потенциалы действия 1), в качестве примера. Комплект Tol2 и вездесущие данио рерио промоутер, ubi, были выбраны в этом исследовании. Мы также объяснить процессы шлюза сайта клонирования, Tol2 на основе transposon данио рерио трансгенез и процесс обработки изображений для ранней стадии рыбы эмбрионов и рыбы опухоли с помощью регулярных epifluorescent микроскопы. С помощью этой линии рыб, мы обнаружили, что есть изменения клеточного электрического напряжения во время эмбриогенеза у рыбок данио и движение личинок рыб. Кроме того было отмечено, что в несколько данио рерио злокачественные периферических нервов оболочки опухоли, опухоль, которую клетки были обычно поляризованных по сравнению с окружающих нормальных тканей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шапкой относится к эндогенной электрической сигнализации при посредничестве ионных каналов и насосы расположены на клеточной мембраны1. Ионный обмен через клеточную мембрану и спаренных электрические потенциальных и текущих изменений, необходимы для сигнализации процессов возбудимых нейронов и мышечных клеток. Кроме того шапкой и градиентов ионов имеют целый ряд других важных биологических функций, включая хранение энергии, биосинтез и метаболит транспорт. Биоэлектрических сигналов был также обнаружен как регулятор формирования эмбриональных шаблон, например осей тела, клеточного цикла и дифференциации клеток1. Таким обр....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио размещаются в объекте животных АААЛЖ одобрил, и все эксперименты были проведены согласно протоколов, одобренных Purdue животное уход и использование Комитета (PACUC).

1. Tol2 Transposon плазмидные конструкции подготовка

Примечание: Tol2, transposon, которая была обнаружена в оризии рыбы, широко использовался в данио рерио исследований сообщества8,9. Он успешно принят к участкам на основе рекомбинации клонирования системы шлюза и известен как Tol2 комплект10. Tol2 комплект обеспечивает более удобный способ создания констру....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В успешных инъекции, больше, чем эмбрионы вводят 50% рыбы будет отображать определенную степень зеленый флуоресценции в соматических клетках, и большинство из них будет положительным, Tol2 transposon акцизных пробирного (рис. 2). После 2-4 поколения исходящей крест с wildtype рыбы (до 50%, коэффициент ожидаемой Менделевское) флуоресцентных рыб, трансгенной рыбы были использованы для визуализации эксперимента для отслеживания клеточной мембраны потенциалов во .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя клеточные и тканевые деятельности на уровне электрические во время эмбрионального развития и болезней человека были обнаружены долгое время назад, в естественных условиях динамические электрические изменения и их биологической роли по-прежнему во многом неизвестным. Одна из основных задач является для визуализации и количественно электрические изменения. Технология зажима патч прорыв для отслеживания единичных клеток, но его применение к позвоночных эмбрионы ограничено, потому что они состоят из многих клет.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Научно-исследовательская работа в этой публикации было поддержано, Национальный институт Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под награду номер R35GM124913, PI4D университет Purdue программы стимулирования и PVM внутренней конкуренции Программа фондов фундаментальных исследований. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения финансирования агентов. Мы благодарим Коити Kawakami для Tol2 конструкции, Майкл Лин для ASAP1 конструкции, и Леонард Zon для ubi промоутер построить через Addgene.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 мл пробирки для клеточных культурVWR60818-725Культура E.Coli
Резервуар для электрофореза AgaroseOwl B2DNA eletrophoresis
Agarose RAAmrescoN605-500GДля изготовления гелей для инъекций
Attb1-ASAP1-F PrimerIDT DNAGGGGACAAGTGTACAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		ASAP1 амплификация кодирующего участка для субклонирования
Attb2-ASAP1-R праймерIDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTGTCTCTCTGTGAAGCCA		ASAP1 амплификация кодирующего участка для субклонирования
Прицел для рассечения светлого поляNikonSMZ 745Дехорионация, микроинъекция, крепление
Цветная камераZeissAxioCam MRcЭмбрион рыбы Запись изображений
Вогнутое предметное стеклоVWR48336-001Для удержания эмбрионов рыб в процессе визуализации
Одноразовая пипетка для переноса 3,4 млThermo Scientific13-711-9AMЭмбрионы рыб и перенос воды
Эндонуклеазный фермент, не INEBR0189LДля линеаризации плазмидной ДНК
Эпифуоресцентный составной эндоскопZeissAxio Imager.A2Рыбы Визуализация эмбрионов
Эпифуоресцентный стерео дисксекционный эндоскопZeissStereo Discovery.V12Визуализация эмбрионов рыбы
Люменный источниксветадинамика X-cite seris 120Источник света для флуоресцентных микроскопов
Щипцы #5WPI500342Дехорионация и разрушение игл
Gateway BP Clonase II Ферментная смесьThermo Scientific11789020Gateway BP рекомбинационное клонирование
Gateway LR Clonase II Plus ферментThermo Scientific12538120Gateway LR рекомбинационное клонирование
Гель DNA Recovery KitZymo ResearchD4002ДНК очистка гелем
Загрузочный наконечникEppendorf930001007Для загрузки инъекционного раствора в капиллярные иглы
Метилцеллюлоза (1600cPs)Alfa Aesar43146Крепление для эмбрионов рыб
Метиленовый синийSigma-AldrichM9140Подавляет грибковые вспышки в чашках Петри
Пресс-форма для микроинъекцийАдаптивные научные инструментыTU-1Для подготовки лотка для пресс-формы для удержания эмбрионов рыб во время впрыска
МикроинъекторWPIПневматический пиконасос PV820Микроинжектор
МикроманипуляторWPIМикроинъектор MM3301RМикроинъекционный
пуллер МикропипеткаИнструмент SutterP-1000Для приготовления капиллярной иглы
Минеральное маслоAmrescoJ217-500млДля калибровки объема инъекций
mMESSAGE mMACHINE SP6 Набор для транскрипцииThermo ScientificAM1340мРНК in vitro Транскрипция
моноцветной камерыZeissAxioCam MRmЗапись изображений эмбрионов рыб
Набор для миниподготовки плазмидZymo ResearchD4020Подготовка небольшого количества плазмидной ДНК
Пластиковые чашки ПетриVWR25384-088Для удержания рыб или эмбрионов рыб во время процесса визуализации
РНК Clean & Концентратор-5Zymo ResearchR1015очистка мРНК после транскрипции in vitro
СпектрофотометрThermo ScientificNanoDrop 2000Для измерения концентраций ДНК и РНК
Stage MicrometerAm ScopeMR100Калибровка объема микроинъекций
ТермоамплификаторBio-RadT100Амплификация ДНК для клонирования генов
Тонкостенные стеклянные капиллярыWPITW100F-4Необработанное стекло для изготовления каппиллярной иглы
Tol2-exL1 праймерIDT ДНКGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 акцизный анализ
Tol2-exR праймерIDT ДНКACCCTCACTAAAGGGAAAAAGTol2 акцизный анализ
TOP10 Химически грамотный E. coliThermo ScientificC404006Используется для трансформации при клонировании генов
Трикаин мезилатSigma-AldrichA5040Для обезболивания рыб или рыбьих эмбрионов
УФ-транс-иллюминатор 302 нмUVPM-20VВизуализация ДНК
Водяная баняThermo Scientific2853Для процесса трансформации клонирования генов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles