Здесь мы представляем модифицированных electrospinning метод изготовления PCL сосудистых имплантатов с толщиной волокон и большие поры, и описать протокол для оценки производительности в естественных условиях в мышиной модели замены брюшной аорты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Имплантация Electrospun сосудистых имплантатов с оптимизированной структурой в мышиной модели
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь мы представляем протокол изготовления Макропористые PCL сосудистого трансплантата и описать протокол оценки с использованием модели крыс брюшной аорты замены. Electrospun сосудистая графтов часто обладают сравнительно небольшие поры, которые ограничить проникновение в клетки в графтов и помешать регенерации и Ремоделирование нео-артерий. В этом исследовании были сфабрикованы PCL сосудистых имплантатов с толще волокон (5-6 мкм) и большие поры (~ 30 мкм) с помощью метода изменение обработки. Долгосрочной производительности трансплантата была оценена имплантации в модели брюшной аорты крысы. УЗИ анализ показал, что трансплантаты оставался патент без аневризма или стенозом, даже после 12 месяцев имплантации. Макропористые структура улучшить врастание клеток и таким образом способствовали ткани регенерировать на 3 месяца. Что еще более важно нет никаких признаков неблагоприятных ремоделирования, таких как обызвествление в пределах трансплантата стены после 12 месяцев. Таким образом electrospun PCL сосудистых имплантатов с модифицированных Макропористые обработки провести потенциал, чтобы заменить артерии для долгосрочного имплантации.
Введение
Сосудистых имплантатов из синтетических полимеров широко используются в клинике для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). К сожалению, в случае малого диаметра сосудов графтов (D < 6 мм) существует без успешных продуктов из-за низкой проходимостью, вызвано снижение скорости кровотока, что часто приводит к тромбоз, гиперплазия интимы и другие 1осложнений.
Тканевая инженерия предоставляет альтернативную стратегию реализовать долгосрочные проходимость и основанный на эшафот руководствуясь сосудистой регенерации и восстановления гомеостаза. В деталях, сосудистого трансплантата, как трехмерные шаблон, может обеспечить механическую поддержку и структурных руководство во время регенерации сосудистых тканей и влияние клеточных функций, включая клеточной адгезии, миграция, распространение, и секрецию внеклеточная матрица2. До настоящего времени были оценены различных синтетических полимеров для приложений в сосудистой тканевой инженерии. Среди этих полимеров благодаря совместимости хорошие клетки и медленной деградации, начиная от нескольких месяцев до двух лет3интенсивно исследована poly(ε-caprolactone) (PCL). В крыса аорты модель4,5,6, PCL сосудистых имплантатов, обрабатываемые electrospinning выставлены отличные структурной целостности и проходимость, а также как непрерывно увеличение клеток вторжения и неоваскуляризации в Трансплантат стены на срок до 6 месяцев. Однако неблагоприятные тканей ремоделирования, включая регрессии клеток и капилляров и кальцификации, были также отмечены на более timepoints, до 18 месяцев.
Cellularization сосудистого трансплантата является ключевым фактором определения регенерации тканей и свергая7. Electrospinning, как универсальный метод, широко использовался для подготовки сосудистых имплантатов с нано волокнистая структура8. К сожалению относительно небольшой поровой структуры часто приводит к недостаточности клеток инфильтрата в electrospun сосудистого трансплантата, который ограничивает последующего регенерацию. Для решения этой проблемы, различные техники пытались увеличить размер поры и общая пористость, включая соли/полимерных выщелачивания9,10, модификация аппарата коллектора, после лечения, лазерного излучения11 , и т.д. В самом деле структура electrospun графтов (включая диаметр волокна, размер поры и пористость) тесно связана с обработки условий12,13. Во electrospinning диаметр волокна легко регулируется путем изменения параметров, как концентрация раствора полимера, скорость потока, напряжения и т.д. 14 , 15, и таким образом, размер пор пористость укрепились и соответственно.
Недавно мы сообщили модифицированных трансплантата electrospun PCL с Макропористые структуры (волокна с диаметром 5-7 мкм и поры 30-40 мкм). В естественных условиях имплантации, заменив крыс брюшной аорты показал высокий уровень проходимости, а также хорошее endothelialization и гладких мышц регенерации в 3 месяца после операции16. Что еще более важно не неблагоприятные тканей ремоделирования, включая кальцификации и клеток регрессии можно наблюдать даже после одного года имплантации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Использование экспериментальных животных был одобрен животных эксперименты этического Комитета Нанкай университета и осуществлялась в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных.
1. Изготовление Electrospun PCL графтов
Примечание: в настоящем документе, метод electrospinning использовался для изготовления сосудов.
- Подготовка решений PCL 25 wt % и 10 wt %, путем растворения PCL в смеси метаноле и хлороформе, соответственно, (1:5 тома соотношение), при комнатной температуре (RT) для 12 h.
- Загрузите PCL раствор в шприц 10 мл стекла.
- Поместите шприц с иглой 21 G.
- Место на инструмента сбора оправки из нержавеющей стали (2 мм в диаметре, 25 см в длину).
- Для волоконно толще графтов, используйте 25 wt % раствора PCL, рабочее расстояние 17 см от кончика иглы сборщику, скорость потока 8 мл/ч и напряжение 11 кв как параметры electrospinning. Для волоконно тоньше графтов, использовать решение PCL 10 wt %, рабочее расстояние 20 см от кончика иглы сборщику, скорость потока 2 мл/ч и напряжение 18 кв как параметры electrospinning.
- Убедитесь, что полученный графтов помещены в вакууме на ночь, чтобы удалить остаточные растворителя. Стерилизовать всех инструментов до процедуры и поддержание асептической техники во всем.
- До имплантации продезинфицируйте графтов, погружая их в 10 мл 75% этанола для 30 мин и затем подвергая их воздействию УФ-излучения на ночь.
- Волокно и поры размеры: вычислить среднее волокно диаметр с помощью ImageJ программного обеспечения, основанные на сканирование изображений электронная микроскопия (SEM).
- Механические испытания строительных лесов:
- Вырежьте трубчатых лесов на секции 3 мм в длину, с помощью лезвия бритвы. Измерьте толщину леса с помощью микрометра.
- Место трубчатых лесов на машине испытания на растяжение с грузоподъемностью 100 н.
- Зажим леса с 1 мм расстояние между зажимом и тянуть продольно в размере 10 мм/мин до разрыва. Измеряют предел прочности на разрыв и удлинения при разрыве. Рассчитать Юнга от первоначального линейной региона (вплоть до 5% деформации) из кривая напряжение деформация.
2. крыс брюшной аорты имплантации модель
Примечание: Все материалы и инструменты, используемые в хирургии являются стерильными. Во время операции убедитесь, что оператор носит марлевые маски и стерильные перчатки, чтобы избежать инфекции. Убедитесь, что температура в помещении поддерживается на 27-30 ° C для поддержания температуры тела животного. Следуйте местных IACUC руководящие принципы относительно анальгезии.
- Используйте Sprague-Dawley самцах массой 240-270 g как получатели сосудистого трансплантата. Убедитесь, что крыса постились 24 ч до операции. Цель поста крыс для 24 h является пустой фекалий в желудочно-кишечном тракте достаточно, тем самым расширить горизонт оператора.
- Понять крыса спины шеи и держать его голову вниз, вставить иглу Шпринге в брюшной полости нижней части живота. Вызвать крыс для анестезии с хлораль гидрат (330 мг/кг), внутрибрюшной инъекции.
- Подтвердите адекватной анестезии путем обеспечения того, что крысы имеет расслабленной мышцы и устойчивый дыхание. Место крысу под операционных микроскопов в лежачем положении.
- Примените мазь офтальмологический ветеринар вазелин на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Администрировать антикоагуляционная (100 UI/кг) с гепаринизированным физиологического раствора раствор (50 UI/мл), инъекции Вену хвоста до операции.
- Сбрить мех в передней брюшной стенке с помощью лезвия бритвы и очистить кожу, используя раствор йода и медицинского спирта раствор.
- Выполните разрез срединная лапаротомия с Ножницы хирургические и убедитесь, что разрез длиной 4-5 см, а затем подвергать брюшной полости.
- Убрать и оберните кишечника с марлей, смоченной раствором преференциально.
- Тщательно анализировать брюшной аорты.
- Выявление и перевязать все мелкие ветки, используя швы нейлон Мононить 9-0.
- Зажим изолированные секции (до 1 см в длину) аорты с помощью двух сосудистых зажимов. Аорты может оставаться зажимается на 20-30 мин.
- Разрез брюшной аорты между двумя зажимами с помощью микро ножницы для создания анастомоза сайтов.
- Промойте два концы аорты гепаринизированным солевой раствор (50 UI/мл) раствора для удаления остатков крови.
- Отделите адвентиции с помощью микро ножницы.
- Анастомозируют лоскута с внутренним диаметром 2 мм и 1 см в длину для крыс брюшной аорты с восьмерка шовные выкройку швами нейлон Мононить 9-0.
- Во-первых построить четыре анастомозов согласно последовательности 9, 3, 12 и 6 часов позиции в проксимальной части, а затем анастомозируют срезанных краев в 4 швы между двумя швами. После окончания проксимальной шовный материал, шов дистальной стороны таким же методом.
Примечание: Каждый стежок требуется убедиться, что родной стороне слегка внедряется в трансплантата. - Удаление дистальной зажим позволяет крови течь в трансплантата, затем удалите проксимальной зажим.
- Нажмите концы швов остановить кровотечение стерильным ватным тампоном или небольшой марлевые губкой. Пресс для около 3 минут, до гемостаз.
- Возвращение кишечника в брюшную полость.
- Промойте брюшную полость, с использованием теплого физиологического раствора раствор с гентамицина (320 ед/мл).
- Зашейте брюшной стенки с использованием нейлон накладывать шов 3-0 в слой мышц и кожи, соответственно.
- Поместите крыса в клетку чистой и сухой и положить грелку под клетку для поддержания температуры тела животного; затем дождитесь крысу, чтобы оправиться от анестезии. Присутствовать на животных до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
- После того, как он приходит в сознание, положите крысу в одной клетке с пищей и водой. Примените йода на рану для предотвращения инфекции после операции. Вернуться крыса в компании других животных до тех пор, пока он полностью восстанавливается.
- Усыпить крыс согласно институциональных руководящих точках интервала.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
PCL графтов были описаны на 3 месяцев и 12 месяцев постоперационно и анализируются стандартные гистологических методов гематоксилином и эозином (H & E), Массон trichrome, Верхоеф Ван Гизону (VVG), фон Kossa и пятнать для α-SMA, иммунофлюоресценции MYH, vWF и эластина. Гистологические изображения были взяты с помощью прямо микроскопом, и иммунофлюоресценции изображения были взяты с помощью микроскопа fluorescence.
Все данные б...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Решающее значение для восстановления и реконструкции сосудистого трансплантата в естественных условиях16клеток инфильтрата. Ограниченное клеток инфильтрата часто связаны с относительно небольшой поры трансплантата, которые препятствуют миграции клеток в стену трансплантата. Для преодоления этой трудности, мы разработали модифицированный метод подготовить electrospun PCL сосудистых имплантатов с большой пористую структуру. В деталях размер пор увеличилась с увеличением толщины волокна, кот...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы имеют не конфликтующие финансовые интересы.
Благодарности
Эта работа была финансово поддержана NSFC проектов (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 и 81401534).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Поли(эпсилон;-капролактон) (PCL) гранулы (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| метанол | Тяньцзиньский химический реагент Компания | 1060 | |
| Спирт | Тяньцзиньский химический реагент | 1083 | |
| Хлороформ | Тяньцзиньский химический реагент Компания | A1007 | |
| Сахароза | Тяньцзинь Фэнчуань Компания | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar A16046 | ||
| Sprague Dawley крысы | Центр лабораторных животных Академии военно-медицинских наук | ||
| Нормальный физиологический раствор | Хэбэй Тяньчэн Фармацевтическая компания | ||
| Хлорал | гидрат Тяньцзинь Жуйцзинь химическая компания | 2223 | |
| Гепарин натрия Инъекция | Тяньцзинь Биохим Фармацевтическая компания | ||
| Инъекция гентамицина сульфата | Цзянсу Ляньшуй Фармацевтическая компания | ||
| Мышиное анти-&альфа;-СМА первичное антитело | Abcam | ab7817 | |
| Мышиное антигладкое первичное антитело | MYH Abcam | ab683 | |
| Кролик поликлональное антитело против крысиного эластина | Abcam | ab23748 | |
| Кролик анти-фон Виллебранд фактор первичные антитела | Abcam | ab6994 | |
| Козий анти-мышиный IgG (Alexa Fluor 488) | Инвитроген | ab150117 | |
| Козий анти-кроличий IgG (Alexa Fluor 488) | Инвитроген | ab150077 | |
| 5% нормальная козья сыворотка | Чжуншань Золотой мостик | ZLI9022 | |
| гематоксилином и эозином (H& E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Хирургические швы иглы с нитью,3-0 шелк | Шанхайская компания по производству медицинских товаров Jinhuan | G3002b | |
| Хирургические шовные нити иглы с нитью,9-0 шелк | Шанхайская компания медицинских принадлежностей Jinhuan | H901 |
Ссылки
- Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation. J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).
- Zhang, L., et al. A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).
- Thottappillil, N., Nair, P. D. Scaffolds in vascular regeneration: current status. Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).
- Pektok, E., et al. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation. Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).
- Innocente, F., et al. Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation? Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).
- de Valence, S., et al. Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration. Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).
- Assmann, A., et al. Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating. Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).
- Baker, B. M., et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).
- Wang, K., et al. Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).
- Lee, B. L. P., et al. Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds. Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).
- Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. Increasing the pore size of electrospun scaffolds. Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).
- Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review. Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Rnjak-Kovacina, J., et al. Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering. Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).
- Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
