Методическая статья

Microfluidic платформа для продольной Imaging в Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/57348

⸱

2 мая 2018 г.

 , 
1Department of Physics Education, Kongju National University, 2Department of Physics, Harvard University, 3FAS Center for Systems Biology, Harvard University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы демонстрируем живых изображений отдельных червей, используя microfluidic пользовательского устройства. В устройстве несколько червей, индивидуально ограничиваются отдельные камеры, позволяя мультиплексированных продольной наблюдения различных биологических процессов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В течение последнего десятилетия microfluidic методы были применены для изучения малых животных, в том числе нематоды Caenorhabditis elegansи доказали свою полезность как удобный живой платформа отображения информации, предоставляя возможности для точного управления экспериментальных условиях в режиме реального времени. В этой статье мы демонстрируем живых изображений отдельных червей, используя WormSpa, ранее опубликованных пользовательских microfluidic устройство. В устройстве несколько червей, индивидуально ограничиваются отдельные камеры, позволяя мультиплексированных продольной наблюдения различных биологических процессов. Чтобы проиллюстрировать возможности, мы провели доказательства принцип экспериментов в которых червей были инфицированы в устройстве с патогенных бактерий, и динамики экспрессии генов иммунной реакции и откладки непрерывно контролируются в отдельных животных. Простая конструкция и эксплуатация данного устройства делают его пригодным для пользователей без предыдущего опыта с на основе microfluidic экспериментов. Мы предлагаем, что такой подход будет полезным для многих исследователей, заинтересованных в продольных наблюдения биологических процессов при четко определенных условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменения в условиях окружающей среды может привести к активации генетических программ сопровождается индукции и подавление экспрессии определенных генов1,2. Эти кинетическая изменения могут быть переменной среди тканей, в том же животных и между различными животными. Исследования таких генетических программ поэтому призываем методов, которые позволяют продольной томографии отдельных животных и точный динамический контроль состояния окружающей среды.

В последние годы microfabricated оптимизированных устройств были использованы для изучения многих аспектов реакции и поведения в мелких животных, в том числе червей, мух, медведи воды и более3,4,5,6, 7. Приложения включают, например, глубоко фенотипирование, optogenetic запись активности нейронов в ответ на химические стимулы и отслеживание моторного поведения локомоции и насосных8,9,10 , 11.

Подходы, основанные на microfluidic провести множество свойств, которые могли бы пользу долгосрочных продольной томографии реакции на экологические сигналы, включая точный динамический контроль местных микроокружения, гибкий дизайн, который позволяет ведение отдельных животных в отдельных помещениях и благоприятные атрибуты для изображений. Однако поддержание животных в камере microfluidic долгое время с минимальное отрицательное воздействие на их хорошо существ является проблемой, которая требует определенного ухода в дизайн microfluidic устройства, а также в выполнении эксперимента.

Здесь мы продемонстрировать использование WormSpa, microfluidic устройством для продольной томографии Caenorhabditis elegans. 5 индивидуальных червей ограничены в камерах. Постоянный низкий поток жидкости и бактериальных подвеска гарантирует, что черви являются хорошо кормят и достаточно активным, чтобы поддерживать хорошее здоровье и облегчить стресс, и структура камер позволяет червей откладывают яйца. Простота конструкции и эксплуатации WormSpa должны позволить исследователи с нет предыдущего опыта работы в микрофлюидика включения этого устройства в свои собственные исследовательские планы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ниже протокол использует WormSpa5, ранее описанные microfluidic устройством для продольной томографии червей. Изготовление WormSpa (начиная с CAD-файлов, которые могут быть получены от авторов по запросу) проста, но требует некоторых знаний. В большинстве случаев изготовление легко может быть сделано путем основной объект или коммерческая компания, которая предоставляет такие услуги. При изготовлении устройство, убедитесь указать, что высота функции — 50 мкм.

1. Экспериментальная установка

  1. Смонтируйте устройство microfluidic на Перевернутый флуоресценции микроскоп с моторизованного столика.
  2. Место орбитальный шейкер недалеко от Микроскоп, но убедитесь, что вибрации от шейкер непосредственно не затрагивают Микроскоп. Например положите шейкер на полке на стене, что делает никаких контактов с таблицей оптических.
  3. Место шприцевый насос на орбитальный шейкер. Лента насоса в шейкер, таким образом, чтобы он не трясти при встряхивании.

2. Подготовка Microfluidic окружающей среды

Примечание: Во время эксперимента, четыре шприцы подключены к устройству microfluidic через шприц-тюбиков, как указано на рисунке 1. Этот шаг описывается подготовка этих шприцы. Если не указано иное, держите как можно более коротким шприц-тюбиков без их тугой.

  1. Подготовки шприц розетки и трубку от шприца. Этот шприц (S1 на рис. 1) будет позже подключен к розетке устройства через трубку от шприца и используется для временного хранения жидкости выходит из устройства.
    1. Сделайте иглы адаптер, удалив пластиковые части кончика шприца 20 G x 1/2 дюйма, сохраняя только иглы (металлические части). Сделать это, удерживая пластиковых и металлических деталей с помощью плоскогубцев и потянув их друг от друга. Оставшиеся пластиковые остатка на иглу можно сгореть с помощью горелки Бунзена.
    2. Согните иглы по геометрии экспериментальной установки удерживая ее два концы плоскогубцами. В конструкции, описанные здесь изгиб иглы в его середине угол ~ 110° является наиболее удобным.
    3. Подключите адаптер иглы половину пути в трубу. Другая половина позднее быть подключен к устройству. Шприц трубка должна быть совместима с кончик шприца 20 G без утечки (например, трубопровод с внутренним диаметром 0.86 мм и наружным диаметром 1.32 мм). Рекомендуется трубки длиной ~ 50 см.
    4. Подключите шприц 10 мл luer-lock в другой (открытый) конец шприца трубки через кончик шприца 20 G x 1/2 дюйма.
  2. Подготовка буфера входе шприцы и шприц трубы. Один из этих шприцы (S2 на рис. 1) используется как резервуар для жидкости, которая идет в устройство и управлять потоком инъекции. Другие шприц (S3 на рис. 1) требуется для буфера обмена, как описано в шаге 3.2.
    1. Подключите шприц 10 мл luer-lock (S2) непосредственно к 3-ходового клапана а другой шприц (S3) к же клапан через трубку от шприца (рис. 1): Подключите S3 на трубу через кончик шприца, а трубка к клапану через другой наконечник шприца.
      Примечание: Порядок, в котором соединены эти материалы не имеет значения.
    2. Подключите трубку от шприца в оставшихся порт 3-ходового клапана. Подготовить еще один адаптер иглу как шаг 2.1.2 и вставьте иглу на полпути в другой (открытый) конец трубку от шприца.
    3. Установите клапан, таким образом, что трубку от шприца в шаге 2.2.2 и S2 связаны в то время как S3 закрыт (рис. 1).
  3. Подготовки шприц червь входе и трубку от шприца. Этот шприц (S4 на рис. 1) используется для загрузки червей в устройство.
    1. Соединить трубки длиной шприц шприц 10 мл luer-lock (S4). Определить длину этой трубки от объема жидкости, которая будет использоваться для загрузки; Например, 100 см трубка поддерживает более 2 мл жидкости (см. также, шаг 4.2).
    2. Подготовить еще один адаптер иглу как шаг 2.1.2 и подключите один половине к другой (открытый) конец шприца трубки иглы.
  4. Промойте все шприцы и труб с S-средний12 дважды. Заполните шприцы и трубы с S-средний, заботясь, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
  5. Подключите отводной трубки шприц к розетке устройства.
    1. Подключите адаптер иглы в конце трубки шприц на выходе порт.
    2. Внедрить небольшой объем S-средний через выход заполнить устройство, пока немного S-средний приходит из входного буфера и входе червя.
  6. Подключите в буфер-шприц трубку к буфер впускное отверстие устройства, во время подключения червь вход с PIN-код (из нержавеющей стали штифт диаметром 1/32 дюйма).
  7. Inject постоянного потока буфера в устройство. Загрузить S2 буфера входе шприца насоса шприца13и установить насос, таким образом, что средний в S2 непрерывно вводят в устройство со скоростью потока 3 мкл/мин.

3. Загрузка бактерий в Microfluidic устройства

  1. Подготовка ОР50 Escherichia coli , приостановлено в S-средний12.
    1. После стандартного протокола прививать 250 мл флакон с 50 мл LB и единую колонию и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Центрифуга ночь культуры при 4000 об/мин в течение 10 минут и Ресуспензируйте гранулы в 30 мл S-средний.
    3. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр подвеска. Измерить бактериальных концентратов, ее оптическая плотность 600 Нм (OD600) и регулировка концентрации ОД600 3. Это высокая плотность требуется держать червей хорошо кормят.
  2. Обмен буфера в устройство с ОР50 подвеской.
    1. Подготовки шприц чистый (S5), заполнены с ОР50 подвеской. Возьмите шприц вертикально и коснитесь его несколько раз, чтобы собрать все пузырьки воздуха в верхней.
    2. Поверните клапан 3-полосная буфера входе шприцев закрыть подключение к устройству и подключить два шприцы, S2 и S3. Освободите S2 от шприцевой насос.
    3. Отключите S2 от клапана и подключите S5 на клапан. Вытолкнуть весь воздух, собранных на верхней части S5 S3 через клапан до тех пор, пока немного ОР50 буфера переходит в S3. Поступая таким образом, убедитесь, что нет пузырьков воздуха остается в S5 или клапан.
    4. Включение 3-ходовой клапан обратно в исходное положение, чтобы закрыть соединение между S3 и S5 и подключить к устройству S5. Загрузите S5 шприцевой насос. Включите орбитальный шейкер, который держит насос. Установите пожимая скорость около 200 об/мин.
    5. Установите скорость потока быть 100 мкл/мин. Время, необходимое для нового буфера приехать червей в устройстве зависит от длины буфера-шприц трубку (около 5 минут с трубки, описанной выше). Выше скорость потока может использоваться, если требуется быстрее буфера обмена.
    6. Как только буфер ОР50 распространяется по всему устройство, установите скорость потока обратно в 3 мкл/мин.

4. Загрузка червей в Microfluidic устройства

  1. Подготовить небольшой низкий привязки microcentrifuge трубки (650 мкл) и заполнить его с 100 мкл суспензии ОР50. Перевод около 20-30 синхронизированы возраст молодых взрослых червей (46 часов после L1 личиночной арест при 25 ° C) из плиты агара NGM (нематоды роста среднего) на трубу, выбирая их по одному с червь выбрать. Возраст синхронизации может быть сделано после стандартного протокола12.
  2. Заполните червь входе шприц и шприц трубки (S4 на рис. 1) с ОР50 подвеской. Inject ~ 500 мкл жидкости в пробки microcentrifuge с червями. Нарисуйте подвеска с червями в шприц-трубку червя. Убедитесь, что трубка шприц достаточно долго (> 1 м) и Рисованные червей остаться в трубку от шприца и не сделать всю дорогу до шприца S4.
  3. Подсоедините S4 червь входу. Внедрить все черви в шприц-трубку червя в microfluidic устройство. Отключите S4 и трубку от шприца. Подключите червь вход с PIN-код.
  4. Разъединение буфера входе шприц S2 от механического насоса ( рис. 1) и вручную управлять S1 и S2, чтобы подтолкнуть все черви в отдельные каналы. Нажатие S2 будет двигаться червей в каналы, при нажатии S1 будет переместить их в обратном направлении. После загрузки канала, червь в каждом канале будет блокировать запись других червей.
  5. Пусть черви приспособиться к новой среде для 2-3 часа.

5. Настройка протокола изображений

  1. Найти все черви, которые надежно расположены в устройстве и набор изображений позицию для каждого из них в приобретение изображений программное обеспечение, которое контролирует ваш Микроскоп. Обратите внимание, что в некоторых случаях (например когда требуется увеличение, или при использовании камеры с ПЗС сенсор меньшего размера) для каждого канала требуются несколько изображений позиции.
    Примечание: Хотя это может быть сделано вручную, некоторые приобретение пакетов программного обеспечения можно загрузить текстовый файл, который содержит список позиций, где изображения должны быть приняты. Поскольку эти позиции отсортированы регулярно в WormSpa, пользователь может написать небольшой скрипт (например, Python или коммерческого программного обеспечения), который автоматически создает такой список. Точный формат этого сценария будет зависеть предусмотрено приобретение программного обеспечения (см. пример в дополнительный материал 1) формат файла.
  2. Установите необходимую частоту покадровой съемки. Например изображения генов иммунной реакции на инфекции осуществляется с частотой 10 минут каждого кадра. Убедитесь, что все необходимые каналы (например ярко поле и флуоресценции GFP) приобретаются в каждый момент времени.

6. принимающие ответ синегнойной инфекции

Примечание: Этот шаг специфичен для изучения взаимодействия хост патогена. Кроме того можно подготовить буфер, содержащий другие экологические сигналы интереса (биотических и абиотических факторов стресса, наркотики, сигнальные молекулы, и т.д.).

  1. Подготовка PA14 Pseudomonas aeruginosa , приостановлено в SK-средний14.
    1. 250 мл флакон с 50 мл LB и единую колонию прививок и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Прививок еще 250 мл флакон с 50 мл фунтов и Алиготе культуры и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    3. Центрифуга ночь культуры при 4000 об/мин в течение 10 минут и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл SK-средний. Измерить бактериальных концентратов и регулировка концентрации ОД600 = 4.
    4. Передать чистую колбу подвеска и инкубировать при 37 ° C в течение 24 часов и при 25 ° C для еще 24 часов при встряхивании. Этот шаг имитирует пластины инкубации шаг в стандарте убийство пробирного14.
    5. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр подвеска. Это необходимо для предотвращения бактериального агрегатов от засорения устройство.
  2. Замените PA14 подвеска, следуя той же процедуре, как и в шаге 3.2 ОР50 подвеска в устройстве. Сохранять изображения на 10 часов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возраст синхронизированы молодых взрослых червей (46 часов пост личиночной арест L1 при 25 ° C)12 были загружены в устройство, как описано в протоколе. Черви индивидуально были расположены в отдельных каналов, позволяя продольной измерение реакции животных на возбудителя. Когда успешный эксперимент, большинство червей остаются в их каналах в течение всего эксперимента. В этом случае просто, поместив их канал в визуализации пути, избегая необходимости активно найти ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluidic инструменты обеспечивают многочисленные преимущества в изучении червей. Изображений в PDMS устройство обеспечивает более высокое качество изображения по сравнению с стандартной плиты агар NGM. Несколько изображений могут быть взяты из одного червя, в отличие от традиционных методов, в которых животные взял от плиты и монтируется на микроскопа для изображений. Кроме того микроокружение, в котором проживают черви могут храниться постоянной или модулированные по желанию, позволяя точное сопоставление состава ок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано национального научного фонда через гранты PHY-1205494 и MCB-1413134 (EL) и Национальный исследовательский фонд Кореи Грант 2017R1D1A1B03035671 (KSL).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
WormSpaН/ДН/ДФайл САПР для WormSpa доступен в лаборатории Левина.
Составной микроскопZeissAxioObserver Z1Инвертированный флуоресцентный микроскоп с моторизованным столиком
Шприцевой насосNew Era Pump SystemsNE-501
TubingSCI Scientific Commodities Inc.BB31695-PE/50.034" (0,86 мм) внутренний диаметр x 0,052 дюйма (1,32 мм) O.D
Наконечник шприцаCMLsupply901-20-05020 калибр x 1/2" тупой наконечник из нержавеющей стали канюля
Шприцевой фильтрPALL4650Acrodisc 32 мм Шприцевой фильтр с 5 мкм Супор мембранный
шприцQosinaC330710 мл Шприц с наружной резьбой Luer Lock
3-ходовой клапанColeParmerFF-30600-23Большой диаметр 3-ходовой, с наружным замком, запорные краны, 10 / уп. Нестерильный
установочный штифтMcMaster-Carr90145A31718-8 Установочные штифты из нержавеющей стали (диаметр 1/32 дюйма x 1/2 дюйма Lg.)
Микроцентрифужная пробирка с низким связываниемCorningCL S32060,65 мл микроцентрифужная трубка с защелкивающейся крышкой с низким связыванием

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
  2. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  3. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
  4. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
  5. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  6. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998(2014).
  7. Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670(2017).
  8. Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
  9. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
  10. Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862(2016).
  11. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221(2017).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
  14. Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
  15. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  16. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183(2006).
  17. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
  19. Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
  20. Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
  21. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
  22. Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
  23. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  24. Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345(2013).
  25. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
  26. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  27. Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
  28. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

WormSpa

Похожие статьи