Методическая статья

Количественное определение липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нила красный и нефти красный O пятнать

DOI:

10.3791/57352

⸱

5 марта 2018 г.

 ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California, 2Molecular & Computational Biology Section, University of Southern California, 3Integrative Program for Biological & Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нил красное окрашивание фиксированной Caenorhabditis elegans — это метод для количественного измерения нейтральных липидных отложений, в то время как нефть красный O пятнать способствует качественной оценки липидного распределения среди тканей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans является организма исключительные модели для изучения метаболизма липидов и энергетического гомеостаза. Многие из его гены липидного сохраняются в организме человека и связаны с метаболическим синдромом или других заболеваний. Экспертиза накопления липидов в этот организм может осуществляться фиксирующие красителей или метки бесплатные методы. Фиксаторные пятна, как Нил красный и масло красный O недорогой, надежный способов количественно измерить уровень липидов и соблюдать качественно распределение липидов в тканях, соответственно. Кроме того эти пятна позволяют для высокопроизводительного скрининга различных генов метаболизма липидов и пути. Кроме того их гидрофобная природа облегчает растворимости в липидах, уменьшает взаимодействие с окружающих тканей и предотвращает диссоциации в растворитель. Хотя эти методы эффективны при рассмотрении содержания общих липидов, они не предоставляют подробную информацию о химическом составе и разнообразия липидных отложений. Для этих целей, лейбл бесплатные методы, такие как GC-MS и автомобили микроскопии лучше подходит, их расходы, несмотря на.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липиды являются необходимым для жизни. Они являются неотъемлемыми компонентами мембран, выступать в качестве вторичного посыльных и сигналов датчиков и имеют важные функции в хранения энергии. Когда метаболизма липидов является dysregulated, это приводит к заболеваний, как ожирение и диабет типа II, которые насущных проблем общественного здравоохранения9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) представляет собой отличную модель организм для изучения метаболизма липидов, потому что он имеет относительно короткий жизненный цикл, прозрачное тело, известный клеток линии и полностью виртуализированного генома. Главным образом гермафродита, C. elegans позволяет исследователям привлечь большое количество isogenic животных в короткие периоды времени выполнять вперед генетических экраны высокой пропускной способностью для изучения широкий спектр метаболических генов и пути4. Этот подход показал высокую степень сохранения в 273 генов метаболизма липидов C. elegans среди людей, мышей, крыс и дрозофилы. Кроме того более 300 липидов генов у нематоды Caenorhabditis elegans у человека orthologues, которые связаны с заболеваниями, не связанные с метаболическим синдромом11. Традиционно изучение хранения липидов в C. elegans основном опирался на краситель меченых анализов, которые предоставляют надежную информацию о накопление липидов. Реже представляет собой описание где локализовать липиды и измеренных различия в изобилии липидов в тканях. Однако последние работы показал, что распределение липидов может быть также важно, как накопление липидов6.

В последнее время, исследования начали интеграции методы, такие как высокая производительность жидкого хроматография масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС), и последовательной анти Стокса микроскопия комбинационного рассеяния (легковые автомобили) адрес недостатки подходов, основанных на пятно, анализируя содержание липидов экстрактов, конкретных Липидные фракции и липидных отложений, соответственно10,11непосредственно. Кроме того автомобили микроскопия показала, что Нил красный может служить лишь в качестве прокси для накопление жира при использовании в качестве фиксирующие краска, для его использования как пятно жизненно приводит к пятнать пробить авто люминесцентные органеллы10. Однако необходимых технических специалистов и расходы, связанные с этими хроматографии и методы микроскопии делают их использования неприемлемой для многих исследований вопросов. В этой статье мы обсудим удобный и надежный способ фиксировать и выведение липидный нейтральными вкладов в C. elegans с помощью Нил красный и масло красный O различать изобилие липидов в целом животных и в определенных тканях.

Нил красный, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, является benzophenoxazone краска, которая легко растворяется в различных органических растворителей, но в основном нерастворимые в воде. Это отличный lysochrome краска используется для пятно нейтральные липиды как триглицеридов или эфиры холестерина потому, что он имеет сильный цвет, solubilizes хорошо в липиды, имеет незначительное взаимодействие с окружающими тканями и менее растворим в растворитель чем в липиды. Он имеет возбуждения и выбросов Максима 450-500 и 520 Нм, соответственно1. При просмотре Нила красно окрашенных C. elegans для зеленой флуоресценцией дискретных липидов органов может быть наблюдается на протяжении кишечника и других тканях либо в кластеры или равномерно рассеяны, в зависимости от генотипа животного или экспериментальное лечение 7.

O нефти красный является lysochrome, жирорастворимых краситель, используемый для пятно триглицеридов и липопротеидов. Это называется azo краситель, потому что его химическая структура содержит две группы АЗО, придает трех ароматических колец. Это трудно ионизируется, который оказывает растворяется в липидах. Его пятно цвета красный и его максимального поглощения света — 518 Нм 3. C. elegans витражи с маслом, красный O показывают красный липидного капель, которые стоят вне против прозрачное тело животного, которое способствует качественной оценки липидного распределения среди различных тканей6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Нил красный (NR) пятная липидов

  1. Подготовка 5 мг/мл NR Стоковый раствор
    1. В 500 мл бутылки добавьте 100 мг порошка NR 200 мл ацетона, 100%.
    2. Обложка бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы избежать любого воздействия на свет.
    3. Перед применением перемешайте раствор 2 h в темноте.
    4. Для долгосрочного использования храните в плотно закрытой бутылке без любой освещенности Стоковый раствор NR. Стоковый раствор масштаба NR согласно потребности в научных исследованиях. Убедитесь, что же Стоковый раствор используется через NR-окрашивание эксперименты для получения последовательной окрашивание и визуализации результатов.
  2. Приготовление рабочего раствора NR
    1. Для каждого 1 мл 40% изопропиловый спирт (v/v) мкл 6 NR Стоковый раствор.
    2. Подготовка 600 мкл рабочего раствора NR для каждого образца.
      Примечание: Сделать свежий NR работает право решения до окрашивания. В зависимости от потребностей Стоковый раствор NR используйте 15 мл или 50 мл окончил Конические трубки.
  3. Подготовка червей для окрашивания липидов NR
    1. Червей расти ранней стадии L4 при 20 ° C на нематод роста среднего (НГМ) семенами с конца журнала ОР50 E. coli.
    2. Моют червей от пластины с 1 мл раствора 1 x фосфат амортизированное saline + 0,01% раствор Тритон X-100 (PBST) и положить подвеска червя в 1,5 мл отцентрифугировать.
    3. Центрифуги, черви на 560 x g за 1 мин удалить супернатант и повторить этот шаг до E. coli очищается от подвески.
    4. 100 мкл 40% изопропиловый спирт червь Пелле и Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин.
    5. Центрифуга для червей на 560 x g за 1 мин и удалить супернатант без нарушения червь Пелле.
      Примечание: Использование больших объемов PBST мыть червей от пластин, если с помощью больших пластин или окрашивания больше червей за тарелку. Не мойте червей в PBST более чем за 15 мин до фиксации образцов. Выполните дополнительные автомойки, если супернатант не очищается от бактерий. Проводить инкубацию в 40% изопропиловый спирт, с помощью nutator или рокер. Всегда контролировать трубы, чтобы убедиться, что происходит полный пример агитации.
  4. Липидов, окрашивание с NR
    1. В темноте добавьте 600 мкл рабочего раствора NR для каждого образца. Инвертировать трубок три раза и полностью смешать червей в растворе NR.
    2. Вращайте образец в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
    3. После инкубации центрифуга червей на 560 x g за 1 мин и удалить супернатант.
    4. 600 мкл PBST и Проинкубируйте образцы в темноте для 30 минут, чтобы удалить избыток NR пятно.
    5. Центрифугуйте образцы на 560 x g за 1 мин и удалить все, но примерно 50 мкл супернатант.
      Примечание: NR инкубации не требуют агитации. Оседание червей часто встречается во время этого шага.
  5. Подготовка слайдов изображения микроскопа
    1. Ресуспензируйте червь Пелле в оставшихся супернатант.
    2. Место 5 мкл суспензии червя на микроскопа и положить coverslip на тщательно во избежание захвата воздушные пузыри.
    3. Уплотнение coverslip с лак до визуализации червей.
    4. Подготовьте только пару слайды одновременно. Это будет гарантировать, что NR изображений остается постоянным по всей пробы. Качество NR-окрашенных изображений уменьшается после того, как 6 ч. дискретные липидного капель трудны для того наблюдать и фон флуоресценции увеличивается, который вмешивается NR сигнал обнаружения.
  6. Визуализационная диагностика NR-окрашенных червей
    1. Изображения червей на 5 X увеличение захватить несколько животных в поле зрения.
    2. Переключиться на 10 крат лучше количественной оценки отдельных червей.
    3. Используйте канал FITC/GFP изображения NR-окрашенных червей и попробовать различные воздействия раз, чтобы определить оптимальные условия для количественной оценки.
    4. Сохранение файлов в формате TIF, чтобы избежать потери данных из-за сжатия.
      Примечание: Типичный воздействия раз варьируются от г-жи 100-1000, успев оптимальной экспозиции, использовать его для всех образцов для поддержания последовательности изображений.
  7. NR окрашивание изображения количественная оценка
    1. Загрузите микроскопии ImageJ. В раскрывающемся меню Плагины используйте функцию био-форматов, если файл изображения не распознается.
    2. В раскрывающемся меню изображения, под функцию стеки используйте изображения для стека для создания стека изображений при сравнении нескольких микроскопии.
    3. В том же выпадающее меню настроить яркость/контрастность изображения стека и распространить изменения на все изображения, нажав кнопку Применить.
    4. Использовать выбор многоугольник разграничить каждый образ червя и использовать функцию меру под анализ выпадающее меню для количественного определения интенсивности флуоресценции, испускаемых NR.
    5. Для каждого изображения измерить пяти местах фон и рассчитать интенсивность флуоресценции средняя фоновая.
    6. Вычитание фона интенсивности флуоресценции от каждого образа червя по формуле N = G - (A x B), где N – чистая флуоресценции, G для грубых флуоресценции, А для всего червь области и B для флуоресценции средняя фоновая.
    7. Нормализовать интенсивности флуоресценции размером червь, разделите каждый червь чистой флуоресценции, его общая площадь. Результаты представлены как интенсивности флуоресценции в произвольных единицах (а.е.), на пиксель.
      Примечание: Избегайте экспорт изображений в формате JPEG. В то время как сжатие делает более управляемым для хранения файлов, нарушения целостности данных в этот формат. Убедитесь, что все изображения изменены и проанализированы одинаково. Не забудьте включить линейку правильно оценить размер при различных увеличениях. Для лучше визуализировать различия в интенсивности флуоресценции, используя ImageJ, переключить тип изображения из RGB в 8-разрядный и выберите огонь из меню поиска таблиц (LUT) изображения. Это создает образ тепло карта, в которой увеличение цвета яркость коррелирует с повышенной флуоресценции интенсивности.

2. масло красный O окрашивание (Оро) липидов

  1. Подготовка Оро Стоковый раствор
    1. Во флаконе 250 мл добавить 500 мг порошка Оро в 100 мл 100% изопропиловый спирт и хорошо перемешайте.
    2. После подготовки, хранения решения, плотно закрытой с не освещенности.
  2. Приготовление рабочего раствора Оро
    1. Разбавьте Оро Стоковый раствор в воде (3:2) до 60% изопропиловый спирт.
    2. Перед использованием фильтра рабочего раствора Оро через фильтр 0.2 мкм стерильным шприцем ацетат целлюлозы.
      Примечание: Для лучшего качества решения, приготовить рабочий раствор Оро за день до и пусть это смешать всю ночь. Однако если решение является необходимой тот же день, разбавленных и перемешать Оро решение на рокер для по крайней мере 2 ч перед использованием. Перед качания, оберните Конические трубки в парафин ленты, чтобы избежать утечки раствора Оро.
  3. Подготовка червей для Оро липидов пятнать
    1. Растут червей при 20 ° C на нематод роста среднего (НГМ) семенами с конца журнала ОР50 E. coli желаемый жизни сцену.
    2. Добавить 1 мл PBST раствора к пластине и вихрем до тех пор, пока все черви являются у плиты. Наклона пластины и мыть его с 1 мл PBST. Передать червь подвеска 1,5 мл отцентрифугировать.
    3. Центрифуги, черви на 560 x g за 1 мин удалить супернатант не нарушая гранул и повторите стирки шаг с 1 мл раствора PBST три раза. Удалите все супернатанта но 100 мкл.
    4. 600 мкл 40% изопропиловый спирт Пелле червя и рок его при комнатной температуре в течение 3 мин.
    5. Центрифуга червей на 560 x g 30 s и удалить все супернатанта но 100 мкл без нарушения червь Пелле.
      Примечание: Используйте более высокие объемы PBST мыть червей у плиты, если делать высок объём окрашивание. Не мойте червей в PBST более чем за 15 мин до фиксации образцов. Сделайте дополнительные автомойки, если супернатант не очищается от бактерий. Осуществляют инкубации в 40% изопропиловый спирт, с помощью nutator или рокер. Всегда контролировать трубы, чтобы убедиться, что происходит полный пример агитации.
  4. Липидов, окрашивание с Оро
    1. Добавление Оро 600 мкл рабочего раствора для каждого образца. Инвертировать трубу в три раза и перемешать червей в Оро.
    2. Поворот образцов 30 об/мин – 2 ч при комнатной температуре.
    3. Центрифугуйте образцы на 560 x g за 1 мин и ликвидации всех супернатанта но 100 мкл.
    4. Ресуспензируйте образцы в 600 мкл PBST и поверните трубы на 30 об/мин за 30 минут, чтобы удалить избыток Оро пятно.
    5. Центрифугуйте образцы на 560 x g за 1 мин и ликвидации всех но 50 мкл супернатант.
    6. Чтобы лучше различать местоположения животного микрофлорой и кишечные клетки, пятно ядер, добавив 1 мкл (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-индол-6-carboxamidine) (DAPI) для каждого 1 мл Оро рабочего раствора. Осуществляют Оро пятнать 2 h с добавлением DAPI до монтажа слайды для изображений. Кишечные ядер больше по размеру и Гонада отличается развивающихся зародышевых клеток.
      Примечание: После окрашивания Оро, черви могут придерживаться стороны отцентрифугировать трубки и не формируют заметно Пелле. Если это произойдет, центрифуга черви снова или разрешить червей урегулировать самотеком по крайней мере 10 минут.
  5. Подготовка слайдов для визуализации червь
    1. Ресуспензируйте червей в оставшихся супернатант и хорошо перемешать раствор.
    2. Поставьте 5 мкл суспензии червя на микроскопа и место coverslip тщательно, обеспечение не воздушные пузыри форме.
    3. Уплотнение coverslip с ногтей и изображения червей.
      Примечание: После фиксации и окраски, черви может быть очень жесткой и трудно Пипетка. Чтобы обойти это, делают широкий родила пипетки, отрезав их советы.
    4. Храните слайды в микро центрифуга стойку на 4 ° C до 24 часов, если не изображений сразу же после окрашивания.
  6. Визуализационная диагностика Оро окрашенных червей
    1. Используете цвет способный камеру для изображения Оро окрашенных червей.
    2. Используйте 5 X увеличение изображений несколько червей в одном поле зрения.
    3. Переключитесь в 10-кратном для лучшего изучения отдельных червей.
    4. Экспорт изображений в формате TIF, чтобы избежать потери данных из-за сжатия.
      Примечание: Если окрашивание с Оро + DAPI, переключите цвет способный камеру в один, который может захватить флуоресценции.
  7. Анализ изображений Оро окрашенных червей
    1. Загрузите micrograph(s) ImageJ. В раскрывающемся меню Плагины используйте функцию био-форматов, если файл изображения не распознается.
    2. В раскрывающемся меню изображения, под функцию стеки используйте изображения для стека для создания стека изображений при сравнении нескольких микроскопии.
    3. Отрегулируйте Яркость/контраст под же выпадающее меню для улучшения видимости капелек липидов.
    4. Классификация изображений по накопление липидов на протяжении всего тела животного или в определенных тканях.
    5. Для лучшей оценки липидного локализации и для идентификации изображения неспецифической артефактов с помощью ImageJ выберите функцию цвета в раскрывающемся меню изображение и нажмите на стек в RGB для отображения сигналов каждого компонента RGB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SKN-1 является bZip, цитопротективных транскрипционный фактор, который разделяет гомологии с млекопитающих NRF2 и было показано, что посредником окисление жирных кислот. В зависимости от концентрации глюкозы в их диете черви с аллеля конститутивно активированные skn-1 показывают уровень различных липидов при окрашенных с Нил красный7. Рисунок 1A -C показывает активированные skn-1 животных, подвергшихс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рост ожирения и метаболических заболеваний ставки делает C. elegans подходящую модель для изучения механизмов, которые регулируют накопление жира в клетках и тканях. Последние данные свидетельствуют о том, что изменения в уровне липидов коррелируют с клеточных процессов, начиная от инсулина, сигнализации8, активации гормон рецепторов2, чтобы репродуктивные выход5. По сравнению с этикетки бесплатно микроскопии и методы хроматографии, Нил крас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа стала возможной благодаря гранта NIH: R01GM109028 (S.P.C.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Imager.M2m МикроскопZeissn/aФлуоресцентный микроскоп
ERC5s камераAxiocamn/aЦветная
MRm камераAxiocamn/aФлуоресцентная камера
NileThermo FisherN1142Lipid Stain
Oil Red OAlfa Aesar A12989Lipid Stain
DAPIThermo FisherD1306Окрашивание ДНК
Изопропиловый спиртBDHBDH1133-1LPФиксирующий раствор
0,2 &; m сетерил шприц фильтрVWR28145-477Ацетатный целлюлозный фильтр
Центрифуга 5430Eppendorf5428000015Центрифуга
Шейкер ГрильLab Quake400110Q
Шейкер Трубка ВращательVWR10136-084Ротатор
K2HPO4Sigma-Aldrich7758-11-4NGM
KH2PO4Sigma-Aldrich7778-77-0NGM
MgSO4AlfaAesar7786-30-3NGM
CaCl2Sigma-Aldrich10035-04-8NGM
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
NGM холестеринSigma-Aldrich57-88-5NGM
ПептонBD Biosciences211677NGM
АгарТекноваL9110NGM
LB средаSigma-AldrichL3147Бактериальный рост
red

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  2. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
  3. Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , BIOS Scientific Publishers. (2002).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
  5. Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
  6. Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
  7. Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
  8. Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
  9. Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
  10. Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810(2010).
  11. Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164(2013).
  12. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
  13. Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
  14. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lipid Abundance QuantificationLipid Distribution EvaluationNile Red StainingOil Red O StainingC elegans Lipid MetabolismImageJ Micrograph AnalysisWorm PermeabilizationPBST WashingCentrifugation ProtocolFluorescence Intensity Measurement

Похожие статьи