JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience

Отслеживание дрозофилы личиночной поведение в ответ на Optogenetic стимуляции обонятельных нейронов

Published: March 21, 2018
doi:
10.3791/57353
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, , , , , ,
1Department of Biology, MS-0314,University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program,University of Nevada

Summary

Этот протокол анализирует навигационных поведение дрозофилы личинка в ответ на одновременное optogenetic стимуляции обонятельных нейронов. Свет 630 Нм длины волны используется для активации отдельных обонятельных нейронов, выражая родопсин смещается красный канал. Личинок движение одновременно отслеживается, цифровой записали и анализируются с помощью пользовательской программы.

Abstract

Насекомых способность перемещаться к запах источников основывается на деятельности их первого порядка обонятельных рецепторов нейронов (ORNs). Хотя значительный объем информации был создан относительно Орн ответы для отдушки, роль конкретных ORNs в автошколах поведенческих реакций по-прежнему осознаются. Осложнения при анализе поведения возникают из-за различных неустойчивого характера отдушки, активировать отдельные ORNs, несколько ORNs, активированную одного отдушки и трудности в репликации естественно наблюдаемых временной вариации в обонятельные стимулы с помощью методы в обычных запах доставки в лаборатории. Здесь мы описываем протокол, который анализирует дрозофилы личиночной поведение в ответ на стимуляцию одновременное optogenetic его ORNs. Optogenetic технология, используемая здесь позволяет специфики Орн активации и точный контроль временных моделей активации Орн. Соответствующее движение личинок отслеживается, цифровой записали и анализируются с помощью пользовательских письменного программного обеспечения. Заменив запах раздражителей с легкими раздражители, этот метод позволяет для более точного управления отдельных Орн активации с целью изучения ее влияния на личиночной поведение. Наш метод может быть продлен для изучения воздействия второго порядка проекции нейронов (ПНС) а также местные нейронов (LNs) на личиночной поведение. Таким образом, этот метод позволит всеобъемлющий рассечение обонятельных цепи функции и дополнять исследования как обонятельных нейронов деятельности перевести в поведение ответов.

Introduction

Обонятельной информации в среде larva дрозофилы воспринимается только 21 функционально различных ORNs, деятельность которого в конечном итоге определяют поведение личинок1,2,3,4. Тем не менее относительно мало известно о логике, в которой сенсорная информация кодируется в деятельности этих 21 ORNs. Таким образом, существует необходимость экспериментально определить функциональный вклад каждой личиночной Орн поведение.

Хотя сенсорные ответ профиль весь репертуар дрозофилы личинок ORNs изучалось в деталях1,4,5, вклад отдельных ORNs контуре обонятельных и тем самым навигационных поведение по-прежнему во многом неизвестным. До настоящего времени, возникают трудности в личиночной поведение исследования, из-за неспособности пространственно и временно активировать одного ORNs. Группа отдушки, который специально активировать 19 21 дрозофилы личинок ORNs был недавно описан1. Каждый одоранта в панели, при низких концентрациях, вызывает физиологический ответ только от его родственных Орн. Однако при более высоких концентрациях, которые обычно используются для обычных поведение анализов, каждый одоранта вызывает физиологические реакции от нескольких ORNs1,5,6. Кроме того отдушки в этой панели менялись нестабильности, которые усложняют интерпретации поведения исследований, которые зависят от формирования стабильных запах градиенты7,8. Наконец естественно происходя запах стимулы имеют временной компонент, который трудно воспроизвести в лабораторных условиях. Поэтому важно разработать метод, который можно измерить личиночной поведение при одновременно активации отдельных ORNs образом пространственных и временных.

Здесь мы демонстрируем, что метод, который имеет преимущества по сравнению с ранее описанных личиночной отслеживания assays1,8. Assay отслеживания, описанных в Gershow et al. использует электронно управляемые клапаны для поддержания стабильной градиент запаха в поведение Арена8. Однако из-за уровня комплексный инжиниринг участвует построить установки стимул запах, этот метод является трудно воспроизвести в других лабораториях. Кроме того остаются нерешенными вопросы, связанные с использованием отдушки специально активировать одного ORNs. Assay отслеживания, описанные в Мэтью et al. использует простую систему доставки запах, но результирующий градиент запаха зависит от волатильности тест одоранта и неустойчива для длительного времени пробирного1. Таким образом заменив запах раздражителей с легкими раздражители, наш метод имеет преимущества специфичности и точный временной контроль Орн активации и не зависит от формирования запах градиентов различные сильные.

Наш метод прост в настройке и подходит для исследователей, заинтересованных в измерении аспекты дрозофилы личиночной навигации. Эта техника могут быть адаптированы к другим системам модель, условии, что исследователь имеет возможность управлять выражение CsChrimson в neuron(s) свои любимые системы выбора. CsChrimson версия перешел красного канала родопсина. Он активируется на длинах волн, которые являются невидимыми для личинок Фототаксис системы. Поэтому мы можем манипулировать активность нейронов с9специфика, надежность и воспроизводимость. Путем изменения пользовательских письменного программного обеспечения для учета изменения размера субъектов, этот метод может быть легко адаптирована для обхода личинки других видов насекомых.

Protocol

1. Создание поведение Арена и подготовку оборудования для стимуляции Optogenetic на арене поведение Чтобы построить лишен света поведение Арена, построить коробку с измерением 89 x 61 x 66 см3 (35″ L х 24″ W x 26″ H) из черного плексигласа Цветные акриловые листы (толщиной 3 мм) (см. Таблицу материалы). Материалы для строительства такой коробки должны быть доступны в местных магазинах. Поместите это поле на вершине таблицы в зале поведение (рис. 1А). Гора, монохромный USB 3.0 ПЗС-камеры оснащены фильтром ИК Лонг перевал 830 нм и 8 мм F1.4 C-креплением (см. Таблицу материалы) в центре потолка черный ящик. Место два инфра красный светодиод полосы (см. Таблицу материалы) на столе-чтобы осветить личинок в Темный Арена (рис. 1A). Для создания платформы LED, получите 22 × 22 см квадратных алюминиевых пластины (предпочтительно спрей окрашены в матовый черный, чтобы устранить любые размышления). В центре пластины, с помощью металлической фрезы вырежьте отверстие, достаточно большой, чтобы соответствовать вокруг камеры на ПЗС. Металлическая крышка с красный светодиод газа (см. Таблицу материалы). Припой провода светодиодные полосы в серии и подачи газа провода в Оптрон реле, контролируется микропроцессором 2B Raspberry Pi (см. Таблицу материалы) (рис. 1B и 2). Установка и настройка Ubuntu мат/Raspian Джесси/Linux на основе операционной системы на процессоре Raspberry Pi перед подключением Оптрон реле для Светодиодных лент. Прикрепить источник питания для Светодиодных лент и Оптрон (рис. 2) (см. Таблицу материалы). Смонтируйте Светодиодные платформы вокруг CCD камеры (рис. 1Б).Примечание: Ubuntu Мате v16.04 операционная система свободно доступна. Набор простых команд Python основе может быть легко адаптирована к программе моделей Светодиодные света раздражителей (см. файл синтаксиса). Обеспечения однородной освещенности в различных точках в области поведения. Измерить абсолютное излучения на поверхности арены с помощью спектрометра и определить его ~1.3 Вт/м2 по всей поверхности арены.Примечание: В интенсивности, никаких существенных изменений были замечены температуры в течение экспериментов. Другое исследование10 используется выше излучения ~1.9 Вт/м2 и отмечено никаких изменений температуры в течение экспериментов. 2. Подготовка дрозофилы личинок для анализа поведения Поддерживать мух на стандартных покупать продовольствие (см. Таблицу материалов) при 25 ° C, 50-60% RH и 12 h/12 h свет/темно цикла. Для того чтобы выразить CsChrimson в одной паре ORNs, крест девственной женщины от UAS-ИВС-CsChrimson линия для мужчин от линии OrX-Gal4 («X» соответствует одному из 21 личиночной запах рецепторов (или) генов, которые однозначно выражена в каждом из 21 пар ORNs)9,11. Попеременно чтобы выразить CsChrimson в всех 21 личинок ORNs, крест девственной женщины от UAS-ИВС-CsChrimson линия мужчины от линии Орко-Gal4 («Орко» является ко-рецептор, который выражается в всех 21 ORNs). Используйте линии UAS-ИВС-CsChrimson сама по себе как элемент управления в этих экспериментах.Примечание: Летать запасов, перечисленные здесь все доступны в центре фондовой дрозофилы Блумингтон (см. Таблицу материалы). После того, как мужские и женские мух в крест разрешено спариваются и откладывают яйца в течение 48 часов, передать свежие флакон взрослых. К поверхности флакона пищи, содержащие яйца 400 мкл смеси, содержащие 400 мкм все транс ретиналь (ATR) растворяют в диметилсульфоксида (ДМСО) и 89 мм сахарозы, растворяют в дистиллированной воде.Примечание: Небольшое количество сахарозы способствует личинок кормления ATR решения. АТР является кофактора для upregulating CsChrimson выражение9,10. АТР является светочувствительный. После того, как ATR добавляется к продовольственной флаконы, содержащие яйца, Инкубируйте флаконов в темноте еще 72 ч.Примечание: Хотя это исследование и выше двух исследований не наблюдалось воздействие на личиночной поведения из-за кормления ATR, рекомендуется контролировать последствия ATR кормления, подвергая тестирования линии то же количество выше смеси, которая не содержит ATR. Извлечь третьего возраста личинок (~ 120 h после откладки) от поверхности покупать продукты питания, плавающие их с помощью раствора сахарозы высокой плотности (15%). С помощью P1000 микропипеткой отдельные личинки, плавающей на поверхности раствора сахарозы в стеклянный стакан 1000 мл. Вымойте личинки 3 – 4 раза путем обмена свежими 800 мл дистиллированной воды в стеклянный стакан каждый раз. Разрешить личинок на отдых за 10 мин до подвергая их поведение assay. 3. поведение Assay Поддержание постоянной температуры (между 22-25 ° C) и влажности (между 50 и 60% RH) в зале поведение. Подготовьте личиночной обхода среднего лить 150 мл растопленного агарозы (1,5%) в 22 x 22 см квадрат Петри. Одна чашка Петри заливается для каждого разбирательства assay, 8 – 10 испытаний на эксперимент. Разрешить агарозы затвердеть и охладить в течение 1-2 ч в чашках Петри перед их использованием в assay поведение. Передача не более чем 20 prepped личинок третьего instar центр Петри (рис. 1C). Обложка Петри блюдо с крышкой. Место на Петри блюдо в арену поведение под камеры на ПЗС.Примечание: В зависимости от эксперимента, поведение анализов обычно осуществляется за 3-5 мин. Если одоранта используется в assay для предоставления руководства подсказок, было отмечено, что результирующий градиент запах остается стабильным для около 5 мин1. Не рекомендуются пробирного раза дольше. Пагубное влияние на личинок из-за обезвоживания или от длительного 630 нм красный свет воздействия не наблюдались в эти моменты времени. Поверните на 850 нм инфра красный светодиодный источник света для визуализации личинок в видео. Запустите CCD камера для записи личиночной движения. Использование программного обеспечения, связанное с процессором Raspberry Pi, программа процедура администрирования соответствующие шаблоны стимуляции красный свет.Примечание: Набор простых команд Python основе может быть легко адаптирована к программе моделей Светодиодные света раздражителей (см. файл синтаксиса). 4. обработка и анализ данных Импортируйте видеозаписи каждого судебного разбирательства в любых доступных программирования как Matlab. Получите координаты XY каждый личинка в фильме как функцию от времени. Основываясь на пределы отслеживания программного обеспечения, 15 – 20 третьего возраста личинки могут быть отслежены в одном фильме1,8.Примечание: Предоставляется набор простых кодов Matlab («Tracklarva»), которые могут быть легко адаптированы для соответствующих условий (см. файл синтаксиса). Эта программа сочетает в себе все испытания в эксперименте и выводит XY координаты каждого личинка на весь срок анализа (см. ниже синтаксис кода). Кроме того можно было бы использовать несколько открытым исходным кодом на основе программ, которые свободно доступны для исследователей. Например JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12. Используйте созданный XY координаты участок личиночной траекторий и далее анализировать личиночной локомоции. Для анализа поведения используйте навигационные статистические данные, такие как скорость, кривизны путь, заголовок угол, сегмент индивидуальных траекторий личинок в чередующихся последовательностей бежит и поворотов. Бежит определяются как непрерывные периоды движение вперед. Повороты отдельных последовательных запусков. Повороты помечаются при изменения траектории ориентации углы были > 45° (см. файл синтаксиса). Вычислять средние значения для запуска скорость, запустите длину, выполнения направление и другие параметры при необходимости.Примечание: Предоставляется набор простой синтаксис для извлечения из личиночной траекторий «работает» и «останавливается» (см. файл синтаксиса). Простые Matlab или Excel на основе функций могут быть применены к извлеченных данных для вычисления значений для «запуска скорость», «запуск длина» и т.д. Представления данных для каждой поведенческой метрики, как означает ± SEM.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать специфика Орн активации, наш метод успешно применяется для определения влияния двух различных Орн (ORN::7a & ORN::42a) (ORNs, Or7a или Or42a) активации на личиночной поведение (рис. 3). В соответствии с недавними исследованиями, что отдельные л?…

Discussion

Здесь мы описал метод, который позволяет для измерения дрозофилы личиночной поведения в ответ на одновременное optogenetic активации обонятельных нейронов. Ранее описанный личиночной отслеживания методы1,8 использовать технологии доставки различных за…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддерживается путем запуска средства от Университет Невады в Рено, NIGMS национального института здравоохранения под номер гранта P20 GM103650.

Materials

Video camera to capture larval movement
CCD Camera  Edmund Optics 106215
M52 to M55 Filter Thread Adapter Edmund Optics 59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses  Edmund Optics 59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass Filter Edmund Optics 46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2B RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supply newegg.com 9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relay amazon.com 6454319
630nm Quad-row LED strip lights environmentallights.com red3528-450-reel
850nm LED strips environmentallights.com wp-4000K-CC5050-60×2-kit
Software 
Matlab Mathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04 Nubuntu https://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylic Home Depot MC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly food Genesee Scientific 66-112
Agarose powder Genesee Scientific 20-102
22cm X 22cm square petri-dish VWR Inc. 25382-327
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
All trans-retinal Sigma-Aldrich R2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center 55134
Orco-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 26818
Or42a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 9970
Or7a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 23907
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Tags

Drosophila LarvaOptogenetic StimulationOlfactory NeuronsBehavior ArenaCCD CameraInfrared LEDLED PlatformRaspberry PiCsChrimsonORX-GAL4

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Clark, D. A., Kohler, D., Mathis, A., Slankster, E., Kafle, S., Odell, S. R., Mathew, D. Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57353, doi:10.3791/57353 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image