Методическая статья

Электропроводящий эшафот чтобы модулировать и доставить стволовых клеток

DOI:

10.3791/57367

⸱

13 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Stanford Stroke Center and Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает изготовление системы культуры клетки позволяют посева стволовых клеток на леске проводящего полимера в vitro электрической стимуляции и последующих в vivo имплантации с помощью стволовых клеток посеян эшафот Миниинвазивная техника.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапия стволовой клетки стала интересной инсульта терапевтического, но метод оптимального доставки остается неясным. Хотя техника микроинъекции был использован на протяжении десятилетий доставить стволовых клеток в ход модели, этот метод ограничен отсутствием способность манипулировать стволовые клетки до инъекции. Этот документ подробно описывает метод с использованием электропроводных полимеров леску для доставки стволовых клеток. Электрической стимуляции стволовых клеток с использованием проводящих полимеров леску изменяет гены стволовых клеток, участвующих в выживание клетки, воспалительной реакции и синаптическую ремоделирования. После электрические предварительной подготовки, стволовые клетки на эшафот интракраниально пересаживают в мышиной модели окклюзии дистального средней мозговой артерии. Этот протокол описывает мощный метод манипулировать стволовые клетки через проводящего полимера леску и создает новое средство для дальнейшего развития на основе стволовых клеток лечение.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инсульт является второй ведущей причиной смерти в мире и пятой ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах. Несмотря на эти высокие показатели смертности лечение инсульта восстановление в настоящее время остается проблема не жизнеспособным медицинской вариантов имеющихся в настоящее время1. В настоящее время около 300 клинических испытаний, занимающихся ишемических инсультов, из которых только 40 использовать стволовые клетки. Предыдущие исследования показали, что терапия стволовой клетки имеют положительное влияние на ход ремонта2,3. Паракринными такие факторы, как мозг нейротрофического фактора (BDNF) и Тромбоспондин-1 (THBS-1) освобожден от пересаженных человека нейронных прародитель клеток (hNPCs) показали улучшение функционального восстановления через механизмы, связанные с увеличением СИНАПС формирования, ангиогенез, дендритных ветвления и новые аксональное прогнозы, а также модуляции иммунной системы4,5,6. Однако методы оптимального доставки стволовых клеток остаются недостижимой.

Проблемой остается доставки успешно стволовых клеток головного мозга. В настоящее время доставить стволовые клетки были введены инъекционные гидрогеля и полимерные строительные леса. Эти методы доставки защиты во время трансплантации стволовых клеток, а также обеспечивают защиту от суровой окружающей среды после инсульта, включая хозяина воспалительной реакции и гипоксических условий7,8,9 , 10. Однако, наиболее часто используемые материалы инертные, который ограничивает использование непрерывной модуляции (то есть, электрической стимуляции) клетки11. Электрическая стимуляция — это подсказка, которая влияет на дифференциации, плотность каналов иона и neurite нарост стволовых клеток12. По сравнению с инертные полимеры проводящие полимеры могут нести текущего позволяя для электростимуляции и манипуляции стволовые клетки2. Однако точный механизм, по которому электрической стимуляции модулирует нейротрофических факторов выпуска (т.е., BDNF и THBS-1) еще не полностью изучены.

В этом протоколе мы описывают шаги для построения клеток культуры системы, состоящей из проводящего полимера леску, политиофен (PPy), что позволяет в vitro электрической стимуляции. Из-за манере, в которой изготовлен в системе культуры клеток последующие Вживление стволовых клеток посеян леску на пери-при инфаркте мозга возможна. Для этой системы мы электрически предпосылкой стволовых клеток на эшафот за короткий период времени до имплантации. После электростимуляции проводящего полимера эшафот, перевозящих клетки успешно имплантируется интракраниально минимально инвазивным методом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все стволовых клеток и животных процедуры были утверждены Комитетом по надзору исследования стволовых клеток Стэнфордского университета и административной группой Стэнфордского университета на лабораторных животных уход (SCRO-616 и APLAC-31909).

1. травление стекла ITO

  1. Подготовьте Индий оксид олова (ИТО)-крытая стеклянное скольжение, поместив маскирующий агент проводящих стороне стекла.
    Примечание: Большинство коммерческих прозрачная лента может использоваться как маскирующий агент.
    1. Удалите излишки маски с помощью лезвия, оставив только желаемую форму окончательного дизайна Ито распространяется на стекле.
  2. Комбинат 5% (v/v) азотной кислоты и 45% (v/v) HCl в стеклянный стакан внутри зонта для приготовления раствора травления.
    1. Использование горячей плите и термометр для сохранения температуры травления раствор в 70 ° C.
  3. После травления решение достигает 70 ° C, место масках ITO стекла слайд в раствор для 2 минут, чтобы удалить избыток слой Ито.
    Примечание: Ленты маскирующие защищает слой Ито от воздействия кислотного раствора.
  4. Удалить слайд из раствора и промыть его с дейонизированной (DI) H2O.
  5. Осторожно удалите маску и мера сопротивления с помощью мультиметр для обеспечения того, чтобы оставшиеся Ито нетронутыми. Индикация желаемого травлению области должно быть приблизительно 0 Ω.

2. Приготовление раствора пиррол

  1. В 1000 мл стеклянной бутылке растворяют 70 г натрия dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) в 600 мл ди H2O.
  2. Как только NaDBS растворяется, добавьте в решение 14 мл 0,2 М пиррол и 386 мл ди H2O.
  3. Охватывать решение с алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C.

3. гальванические из политиофен на стекла ITO

  1. Теплый пиррол решение до комнатной температуры, до тех пор, пока NaDBS полностью перерастворить.
    Примечание: Это занимает около 15-20 минут.
  2. Налейте в стакан 25 мл раствора пиррол.
  3. Подключите травления стекла ITO к мультиметр и погрузите слайд в пиррол раствор.
    1. Убедитесь, что на сторону с 0 Ω сопротивление обращена электрод сравнения платиновой сетки.
  4. Применение электрического тока инициировать гальванического PPy на поверхности Ито, с помощью мультиметра (в настоящее время контролируется на 3 мА/см2 на 4 часа).
  5. Удаление стекла ITO от мультиметра и мыть гальваническим PPy ди H2O для удаления остаточного ПАВ.
  6. Аккуратно отсоедините гальваническим PPy пластина из стекла ITO, с помощью лезвия бритвы.
    1. Магазин PPy пластины при комнатной температуре.

4. Подготовка полидиметилсилоксан (PDMS)

  1. С помощью шпателя и весят блюдо, смешать 18 g базовых агента с 2 g отвердителя и вылейте смесь в формы стекла два 10 х 8 см.
  2. Удалите пузырьки из формы, с помощью вакуумной камере для 15-20 минут.
  3. Место формы в 70 ° C духовке 3 часа.
  4. После охлаждения, используйте плоский шпатель для удаления PDMS из формы.

5. Изготовление палаты в Vitro электростимуляции

  1. Автоклав металлических пластин (WxL, 2,5 см x 12.5 см) и поток клапаны на 120 ° C за 1 час.
  2. С помощью камеры слайд как шаблон, вырежьте две части PDMS.
    Примечание: Одна часть PDMS служит по периметру ячейки камеры с вырезами две смежные квадраты из внутри клетки камеры. Другая часть PDMS является изложение палаты периметра.
    1. Вырезать внутри клеток камеры так что это квадратные формы и соответствует по форме ячеек камеры. Убедитесь, что общая форма обеих частей PDMS прямоугольные и совпадает с камеры слайд.
  3. Слоя материалы как снизу вверх: (1) металлические плита, (2) PDMS (без вырезов), (3) PPy плиты (перпендикулярно PDMS), (4) PDMS (с вырезами) и камера (5) клеток.
  4. Зажим аппарат вместе, как только он полностью выравнивается.
  5. Вырезать две 60 см кусочки металлической проволоки и использовать серебряные пасты для присоединения один провод к каждому концу PPy пластина, которая выступала от внешней камеры. Убедитесь, что провода достаточно долго, чтобы продлить из аппарата за пределами инкубатора.
  6. После того, как вылечить серебряная паста, усиливают и уплотнение проводное соединение с эпоксидной.
    1. Запись сопротивления с помощью мультиметра чтобы убедиться, что поле прикладной является то же самое в каждой камере.
    2. Для имплантации удалите провода; Разожмите ячейки камер и PDMS и затем их отдельно от проводящего эшафот. Измерении имплантированных подмостей — около 1 мм x 3 мм x 0,25 мм.

6. покрытие нейронных прогениторных клеток человека (hNPCs) на PPy

  1. Стерилизуйте сборных камер под УФ светом на 2 часа.
    1. После 1 часа, вращать собравшихся палат 90°.
  2. После стерилизации покрыть поверхность PPy в нижней части камеры с 800 мкл покрытие субстрата и позволяют субстрат для закрепления на PPy табличке в инкубаторе при 37 ° C на 5% CO2 на 1 ч.
  3. После 1 часа удалить супернатант из камер и осторожно промойте с 1 мл DPBS + Ca и Mg на хорошо.
    Примечание: Избегайте мытье поверхности PPy решительно, как это вызовет отряд покрытие субстрата.
  4. Используя свежие клетки СМИ, механически отделить культивируемых клеток для использования с камерами от культуры ткани пластины с нежным закупорить.
    Примечание: Клетки должна быть 90-100% притока при диссоциации.
  5. Собрать hNPC гранул с помощью центрифугирования в 8000 x g за 5 минут.
  6. С помощью Горяева, рассчитывать и Ресуспензируйте клетки на объем 100000 клеток/см2.
  7. Пластина 100000 клеток в каждой камере хорошо (100000 клеток/см2 в 1 мл СМИ).
  8. Возвращение камеры в инкубатор при 37 ° C на уровне 5% CO2.

7. Электрическая стимуляция hNPCs

  1. Один день после посева клетки на камеры, использовать генератор сигнала для применения электрической стимуляции клеток.
  2. До стимуляции удалите старые средства массовой информации из каждой камеры хорошо и пополнить с 800 мкл свежих средств массовой информации.
  3. После того, как средства массовой информации меняется, установите камеры обратно в инкубатор, расширять провода из инкубатора и прикрепить их к генератор сигнала
  4. Стимулирование применить к ячейкам с прямоугольной волны сигнала на ±400 мВ с 100 Гц для 1 h.
  5. После стимуляции удалите провода и инкубировать камер на другой день в инкубаторе набор при 37 ° C с 5% CO2.
  6. Выполнение последующих биологического анализа, включая жизнеспособность клеток и количественных реального времени полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) после производителя протокол.

8. в Vivo PPy имплантации

  1. Выполнение модели инсульта окклюзии дистального средней мозговой артерии (dMCA) на Т клеток недостаточным взрослых крыс мужской обнаженной (NIH-РНЕ 230 ± 30 g) как описано выше2. Выполните имплантации одну неделю пост dMCA окклюзии.
  2. Один день до операции, дать крысы в их клетке воды ампициллин (1 мг/мл).
  3. Анестезировать крыса в камеру всасывание с помощью 0,5 - 3% мг/кг изофлюрановая через вдыхание.
  4. Подтвердите анестезии крысы, отсутствие мыс щепотку рефлекторной реакции.
    1. В то время как животное под наркозом, продолжать следить за ее цвет мембраны, ритм дыхания и ректальной температуры каждые 15 минут.
  5. После подтверждения анестезии, примените искусственные слезы на глазах крыса для предотвращения сухости.
  6. Обеспечить поддержание асептической техники во время этой процедуры с помощью стерильных перчаток и стерильные хирургические Пелерина13. Стерильные хирургические инструменты держите в поле стерильным.
  7. В то время как крыса под наркозом, дрель Краниэктомия выше левой коры. Откройте Дура.
    1. Удаление твердой мозговой оболочки из мозга с помощью микро тонкий Хирургические иглы.
  8. Имплантат проводящих подмости от в vitro систему крысиный коры.
    Примечание: Для наших экспериментов, мы имплантированном подмости от в пробирке 3 день после hNPC покрытие.
    1. Место имплантат главным образом на полутени коры медиальнее поражения инсульта.
  9. После того, как леска помещается, место surgicel над имплантатом для предотвращения движения с закрытием кожи.
  10. Шов раны закрыты и подкожно вводить крыс с бупренорфин SR в дозе 1 мг/кг для управления боли, связанные с стереотаксической хирургии и dMCA окклюзии.
  11. Поместите крыса в клетке восстановления, как он приходит в сознание.
    1. Никогда не оставляйте животное без присмотра, пока он находится в бессознательном состоянии.
    2. Не размещайте животное с другими, до тех пор, пока она полностью получила сознания.
  12. Мониторинг животных ежедневно для признаков боли в том числе потеря массы тела, снижение питания/водозабора, снижение груминг/неопрятный пальто, повышенного/снижение спонтанной активности, ненормальное положение, обезвоживания/кожи палаток, запавшие глаза, скрываться, членовредительство, учащенное дыхание, открытым ртом, дыхание, твичинг, дрожь, тремор и вокализации.
    1. Мониторинг животных ежедневно до тех пор, пока кажется, что они еды, питья, груминг и набирает вес; и затем еженедельно после увеличения веса.
  13. Ранние euthanization CO2 при вдыхании и вторичных подтверждение euthanization (чтобы обеспечить животное не возродится из-за нормального кислорода поставок должность CO2 ингаляции) будет происходить любое животное, которое представляется не есть, пить и набирать вес после первоначального хирургической процедуры; появляется боль; или появляется не в состоянии завершить поведенческие тесты из-за большего, чем ожидалось дефицит мотор коры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема, показанный на рисунке 1 представляет общий процесс электрической стимуляции hNPCs и потенциальных нисходящие приложения. Текущее ограничение в клеточной терапии является, что стволовые клетки подвергаются суровой окружающей среды после трансплантации, включая воспаление и ишемического условий. Эти трудные условия могут ограничить их терапевтическую эффективность14,15. Использование проводящего ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущих доказательств показал обещание стволовых клеток как Роман ход терапии. Это обещание привела к значительные усилия для продвижения в постели с по меньшей мере 40 текущих или завершенных клинических испытаний клеточной терапии. Инсульта патологии предлагает уникальный неврологические расстройства, что поддается терапии стволовой клетки, потому что после острого оскорбление, не существует нейродегенеративных процесса предотвращения восстановления. Точный механизм стволовых клеток расширение инсульта восстановления ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить с этой работой.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р Kati Andreasson (Кафедра неврологии и неврологических наук, Стэнфордский университет) для использования машины qRT-PCR. Работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов K08NS098876 (для P.M.G.) и Стэнфордский Школы медицины Дин докторской стипендии (B.O.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
FGF-BasicInvitrogenCTP026120 нг/мл для рабочих сред
MatrigelCorningcb40234a1:200 разбавление
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µ г/мл)EMD MilliporeLIF101010 нг/мл для рабочих сред
Силгард 184 силикон 3,9 кгFisherbrandNC0162601
Соляная кислотаFisherbrandSA56-4
сертифицированный) ACS, Fisher ChemicalFisherbrandSA95
ITO GlassDelta TechnologiesCG-40IN-0115
Додецилбензолсульфонат натрияSigma289957-1KG
ПирролSigma131709-500MLЗащитный раствор пиррола от света и комнатной температуры
8 лунок стеклянных камерThermo Sci Nuc 125658Отсоедините камеру клетки и храните ее в стерилизованных условиях
Кронштейн с плоской поверхностью, 3 x 1 дюймMcMaster-Carr 1030A4
ДВУХКОМПОНЕНТНАЯ СЕРЕБРЯНАЯ КРАСКА 14GЭлектронная микроскопия Наук 1264214Смешайте две части (1:1) в пластиковой пластине
DPBS, 1x, с Ca и Mg, без фенола RedGenesse 25-508C
AB2 ArunA Набор сред для культуры нейронных клетокAruna Biomedical ABNS7013.2
hNP1 Набор для расширения нейронного предшественника человекаAruna Biomedical   hNP7013.1
Бесконтактный клапан регулировки расхода, никелированная латунь, для трубки от 3/32" до 5/8" наружный диаметрMcMaster-Carr 5330K22
МультиметрKeysight E3641A
Генератор волновой пеныKeysight33210A-10 МГц
Pt сеткиSigma-Aldrich 298107-425MGЭлектрод сравнения с размерами, 1x1 см
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Набор для обеспечения жизнеспособности/цитотоксичности, для клеток млекопитающихThermo Fisher Scientific L3224
BDNFThermo Fisher Scientific 
THBS1Thermo Fisher Scientific 
GAPDHThermo Fisher Scientific 
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106
QIAshredder (250)Qiagen79656
Набор ДНКазы без РНКазы (50)QIAGEN79254
iScript набор для синтеза кДНК, 100 x 20 и микро; L rxnsBIORAD1708891
TaqMan Gene Expression Master MixThermo Fisher Scientific 
7-8 недель, кобель, RNU RatsNCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk SutureeSutures.com683G
IsofluraneHenry Schein29405
V-1 Настольная система анестезии лабораторных животныхVetEquip901806
Surgicel Original Absorbable HemostatEthicon1952
Лабораторный стандартный стереотаксический прибор, RatStoelting51600
Kimberly-Clark Professional  Безопасные фиолетовые нитриловые стерильные смотровые перчаткиFisherbrand19-063-130
Стерильная простыняMedlineDYNJSD1092
Thermo Scientific  Рукоятка лезвия скальпеля из нержавеющей стали Shandon, удерживает No 20-25 лезвийFisherbrand53-34
Walter Stern Скальпельное лезвие серии 300Fisherbrand17-654-456
QuantStudio 6 Flex Система ПЦР в реальном времениThermo Fisher Scientific4484642
Frazier Микродиссекционный крючокHarvard Apparatus52-2706
Концентрат азотной кислоты (Hs02718934_s1Hs00962908_m1Hs02758991_g14369510

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  2. George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery. Biomaterials. 142, 31-40 (2017).
  3. Steinberg, G. K., et al. Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study. Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).
  4. George, P. M., Steinberg, G. K. Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
  5. Schabitz, W. R., et al. Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis. Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).
  6. Liauw, J., et al. Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).
  7. Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype. Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).
  8. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  9. Ballios, B. G., et al. A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation. Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).
  10. Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
  11. Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. Implant Biomaterials: A Comprehensive Review. World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).
  12. Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair. Front Hum Neurosci. 9, (2015).
  13. Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
  14. Abdelwahid, E., et al. Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair. Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).
  15. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  16. George, P. M., et al. Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics. Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).
  17. Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells. J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).
  18. Lopes, N., et al. Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling. Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).
  19. Ploughman, M., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats. Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).
  20. Baker, E. W., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model. Sci Rep. 7 (1), 10075(2017).
  21. Bacigaluppi, M., et al. Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes. J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroin vivoBDNF

Похожие статьи