Epicardium играет решающую роль в развитии и ремонт сердца, предоставляя клетки и факторы роста к стенке миокарда. Здесь мы описываем метод культуры клеток человека первичной эпикардиальной который позволяет исследование и сравнение характеристик их развития и взрослых.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляции и культуры клеток первичного эпикардиальной, производный от сердца человека взрослых и плода образцов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Epicardium, слой эпителиальных клеток, охватывающих миокарда, играет важную роль во время развития сердца, а также в ответе ремонт сердца после ишемического повреждения. При активации, эпикардиальной клетки претерпевают процесс, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT) предоставлять клеток к регенерации миокарда. Кроме того epicardium вносит через секреции основных паракринными факторов. В полной мере оценить регенеративный потенциал epicardium, требуется модель клеток человека. Здесь мы приводим романа ячеечная модель культуры для получения первичных клеток эпикардиальной производных (EPDCs) от человека взрослых и плода сердечной ткани. Чтобы изолировать EPDCs, epicardium расчлененный извне сердце образца и перерабатывается в одну ячейку подвеска. Далее EPDCs покрытием и культивировали в EPDC среде, содержащей ALK ингибитор 5-киназы SB431542 для поддержания их эпителиального фенотип. EMT индуцируется стимуляции с TGFβ. Этот метод позволяет, в первый раз, изучение процесса человеческого эпикардиальной EMT в контролируемых условиях и облегчает набирает больше проницательности в secretome EPDCs, которые могут помочь регенерации сердца. Кроме того этот единообразный подход позволяет для прямого сравнения эпикардиальной поведения человека взрослых и плода.
Введение
Epicardium, эпителиального пласта одной ячейки, что конверты сердца, имеет жизненно важное значение для развития сердечной и ремонт (обзор в Смитс et al. 1). вследствие порока развития, epicardium возникает от proepicardial орган, маленькая структура, расположенный на базе развивающихся сердца. Вокруг развития день E9.5 в мыши и 4 недели после зачатия в человека клетки начинают мигрировать из этой структуры цветная капуста и охватывают развивающихся миокарда2. Как только на одной эпителиальных клеток образуется слой, часть эпикардиальной клеток проходит эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT). В ходе EMT кле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты с образцами тканей человека были утверждены Комитетом по этике медицинский центр Университета Лейдена и соответствует Хельсинкской декларации. Все действия выполняются с стерильных оборудования в потоке культуры клеток кабинета.
1. Подготовка
- Подготовка среднего EPDC, смешивая Дульбекко изменение орла среднего (DMEM низким глюкозы) и среда 199 (M199) в соотношении 1:1. Добавить 10% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС, тепла, инактивированная 25 мин на 56 ° C) и дополнить с 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл. Предварительно теплой среде EPDC в ванну воды 37 ° C.
- Предва....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы приводим простой протокол для изоляции EPDCs от человека взрослых и плода сердечной ткани (рис. 1). Этот протокол использует легко доступном месте epicardium на внешней стороне сердца (рис. 1A). Пятнать ушных раковин сердца после рассечения демонстрирует, что РК1 + epicardium удаляется в то время как основной subepicardial внеклеточного матрикса и миокарда ткани остаются нетронутыми (Рисунок 1J
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем подробный протокол для изоляции и культуры первичной эпикардиальной клетки, полученные от человеческих сердцах взрослых и плода. Обширные характеристики этих клеток был ранее опубликованный17. Мы показали, что оба типы клеток можно сохранить как клетки эпителия булыжник как когда культивируемых с ингибитора киназы ALK5 SB431542. EMT является неотъемлемой частью эпикардиальной активации в vivo во время разработки и ответ после травмы. EMT могут быть изучены с помощью это.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование поддерживается организацией Нидерланды для научных исследований (НВО) (ВЕНИ 016.146.079) и LUMC исследовательских стипендий и AMS и Stichting Bontius LUMC (MJG).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дульбекко s модифицированный Eagle' s средний + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Средний 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10270-106 | |
| Трипсин 0,25% | Инвитроген | 25200-056 | |
| Пенициллин G Натриевая соль | Roth | HP48 | |
| Стрептомицина сульфат | Roth | HP66 | |
| Трипсин 1:250 из бычьей поджелудочной железы | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Желатин из свиной кожи | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Планшеты для культур 6 лунок | Greiner bio-one | 657160 | |
| Планшеты для культур 12 лунок | Corning | 3512 | |
| Планшеты для культур 24 лунки | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Merck | 102931 | |
| 100-1000&микро; L Фильтрованные наконечники для пипеток | Corning | 4809 | |
| 10 мл пипетка | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5 мл пипетка | Greiner bio-one | 606180 | |
| Чашка для клеточных культур 100/20 мм | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Или домашние и стерилизованные |
| пробирки Eppendorf 1,5 мл | Eppendorf | ||
| центрифужные пробирки 15 мл | Greiner bio-one | 188271 | |
| центрифужные пробирки 50 мл | Greiner bio-one | 227261 | |
| шприц 10 мл | Becton Dickinson | 305959 | |
| иглы 19 калибра | Becton Dickinson | 301700 | |
| иглы 21 калибра | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Ячеистые сита, 100 & микро; m | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ 3 | НИР D systems | 243-B3 | |
| Моноклональный антиактин, &альфа;-гладкие мышцы | Sigma | A2547 | |
| Антимышиный Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Фаллоидин | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Название< | strong>Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| Пипетка P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Контроллер пипетки | Integra | 155 015 | |
| Стереомикроскоп | Leica | M80 | |
| Микроскоп с инвертированным светом | Olympus | CK2 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5702 | |
| Водяная баня | GFL | 1083 |
Ссылки
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
