Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение потребления кислорода митохондрий в Permeabilized волокнах дрозофилы, используя минимальное количество ткани

11.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57376

⸱

7 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описан метод измерения потребления кислорода с помощью высокого разрешения respirometry в permeabilized thoraxes дрозофила. Этот метод требует минимальное количество ткани, по сравнению с классической митохондриальной изоляции технику и результаты, полученные более физиологически важны.

Аннотация

Плодовой мушки Drosophila melanogaster, представляет новые модели для изучения метаболизма. Действительно дрозофилы имеют структур гомологичных органов человека, обладают весьма сохранены метаболических и относительно короткий срок, что позволяет изучение различных основных механизмов в течение короткого времени. Это, однако, удивительно, что одним из механизмов, необходимых для клеточного метаболизма, митохондриальное дыхание, имеет не было тщательно расследовано в этой модели. Вполне вероятно, потому, что мера митохондриальное дыхание у дрозофилы, как правило, требует очень большого числа людей и полученные результаты не являются весьма воспроизводимость. Здесь описан метод, позволяющий точное измерение потребления кислорода митохондриальных, используя минимальное количество ткани от дрозофилы. В этом методе thoraxes разобрал и permeabilized как механически с острыми щипцами и химически с сапонин, позволяя различных соединений пересечь клеточной мембраны и модулировать митохондриальное дыхание. После permeabilization протокол выполняется для оценки способности различных комплексов транспортная система электронов (ETS) для окисления различных субстратов, а также их реакции на uncoupler и несколько ингибиторов. Этот метод предоставляет много преимуществ по сравнению с методами с использованием митохондриальной изоляции, как это более физиологически отношение, потому что митохондрии по-прежнему взаимодействия с другими компонентами клеточных и митохондриальных морфология сохраняется. Кроме того образец препараты быстрее, и полученные результаты весьма воспроизводимость. Сочетая преимущества дрозофилы как модель для изучения метаболизма с оценкой митохондриальное дыхание, важные новые идеи могут быть раскрынным, особенно когда мух испытывают различные экологические или патофизиологические условий.

Введение

Плодовой мушки Drosophila melanogaster, был использован как модельный организм для генетических исследований для более чем столетие1. Исследование этого организма не только привела к значительным фундаментальных знаний о сцепленный с полом наследования2, мутация ставка3, развитие нервной системы и определение судьбы клетки4, но также недавно стала ценный инструмент для изучения механизмов, присущих несколько таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона5,6. Кроме того это популярная модель для изучения процесса старения, как они могут быть подняты в большом количестве за короткий период времени и имеют короткий срок. Они также обладают гомологичных структур для человеческих органов, как сердце, oenocytes (гепатоцито подобных клеток), жир тела (аналогично функции печени и белой жировой ткани), инсулин производящ клетки (эквивалент клеток поджелудочной железы β), а также Гемолимфа транспортировки метаболитов (аналогично крови позвоночных)7. Кроме того Центральный путей промежуточного метаболизма (включая инсулин/инсулин подобный фактор роста как сигнальный путь и цель Rapamycin-Тор пути), также являются весьма сохраняется7. По этим причинам дрозофила недавно использовались для описания основных механизмов, которые контролируют метаболизм, особенно в патологических условиях присущие человеческой метаболических заболеваний, таких как диабет8. Одним из основных компонентов метаболизма является митохондрий, которая интегрирует множество путей и выполняет один из наиболее важных биологических функций жизни, производства АТФ, через процесс окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Учитывая их центральную роль в метаболизме организма это не удивительно, что митохондриальной дисфункции участвуют во многих заболеваний как9 Паркинсона и Альцгеймера заболевания10, а также в боковой амиотрофический склероз 11 , 12. они также являются фундаментальные детерминанты процесса старения. Действительно они являются основными производителями реактивнооксигенных видов (ров) в ячейке, которая может быть пагубным для ячейки при высокой концентрации через оксидативного повреждения11. Старение также было связано к накоплению поврежденных или мутировавших митохондриальной ДНК13, mitophagy дисфункции14,15 , а также ухудшение митохондриальной биогенеза16. Митохондрии являются также ключевыми факторами, определяющими гомеостаза клетки, как они могут использовать различные субстраты для настройки нескольких клеточных функций согласно изобилия или дефицит макроэлементов17,18.

Действительно различные питательные вещества в рационе (углеводов, липидов и белков) переваривается, поглощаются и транспортируются в клетках. Затем они превращаются в цитозоле, и производные субстратов перевозятся в митохондриальной матрицу, где они производят сокращение эквиваленты, например NADH и ГВС219. Эти сокращения эквиваленты затем окисляется в различных ферментных комплексов транспортная система электронов (ETS). Эти комплексы, внедренные в митохондриальной внутренней мембраны, например комплекс I и II сложные. Кроме того другие ферментативные комплексы, такие как митохондриальных глицерин-3-фосфат-дегидрогеназы и пролина дегидрогеназа представляют собой альтернативные маршруты для вступления электронов в ETS20,21. Эти «альтернативные» комплексы особенно важны в насекомых, как по видам, они могут активно участвовать увеличить дыхание20,,2223,21. Электроны от этих ETS, системы кормления передаются убихинон и впоследствии для сложных III и затем комплекс CIV, до окончательного акцептор, молекулярный кислород. Этот перенос электрона генерирует Протон движущей силой всей внутренней митохондриальной мембраны, вождение фосфорилированием АДФ СПС в комплекс V (рис. 1). Учитывая центральную роль митохондрий в ячейки гомеостаза, изучение митохондриального метаболизма, используя соответствующие модели D. melanogaster представляет мощный инструмент для разграничения основных механизмов различных патофизиологические условия или под сотовой и экологические стрессы. Удивительно однако, лишь небольшое число исследований фактически измеряется митохондриальное дыхание в дрозофилы24,25,26. Действительно эксперименты, стремясь оценить потребление кислорода митохондриальной требуют изоляции митохондрий. Хотя и выгодно для измерения различных митохондриальной функции (например, производство ROS или коэффициент P/O как маркер митохондриальной эффективности27,28), эти изоляции, как правило, требуют довольно больших количествах Ткани из нескольких лиц24,29. Это требование для высоких объемов ткани и лиц является важным сдерживающим фактором, особенно с учетом того, что все люди должны быть того же возраста и желательно того же пола для экспериментов, делая измерения дыхания в разное время Указывает трудоемкий в лучшем случае. Кроме того хотя митохондриальной изоляции может обеспечить значительно углубить понимание основных механизмов, регулирующих митохондриальной метаболизма, методы, используемые для изоляции митохондрии имеют ряд недостатков, таких, как трудности, чтобы получить воспроизводимые результаты , нарушение митохондриальной сети и изменения митохондриального структуры и функции29,30,31.

Цель этого исследования заключается в представлении надежный протокол для измерения потребления митохондриальной кислорода у дрозофилы, используя только минимальное количество ткани от очень мало людей. Этот протокол состоит из измерения митохондрий кислородом потребления на месте с помощью29 permeabilized мышечных волокон от дрозофилы thoraxes в сочетании с высоким разрешением respirometry32,33, 34 , 35. Этот метод также имеет дополнительные преимущества по сравнению с методом классической митохондриальной изоляции, поскольку взаимодействия с другими компонентами клетки как хорошо как митохондриальных структуры и функции более сохранились в permeabilized волокна29,,3136, что делает этот подход более физиологически соответствующих. Этот протокол митохондриальной функции можно точно оцениваться с использованием высокого разрешения respirometry в только три thoraxes дрозофилы, с субстратами, позволяя определение потребления кислорода на нескольких разных ступенях ETS. Таким образом этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о основных механизмов, которые контролируют метаболизм в контексте многих условий окружающей среды или патофизиологические, воспользовавшись дрозофилы модели.

Измерение потребления кислорода в несколько различных этапов ETS и оценить как различные субстраты способствуют дыхания, разных субстратах (рис. 1), uncoupler, и ингибиторы используется30 после permeabilization из ткани. В частности последовательного добавления различных субстратов выполняются для стимулирования вступления электронов через различные комплексы ETS. Uncoupler, карбонил цианид 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), затем добавляется в оптимальной концентрации для измерения-сочетании дыхания, т.е. -phosphorylating дыхание стимулировали потребление кислорода Максимальная. Последовательного ингибитирований комплексов, которые I, II и III затем выполняются для мониторинга потребления остаточного кислорода, что обусловлено реакции окисления-ETS. Наконец, комплекс IV максимальной дыхание потенциала может оцениваться путем инъекций N, N, N', N, p - тетраметилсвинца--фенилендиамином (TMPD), поставщик искусственного электрона и аскорбата. Важно отметить, что эксперименты проводятся при 24 °C, так как это температура, при котором вызываются мух.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. реагенты подготовка

  1. Подготовьте следующие решения для рассечения и permeabilization ткани.
    1. Приготовляют раствор сохранение: 2,77 мм CaK2EGTA, EGTA, 5.77 мм Na2СПС, 6.56 мм MgCl2, 20 мм таурина, 15 Na2фосфокреатина, имидазола 20 мм, 0,5 мм Дитиотреитол, 7.23 мм K2и 50 мм K-МЧС, рН 7,1 (могут быть сохранены при-20 ° C).
    2. Подготовить сапонин раствор: 5 мг сапонин в 1 мл раствора для сохранения (приготовить свежий ежедневно).
  2. Подготовьте следующие решения для измерения дыхания.
    1. Подготовка среднего дыхания: 120 мм KCl, 5 мм х2PO4, 3 мм HEPES, 1 мм EGTA, MgCl 1 мм2и 0,2% BSA (w/v), рН 7,2.
    2. Подготовка поверхностей, uncoupler, ингибиторы. Распустить все субстраты H2O и распустить uncoupler FCCP, а также ингибиторы в этиловом спирте, абсолютного (за исключением Дендримерные, который растворяется в H2O). Нейтрализовать большинство субстратов, а также Дендримерные (см. Таблицу материалы). Все концентрации уступаны протокол являются окончательные концентрации внутри камеры 2 мл.

2. Подготовка и калибровка с высоким разрешением респирометра.

  1. Вымойте палат, колпачки и пробки респирометра три раза с 70% этиловом спирте и в три раза с дистиллированной водой.
  2. Калибровка нулевой концентрации кислорода: Пипетки 2.3 мл среды дыхания в камерах и добавить 10 мг Дитионит натрия. Хотя максимальный объем камеры-2 мл, 2.3 мл добавляются к гарантировать что нет пузырьков воздуха под пробку при закрытии камер. Закройте камер с пробками и измерить концентрацию кислорода на 10-20 мин калибровки электродов на нулевой концентрации кислорода с результирующей скорости потребления кислорода.
  3. Мыть камер с дистиллированной водой, инкубировать в абсолютного этанола, в течение 10 минут и затем смойте дистиллированной водой.
  4. Калибровки на насыщение воздуха: Пипетки 2.3 мл среды дыхания в камерах, вставьте заглушки, аспирационная превышение средней верхней пробки, а затем поднимите пробки с распоркой. Избыток дыхания среднего накапаны в камерах (объем всего 2 мл) чтобы избежать наличия пузырьков воздуха после закрытия камер.
  5. Контролировать потребление кислорода за 45 минут до часа, до тех пор, пока концентрация кислорода (синий след) является стабильным около 250 Нм при 24 ° C.

3. рассечение мух и Permeabilization ткани

  1. Убедитесь, что все действия выполняются на льду.
  2. Обезболивают шесть мужчин мух же штамма, же возраст и поднял на ту же диету на льду для облегчения рассечение мух (одичал тип w1118, 15 дней, кормили кукурузной муки среднего).
  3. С помощью скальпеля и штраф наконечником щипцы, вскрыть мух (удалить головы и животы) держать только thoraxes, содержащие полет мышцы. Этот шаг может быть сделано с невооруженным глазом. Обрабатывать полученный thoraxes с острым концом щипцами.
  4. Перевести три расчлененных thoraxes в 25 мм Петри, содержащий 2 мл раствора ледяной сохранения с помощью щипцов.
  5. С острым концом щипцами механически разрушения thoraxes, вставив наконечник щипцы в thoraxes и неоднократно разорвать ткань для получения слабо связанной сети.
  6. В 24-ну плита заполните две скважины с 12,5 мкл раствора сапонина и 1 мл раствора сохранения для получения конечной концентрации 62,5 мкг/мл сапонины. Заполните два соседних скважин с 1 мл среды дыхания.
  7. С острым концом щипцами передача три permeabilized thoraxes в разреженных сапонин раствор и инкубировать с мягким перемешиванием на орбитальный шейкер, на льду, за 20 мин.
  8. После последней инкубации передача волокон в соседних скважин, наполненный среднего дыхания с мягким перемешиванием, на льду, на 5 минут, чтобы смыть сапонин.

4. Определение сухого веса

  1. Сухой permeabilized thoraxes на абсорбирующие поверхности и флип, 3 - 4 раза с помощью щипцов острым концом чтобы убедиться, что вся влага удаляется.
  2. Весят три thoraxes вместе на микровзвешивания. Обратите внимание на полученный вес, как он будет использоваться для нормализации показателей потребления митохондрий кислородом.
  3. Передача ткани сразу в капле среднего дыхания на льду.

5. кислорода определение цены потребления

  1. Откройте камеры респирометра (удалить пробки) и добавить 10 мм из пирувата и 2 мм малат в каждой камере.
  2. Добавьте permeabilized ткани непосредственно в камеры заполнены среднего дыхания.
  3. Замените пробки с помощью разделителя.
  4. С 60 мл шприц собирать кислорода непосредственно из цистерны кислорода и вставляют 2-5 мл кислорода через пробку капилляра каждой палаты убеждаться диффузии кислорода через ткань не будет ограничивать потребление кислорода.
  5. Вставьте шприц Гамильтон капилляров каждого пробку, чтобы убедиться, что thoraxes остаются в камере.
  6. Полностью закрыть камер, когда концентрация кислорода составляет около 400 Нм, достижение уровней кислорода выше насыщенность воздуха (около 160% воздуха насыщения) внутри камеры.
  7. Остановите и перезапустите мешалки для проверки пузырьков воздуха в камерах.
  8. Введите массы ткани, весил ранее для нормализации дыхания ставки по массе ткани (мг), Отображение потребления кислорода масса конкретных (пмоль O2 consumed.s-1.mg-1 ткани).
  9. После того, как потребление кислорода стабилизируется (красный след), добавьте 5 мм ADP с помощью шприца Гамильтон.
  10. После каждой инъекции, промойте шприцы с дистиллированной водой, этанол 70% и снова дистиллированной воды.
  11. Как только снова потребление кислорода является стабильной, придать 5 мкл 4 мм c тситохрома.
  12. Перейти к последовательным инъекции следующие субстраты для оценки потребления митохондриальной кислорода на разных этапах ETS:
    1. 5 мкл Proline 2 М.
    2. 10 мкл сукцината 1 М.
    3. 30 мкл 1 M глицерин-3-фосфат.
  13. Придать uncoupler FCCP образом титрования с шагом 0,5-1 мкм (2 мкл раствора 1 мм) до оптимальной концентрации является достиг, т.е. концентрация для достижения высокого потребления кислорода возможно без торможения (осторожно: увидеть таблицы из материалов).
  14. Внедрить следующие ингибиторы последовательно для того, чтобы полностью подавляют потока электронов в ETS для измерения потребления остаточного кислорода (ROX) т.е.-дыхательной реакции, такие как циклооксигеназы реакции среди прочего:
    1. 1 мкл ротенон 1 мм (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
    2. 5 мкл Дендримерные 2м (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
    3. 1 мкл 5 мм antimycin A (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
  15. Добавление аскорбиновая кислота 0,2 мм и 0,5 мм TMPD последовательно в камеры, начиная с аскорбат для измерения потребления кислорода на сложном IV.
  16. Добавить 20 мм азид натрия для ингибирования комплекс CIV (осторожно: Смотрите Таблицу материалы).
  17. После сигнала стабильна, откройте камер с распоркой, повторно кислородом палат путем инъекций 2 мл чистого кислорода и закрыть камер, когда концентрация составляет около 250-300 nmol.mL-1.
  18. Измерить сигнал на 10-15 мин и расчет химических фон, то есть потребление кислорода из-за autoxidation TMPD.

6. Очистка респирометра

  1. После измерения раз ополосните камер с дистиллированной водой и промойте камер три раза в 70% этиловом спирте.
  2. Инкубируйте в абсолютного этанола за 10 минут, чтобы инактивировать ингибиторы.
  3. Три раза промыть дистиллированной водой, заполнить камеры с 70% этанола и заменить пробки и колпачки до следующего использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представитель след потребления митохондриальной кислорода с помощью протокола, описанные выше приводится на рисунке 2. Пируват и малат, вводят в камерах вместе с permeabilized мышечных волокон упоминаются в CI-утечки дыхания, т.е., когда комплекс я ETS стимулируется NADH производится через окисление пирувата и малат через Цикл трикарбоновых кислот (CI). Во время этой частоты дыхания митохондриальных кислорода поддерживается главным образом компенсиро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании описан метод для подготовки проб до измерения потребления митохондриальной кислорода у дрозофилы. Этот метод был разработан для преодоления различных проблем, связанных с протоколы, используя митохондриальной изоляции, особенно в том, что касается продолжительности и числа лиц, требуется. Вместо работы с митохондриальных изоляции, обычно требующих большое количество тканей, полученных из нескольких лиц, этот эксперимент выполняется на permeabilized мышечные волокна из thoraxes несколько дрозофилы. В э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было профинансировано грантов от национальной науки и инженерных исследований Совета (Сенти, открытие Грант) и Université de Moncton NP. LHB хотел бы отметить финансовую поддержку от Канадского института медицинских исследований (КНИИЗ), Нью-Брансуик инновационный фонд (NBIF) и Université de Moncton. Работа EHC поддерживается Alzheimer общества Канады, Канада мозга, Сенти, Канадский Фонд рака молочной железы, Нью-Брансуик инновационного фонда, Нью-Брансуик Фонд исследований в области здравоохранения и Université de Moncton.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Респирометр высокого разрешения Oxygraph O2KOroboros Instruments, Инсбрук, Австрия10022-02Startup O2K респирометр kit
 
O2K-Набор для титрования Oroboros Instruments, Инсбрук, Австрия20820-03Шприцы Hamilton разного объема
 
Программное обеспечение DatlabOroboros Instruments, Инсбрук, Австрия20700Программное обеспечение для сбора и анализа данных
 
Антимагнитные щипцы с тонким наконечникомVWR82027-400
 
Secura225D-1S-DQESartorius AG, Геттинген, ГерманияПолумикровесы (распространяются несколькими компаниями) 
 
Drosophila melanogaster дикий тип w1118Bloomington Drosophila stock Center, IN, США
Условия хранения: 24 &d;
C Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислотаSigma-AldrichE4378EGTA
Условия хранения: RT
KOHSigma-AldrichP1767ВНИМАНИЕ: коррозионный для металлов, острая токсичность, коррозия кожи, серьезное повреждение глаз, острая водная токсичность.
Условия хранения: RT
CaCO3Sigma-AldrichC4830
Условия хранения: RT
Na2ATPSigma-AldrichA2383
Условия хранения: -20 °°; C
MgCl2.6H2OSigma-AldrichM9272
Условия хранения: RT
TaurineSigma-AldrichT0625
Условия хранения: RT
Na2PhosphocreatineSigma-AldrichP7936
Условия хранения: -20 °С; C
имидазолсигма-олдричI5513
Условия хранения: RT
дитиотреитолсигма-олдричD0632
Условия хранения: 2-8 °; C
MES гидратSigma-AldrichM8250
Условия хранения: RT
Сапонин из коры квиллаиSigma-AldrichS7900Saponin
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: 5 мг в 1 мл раствора для консервации. Готовьте свежие ежедневно.
KClSigma-AldrichP9541
Условия хранения: RT
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
Условия хранения: RT
HEPESSigma-AldrichH3375
Условия хранения: RT
BSASigma-Aldrich05470
Условия хранения: 2-8 > C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953дитионитом натрия. ВНИМАНИЕ: самонагревающиеся вещества и смеси, острая токсичность, острая водная токсичность, хроническая водная токсичность.
Условия хранения: RT
Пируват натрияSigma-AldrichP2256Пируват
Условия хранения: 2-8 °°; C
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Готовьте свежие ежедневно.
L-(-)-яблочная кислотаSigma-AldrichM1000Malate
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Нейтрализовать с помощью KOH и хранить при температуре -20°C.
Аденозин 5'-дифосфат монокалия сольгидрат Sigma-AldrichA5285ADP
Условия хранения: -20 °°; C
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Нейтрализовать с помощью KOH и хранить при температуре -80 °C.
Цитохром c из сердца лошадиSigma-AldrichC7752Цитохром c
Условия хранения: -20 °°; C
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Хранить при температуре -20 °C.
L-ProlineSigma-AldrichP0380Proline
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Хранить при температуре -20 °C.
Сукцинат натрия двухосновной гексагидратSigma-AldrichS2378Succinate
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: В воде MilliQ. Нейтрализовать с помощью HCl и хранить при температуре -20°C.
sn-Глицерин-3-фосфат бис(циклогексиламмоний) сольSigma-AldrichG7886Глицерин-3-фосфат
Условия хранения: -20 °°; C
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Нейтрализовать с помощью HCl и хранить при -80 °C.
Карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразонSigma-AldrichC2920FCCP. ВНИМАНИЕ: острая токсичность, сенсибилизация кожи, хроническая водная токсичность.
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: В абсолютном этаноле. Хранить в стеклянных флаконах при температуре -20 °C.
RotenoneSigma-AldrichR8875ВНИМАНИЕ: острая токсичность, раздражение кожи, раздражение глаз, токсичность специфических органов-мишеней (система дыхания), острая водная токсичность, хроническая водная токсичность.
Приготовление раствора: В абсолютном этаноле. Хранить в темных флаконах при температуре -20°С.
Малоновая кислотаSigma-AldrichM1296Malonate. ВНИМАНИЕ: острая токсичность, серьезное повреждение глаз.
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Нейтрализуйте с помощью KOH. Готовьте свежие ежедневно.
Антимицин А из Streptomyces sp.Sigma-AldrichA8674Antimycin A. ВНИМАНИЕ: острая токсичность, острая водная токсичность, хроническая водная токсичность.
Условия хранения: -20 °°; Приготовление раствора C
: В абсолютном этаноле. Хранить при температуре -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-фенилендиаминSigma-AldrichT7394TMPD
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: В воде MilliQ. Хранить в темных флаконах по адресу: -20 °С.
(+)-L-аскорбат натрияSigma-AldrichA4034аскорбат
Условия хранения: RT
Приготовление раствора: в воде MilliQ. Хранить в темных флаконах по адресу: -20 °С.
NaN3Sigma-AldrichS2002Азид натрия. ВНИМАНИЕ: острая токсичность (пероральная и кожная), токсичность для специфических органов-мишеней (мозг), токсичность для водных организмов, хроническая токсичность для водных организмов. Приготовление раствора
: в воде MilliQ. Хранить при температуре -20 °C.

Ссылки

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
  3. Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
  4. Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
  5. Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
  6. Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  7. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
  8. Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
  9. Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
  10. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  11. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  12. Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
  13. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120 (4), 483-495 (2005).
  14. Szibor, M., Holtz, J. Mitochondrial ageing. Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
  17. Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
  18. Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. Nutrient-sensing mechanisms and pathways. Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).
  19. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
  20. McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
  21. Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600(2015).
  22. Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
  23. Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333(2016).
  24. Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
  25. Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
  26. Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
  27. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  28. St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
  29. Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  30. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  31. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  32. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
  33. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
  34. Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
  35. Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
  36. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  37. Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
  38. Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  40. McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila melanogaster
Измерение потребления кислорода митохондрий в Permeabilized волокнах дрозофилы, используя минимальное количество ткани
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.