Изготовление мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения массива

Summary

Эта статья описывает подробная методология подготовить массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) для манипуляции высок объём физико-химические сигналы подражая в vivo сотовой микросреды и Определите оптимальные клеточной среды для человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с одной ячейкой профилирования.

Abstract

Сотовый микросреды состоят из различных сигналов, таких как факторы роста, внеклеточной матрицы и межклеточных взаимодействий. Эти сигналы являются хорошо организованы и имеют решающее значение в регуляции функций клеток в живых систем. Хотя ряд исследователей пытались исследовать взаимосвязь между экологическими факторами и желаемого клеточных функций, многое остается неизвестным. Это во многом обусловлено отсутствием надлежащей методологии имитировать такие экологические сигналы в пробирке, и одновременно проверить различные экологические сигналы на клетки. Здесь мы приводим интегрированной платформы microfluidic каналов и массив нановолокно, следуют высоким содержанием одноклеточных анализа, для изучения стволовых клеток фенотипов, изменено, различных экологических факторов. Чтобы продемонстрировать применение этой платформы, это исследование посвящено фенотипов самостоятельного обновления человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Здесь мы представляем процедуры подготовки нановолокно массив и структуру microfluidic в изготовление массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME). Кроме того описаны общие шаги одной ячейки, профилирование, клетки, окрашивание с несколькими флуоресцентные маркеры, несколько изображений флуоресценции и статистического анализа.

Introduction

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs)^1,2 самостоятельно продлевать неограниченно и дифференцироваться в различные ткани линий, которые могут революционизировать разработки лекарственных средств, на основе ячеек терапии, тканевой инженерии и регенеративной медицины ^{3 , 4 , 5 , 6}. Общая культура блюда и микротитровальных пластин, однако, не предназначены для включения точные физические и химические Сотовый манипуляции на клеточном уровне с диапазоном от nano - для микро ....

Protocol

1. Изготовление MACME массива

Примечание: Все материалы и оборудование, перечислены в таблице материалы.

1. Подготовка масок для нановолокно массив и плесень microfluidic структуры
   1. Создание трехмерного (3D) изображения маски, используемые для нановолокно массивов и формы для microfluidic структур с использованием пакетов программного обеспечения 3D компьютерной графики (Таблица 1).
      Примечание: 3D изображения читать и напечатаны на 3D принтере. Печатных маски и формы имеют те же размеры с трехмерными изображениями, определяются с использованием графического программного ....

Results

MACME массивы: проектирование и изготовление: В сочетании с технологией нановолокно мы использовали microfluidic клеточной культуры и проверки методов, используемых ранее определить оптимальные условия для hPSC самообновлению или дифференциация^35,36 (рис. 1). Это хорошо подходит для создания надежных высокой пропускной способностью на основе ячеек анализов потому что клетки культуры к.......

Discussion

Этот протокол демонстрирует первый метод скрининга для создания системы надежных культуры для поддержания квалифицированных hPSCs. Во-первых мы описали как подготовить платформу, показывая различные искусственные ECMs и клеток, заполнение плотности, используя microfluidic устройства, интегрированные с нановолокно массив, массив MACME. Во-вторых, количественных на основе образа одноклеточных фенотип был выполненных⁵⁰ для оценки отдельных клеточных Итоги и изменены различные биохимические и биофизич.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Полистирол (PS)	Sigma	#182435	Средний Mw: 290 000, средний Mn: 130 000
Полиметилглутаримид (PMGI)	MicroChem	G113113
Желатин (GT)	Sigma	G2625	Из свиной кожи, тип A
Набор силиконовых эластомеров	Doe Corning Toray	#1064291	PDMS и основа из силиконового эластомера являются компонентами этого набора.
OpenSCAD			Это бесплатное программное обеспечение для компьютерной 3D-графики (http://www.openscad.org/), используемое для проектирования пресс-формы микрофлюидного устройства.
AutoCAD 2014	Autodesk		Это программное обеспечение для компьютерной 3D-графики (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview), используемое для проектирования маски, используемой при подготовке нановолоконной матрицы.
3D-принтер, AGILISTA-3000	Keyence
, AR-M2	Keyence		Используется для 3D-печати компанией Agilista.
Уксусная кислота	Sigma	#338826	≥ 99,99%
Этилацетат	Sigma	#270989	Безводный, 99,8%
Тетрагидрофуран (THF)	Sigma	#401757
Вакуумное устройство		MSP-30T	Магнетронная распылительная машина
Nunc OmniTray	Thermo Fisher Scientific	#242811	Это полистирольная базовая плита, на которой создается массив нановолокон. Этот размер пластины обычно составляет 127,7 x 85,5 мм.
Пистолетный коронный разрядный аппарат	Shinko Electric & Контрольно-измерительные приборы	CFG-500	Это удобное устройство используется для генерации коронного разряда для активации нижней поверхности слоя PDMS на шаге 1.5 "Сборка массивов MACME" в протоколе.
Шприц объемом 5 мл	Terumo	SS-05SZ
Тупой иглой из нержавеющей стали (23 калибра)	Nipro	#2166	Внешний диаметр и длина составляют 0,6 и 32 мм соответственно.
Высоковольтный источник питания	TechDempaz
1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, гидрохлорид	Dojindo	W001
N-гидроксисукцинимид	Sigma	#56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	#354277	Этот белок в протоколе обозначен как гелевая матрица базальной мембраны.
CellStick Витронектин, человек, раствор	STEMCELL Technologies	#07004
TeSR-E8	STEMCELL Technologies	#05940	Питательная среда без питателя, без ксеноса для поддержания человеческих ES и iPS-клеток
Y-27632	Wako Pure Chemical Industries	#253-00513
Фермент TrypLE Express (1X), феноловый красный	Thermo Fisher Scientific	#12605028	Речь идет о рекомбинантной трипсин-подобной протеазе для диссоциации адгезивных клеток млекопитающих.
Набор для визуализации Click-iT EdU с Alexa Fluor 647 Azides	Thermo Fisher Scientific	C10086	Флуоресцентное мечение пролиферирующих клеток при флуоресцентном окрашивании на пластине было выполнено в соответствии с инструкцией к продукту этого набора.
Аннексин V, Alexa Fluor 594 конъюгат	Thermo Fisher Scientific	A13203
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Oct-3/4 антитело (C-10)	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)	abcam	ab96875	Это вторичное антитело, используемое при окрашивании флуоресцентных клеток на пластине.
ECLIPSE Ti-E	Nikon		Это инвертированный флуоресцентный микроскоп, оснащенный объективом CFI Plan Fluor 4&x;/0.13 N.A. объективом (Nikon), ПЗС-камерой (ORCA-R2, Hamamatsu), ртутной лампой (Intensilight, Nikon), автоматизированным столиком XYZ (Ti-S-ER моторизованный столик с энкодерами, Nikon) и кубами фильтра для четырех флуоресцентных каналов (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Это программное обеспечение для получения изображений под микроскопом, используемое для автоматического получения изображений.
CellProfiler, версия 2.1.0			Это бесплатное открытое программное обеспечение для анализа изображений клеток (http://cellprofiler.org/).
Анализ R			SOM выполняется с помощью пакета kohonen этого программного обеспечения. Это находится в свободном доступе (https://www.r-project.org/).
Кластер 3.0			Это программное обеспечение для кластеризации с открытым исходным кодом (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). С помощью этого программного обеспечения выполняется неконтролируемая иерархическая кластеризация.
Java TreeView			Это программное обеспечение с открытым исходным кодом (http://jtreeview.sourceforge.net/) используется для визуализации данных кластеризации в виде тепловой карты и дендрограммы.
H9 человеческие эмбриональные стволовые клетки	WiCell Стволовые клетки банка	WA09