Method Article

Изготовление мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения массива

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья описывает подробная методология подготовить массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) для манипуляции высок объём физико-химические сигналы подражая в vivo сотовой микросреды и Определите оптимальные клеточной среды для человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с одной ячейкой профилирования.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сотовый микросреды состоят из различных сигналов, таких как факторы роста, внеклеточной матрицы и межклеточных взаимодействий. Эти сигналы являются хорошо организованы и имеют решающее значение в регуляции функций клеток в живых систем. Хотя ряд исследователей пытались исследовать взаимосвязь между экологическими факторами и желаемого клеточных функций, многое остается неизвестным. Это во многом обусловлено отсутствием надлежащей методологии имитировать такие экологические сигналы в пробирке, и одновременно проверить различные экологические сигналы на клетки. Здесь мы приводим интегрированной платформы microfluidic каналов и массив нановолокно, следуют высоким содержанием одноклеточных анализа, для изучения стволовых клеток фенотипов, изменено, различных экологических факторов. Чтобы продемонстрировать применение этой платформы, это исследование посвящено фенотипов самостоятельного обновления человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Здесь мы представляем процедуры подготовки нановолокно массив и структуру microfluidic в изготовление массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME). Кроме того описаны общие шаги одной ячейки, профилирование, клетки, окрашивание с несколькими флуоресцентные маркеры, несколько изображений флуоресценции и статистического анализа.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs)1,2 самостоятельно продлевать неограниченно и дифференцироваться в различные ткани линий, которые могут революционизировать разработки лекарственных средств, на основе ячеек терапии, тканевой инженерии и регенеративной медицины 3 , 4 , 5 , 6. Общая культура блюда и микротитровальных пластин, однако, не предназначены для включения точные физические и химические Сотовый манипуляции на клеточном уровне с диапазоном от nano - для микро метров, который является критическим фактором для сотовых расширения, самообновления и дифференциации. Чтобы устранить этот недостаток, исследования изучили роль клеточных микросреды в регулировании клеток судьба решения и функции клеток4. В последние годы все большее число исследований были проведены реконструировать сотовой микросреды в vitro7,8. Нано - и микро изготовление процессы создали эти микросреды через манипуляции химических9,10,11,12,13, 14,,1516,17 и физической18,19,20 экологические сигналы. До сих пор не поступало систематически расследовать основных механизмов химических и физических экологических сигналы на решений клеток судьба и функций в рамках единой платформы.

Здесь мы представляем стратегию, основанную на принципах простой дизайн для создания надежного скрининга платформы (рис. 1). Во-первых, мы описываем порядок разработки интегрированной платформы для создания универсальный, искусственные сотовой микросреды, используя массив нановолокно и структуру microfluidic: массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) (Рис. 1A и 2A). Нановолокно массив имеет 12 различных микросреды в разных сочетаниях нановолокно материалов и плотности. Electrospinning была использована для изготовления нановолокон. Нановолокно материалов, таких, как полистирол (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22и23желатин (GT), были разработаны для проверки их химические свойства, которые могут повлиять на клеточной адгезии и поддержания плюрипотентности ( Рисунок 2B). Нановолокно плотности были разнообразны, изменяя время electrospinning и сгенерированный nanofibers были определены согласно их плотности (DNF, с D = XLow/низкий/средний/высокий). Microfluidic структура состоит из укрывательство 48 камеры в культуре клеток, которые могут быть расположены вдоль стандартные размеры 96-луночных микропланшетов полидиметилсилоксан (PDMS). PDMS — обычно используется для изготовления microfluidic приборы24биосовместимых и газ сменный полимер. Каждый канал microfluidic был разработан чтобы быть 700 мкм широкий и 8.4-мм длиной и имел два отверстия на его краях (Таблица 1). Камеры были разной высоты (250, 500 и 1000 мкм) для манипулирования первоначального заполнения ячейки плотности (0,3 0,6 и 1.2 × 105 клеток/см2), которые можно соотнести с выживания, пролиферации и дифференцирования hPSCs25 (Рис. 2C). Количество ячеек в камеру семенами пропорциональна плотности столбца над полом камеры, и таким образом первоначальная клеточная посева плотность контролировался путем введения же суспензию клеток в культуре камер с разных высот. Все каналы были призваны быть ≥ 250 мкм высотой26 для сведения к минимуму воздействия напряжения низкой кислорода27 и касательное напряжение28 на клетки. Канал высот 250, 500 и 1000 мкм сокращенно здесь как XCD с X = низкий, Mid и высокий, соответственно. Средах с собственный нановолокно и первоначальный плотностью заполнения ячейки были укорочены как «Material_NF density_Cell» (например, GT_HighNF_HighCD: окружающей среды, характеризуется высокой плотностью GT нановолокон и высокой начального заполнения ячейки плотность).

Впоследствии мы описывают, как выполнять анализ одноклеточных систематически расследовать поведение клеток в ответ на экологические факторы (рис. 1Б). Как доказательство концепции мы определили оптимальные клеточной среды для hPSC самообновлению, который является одной из ключевых функций для hPSC обслуживание (рис. 1Б)29. На основе образа цитометрии, следуют статистического анализа, позволяет для количественной интерпретации отдельных клеточных реакций фенотипические клеточной среде. Среди различных клеточных функций этот документ содержит подробные процедуры для выявления оптимальных условий для поддержания hPSC самообновлению.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление MACME массива

Примечание: Все материалы и оборудование, перечислены в таблице материалы.

  1. Подготовка масок для нановолокно массив и плесень microfluidic структуры
    1. Создание трехмерного (3D) изображения маски, используемые для нановолокно массивов и формы для microfluidic структур с использованием пакетов программного обеспечения 3D компьютерной графики (Таблица 1).
      Примечание: 3D изображения читать и напечатаны на 3D принтере. Печатных маски и формы имеют те же размеры с трехмерными изображениями, определяются с использованием графического программного обеспечения на этапе 1.1.1.
    2. Распечатать маски и плесень, основанный на эти проекты с использованием 3D-принтер.
      Примечание: В этом протоколе ink-jet как 3D-принтер с УФ отверждаемыми смолы был используется30. Разрешение принтера был 635 × 400 dpi и 15 мкм в X, Y и Z, соответственно, однако, фактические X, Y резолюции был примерно в четыре раза ниже.
  2. Подготовка нановолокно массив (Рисунок 3A)
    1. Растворы полимерные подготовиться electrospinning.
      1. Разбавьте 13% PMGI жидкость с тетрагидрофуран 9% (w/v)22.
      2. Распустить 0,08 г PS (номер Средний молекулярный вес (Mn): 130 000) в THF:dimethylformamide (соотношение 1:1 объем)21и добавить THF:dimethylformamide довести объем до окончательного 1 мл (8% (w/v) PS раствор).
      3. Распустить 0,1 г GT в воде: уксусной кислоты: этиловый ацетат (отношение объема 1:1.6:2.1) и добавить воду: уксусной кислоты: Этилацетат довести объем до окончательного 1 мл (раствор 10% (w/v) GT) как описано23,31.
    2. Используйте магнетронного распыления машина, депозит тонкий слой платины с толщиной 5-Нм на полистирол (PS) baseplate (127,7 × 85.5 мм), который служит катодом в electrospinning установки.
    3. Загрузите каждый раствор полимера в 5-мл шприц с тупой иглой 23 G из нержавеющей стали.
    4. Место и якорь шприц с иглой на шприцевый насос с 12-см помимо коллекционер electrospinning устройства.
    5. Подключите иглу шприца высокого напряжения питания и установить для применения к 11 кв.
    6. Установите на насосных скорость 0,2 мл/ч.
    7. Держите температуры и влажности при 30 ° C и < 30% (v/v).
    8. Положите маску на плите, подготовленный на этапе 1.2.2.
    9. Изготовить nanofibers на плите через отверстия маски с различных плотностей, изменяя время electrospinning (например, 20, 60, 90 и 180 s).
    10. Снимите маску из плите.
      Примечание. Этанол могут быть распылены на electrospun GT nanofibers перед удалением маски во избежание отшелушивающим GT nanofibers вместе с маской.
    11. Повторите шаг 1.2.4-1.2.10 до завершения изготовление нановолокно массив.
    12. Место нановолокно массив в эксикатор при 25 ° C для 16 h для испарения растворителя оставшихся.
    13. Нановолокна crosslink GT с 0,2 М 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) и 0,2 M-N-оксисукцинимидного (NHS) в этаноле при 25 ° C для 4 h23.
    14. Промойте nanofibers GT дважды с 99,5% (v/v) этанола и вакуум сухой при 25 ° C для 16 h.
  3. Изготовление microfluidic структур (Рисунок 3B)
    1. Смешать 2 g PDMS отверждения агента и 20 g PDMS базы (1:10 вес коэффициент; Pre-PDMS). 24
    2. Вылейте смесь pre-PDMS на плесень, изготовленный в шаге 1.2.
    3. Де газ pre-PDMS смесь в эксикатор для 30 мин.
    4. Вылечить pre-PDMS смесь в духовке при температуре 65 ° C для 16 h.
  4. Ассамблеи MACME массивы (Рисунок 3B)
    1. Отделите PDMS структуры, вылечить на шаге 1.3.4 от плесени и чистый с 70% (v/v) этанола.
    2. Лечить атмосферных коронного разряда на нижней стороне PDMS структуры32.
      Примечание: В этом протоколе corona сбрасываются на всей поверхности слоя 3 или 4 раза с коронным разрядом аппарата «Удобный». Плазменной очистки кислорода был заменен с атмосферными коронным разрядом для изменения поверхности адгезии.
    3. Быстро Соберите PDMS структуры с массивом нановолокно.
    4. Печь выпекать при температуре 65° C на 2 дня.

2. Загрузка ЭСК в MACME массив

  1. Для повседневной культуры H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) сохранить клетки в xeno свободно химически определены питательной среды для hPSC обслуживания33 с 10 мкм Y-27632 рок ингибитор34 (названный hPSC средних) в культуре клеток 35-мм блюдо с базальной мембраны матрицы геля (мг) покрытием.
  2. Клетки проход каждые 4-7 дней, с использованием рекомбинантного трипсина как протеазы.
  3. Стерилизовать MACME массив с 99,5% этанола, путем загрузки в камеры на 10 минут, а затем удалить этанола. Повторите этот шаг 3 раза.
  4. Ввести 12 мкл мг, 10 мкг/мл vitronectin (VN), и 0,1% (w/v) GT в управления культуры камер и инкубировать камер при 37 ° C за 1 ч до пальто их на поверхности камеры.
    Примечание: В этом протоколе мг, VN и GT были отобраны как ссылка белков клеточной адгезии и культуры. Потому что мг и VN стандартные культуры клеток матрицы используется для поддержания hPSC самообновлению, они используются в качестве позитивных элементов управления; двумерные GT покрытие (2DGT) или не покрытие (NC) использовались как негативный контроль.
  5. Ввести предварительно разогретые hPSC среднего во всех палатах MACME массива. Инкубировать камер для 30 минут при 37 ° C.
  6. Госкомсанэпиднадзором мыть H9, культивируемых на 35-мм блюдо с DPBS, добавить 0,5 мл рекомбинантных протеазы трипсина как на блюдо и инкубировать при 37 ° C за 1 мин и тщательно удалить только supernatants, смешанного с протеазы.
    Примечание: На шаге аспирации клетки не отсоединяется.
  7. Сразу же добавить hPSC средний, аккуратно распределить средство против блюдо поверхности неоднократно отмежеваться клетки и передавать отдельные ячейки 15 мл Конические трубки.
  8. Центрифуга на 200 g x 3 мин аспирата супернатант и приостановить клеток в среде подогретым hPSC.
  9. Ввести в каждой камере microfluidic 12 мкл суспензии клеток (1,2 × 106 клеток/мл).
    Примечание: Представить в одной палате от другого с помощью микропипеткой клетки. Потому что количество клеток, семенами для камер пропорциональна плотности столбца над полом камеры, начальная плотность посева клеток может контролироваться хотя образцы из же суспензию клеток были использованы. Убедитесь, что дозирование делается аккуратно. Удалите избыток среднего из камер, используя палку хлопка накренилась после загрузки. Массив MACME совместим с пипетки часто используемые лабораторные и автоматических дозаторов системы, и она не требует никакого специального оборудования.
  10. Измените hPSC среднего каждые 12 ч и культуры за 4 дня.
    Примечание: Постоянные тома носителя (1.6, 3.2 и 6.4 мкл) обслуживаются с помощью камер различных размеров. Культура клетки под статического состояния для сведения к минимуму напряжение сдвига за исключением обмена клеток культуры среднего35,36.

3. количественное профилирование одной ячейки

  1. На пластине люминесцентные клеток пятнать
    Примечание:     для анализа фенотипические изменения самостоятельного обновления hPSCs, этот протокол выбран три ключевых фенотипические маркеры для этого протокола: OCT4, 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) и Annexin V, для измерения статуса плюрипотентности, пролиферации и апоптоза , соответственно (Рисунок 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) используется для идентификации клеточных ядер. OCT4 является одним из важнейших транскрипционных факторов плюрипотентности.
    1. Инкубируйте H9 ЭСК в массивах MACME в hPSC среде с 10 мкм EdU алкины при 37 ° C за 30 мин.
    2. После мытья с annexin привязки буфера (10 мм HEPES (рН 7,4), 140 мм NaCl, 2,5 мм CaCl2), выведение клетки с флуоресцентный оранжевый краситель Annexin конъюгата V при 20 ° C на 15 мин.
    3. Исправить клетки в PBS с параформальдегида 4% (v/v) при 20 ° C в течение 15 минут, а затем промыть клетки с PBS дважды.
    4. Разрушения клеток с использованием PBS с 0,3% (v/v) Тритон X-100 при 20 ° C для 16 h.
      Примечание: Параформальдегида ослабляет связь между пластиковые фундаментной плите и структуру microfluidic PDMS. Таким образом отряд PDMS слоя из массива на шаге 3.2.1 также может выполняться сразу после этого шага.
    5. Инкубируйте ячейки в буфер Tris основе реакции с красно Люминесцентная краска азид при 20 ° C за 30 мин.
    6. Инкубируйте клетки в блокирующем буфере (PBS с 5% (v/v) нормальной козьего сыворотки крови, сыворотке нормальный осла 5% (v/v), 3% (w/v) бычьего сывороточного альбумина, 0,1% (v/v) Tween-20 и 0,1% (w/v) Н-додецил β-D-maltoside) на 4 ° C на 16 h.
    7. Инкубируйте в PBS с 0,5% (v/v) Тритон X-100 решения и человеческих антител OCT3/4 (мыши IgG) при 4 ° C для 16 h.
    8. Инкубируйте в блокирующем буфере с Грин Люминесцентная краска меченых осла анти мыши IgG (H + L) при 37 ° C 60 мин.
    9. Инкубируйте в PBS с DAPI при 20 ° C за 30 мин.
    10. Замените PBS-DAPI PBS.
    11. Сохранить в массиве MACME, с 4 ° C до захвата изображений.
  2. Видеосъемка (Рисунок 4)
    1. Отделите PDMS microfluidic структуры из массива MACME.
    2. Удаление остаточных PBS из массива MACME, применить 90%(v/v) глицерина в PBS в клетки и место coverslips над окрашенных клеток.
    3. Установите пластину вниз на сцене Перевернутый флуоресцентным микроскопом.
    4. Приобрести 12-битные цветные изображения автоматически с использованием всех моторизованных компонентов (этап, затвора, фильтров и систем фокус), которые были под контролем микроскопа изображений.
      Примечание. В этом протоколе, времени экспозиции корректируются, чтобы достичь возле значения максимальной интенсивности (высокая интенсивность пикселя: 4096), но нулевая насыщенность, для каждого изображения, DAPI, OCT4, Annexin V и EdU.
  3. Обработка изображений, компьютер экскурсии и флуоресценции сигнал количественной оценки (Рисунок 5)
    Примечание:     следующие ячейки анализ изображений осуществляется на ранее описанных метод37.
    1. Преобразование цветного изображения в оттенки серого.
    2. Вычислить одно пороговое значение для каждого DAPI изображения с помощью метода Оцу и классифицировать пикселей выше порога переднего плана и ниже как фон. Убедитесь, что значение foreground соответствует интенсивности флуоресценции DAPI.
      Примечание: Процесс анализа изображения содержит 5 шагов; идентификация первичных объектов в DAPI изображения, идентификация вторичных объектов в OCT4 и Annexin V, EdU изображения, соответственно и измерение интенсивности объекта. Рисунок 3 обеспечивает изображения графического интерфейса пользователя (GUI) на настройки обработки изображений.
    3. Измерьте флуоресцентного света OCT4 и EdU на каждом изображении.
    4. Определить регион, окрашенных с Annexin V метод распространения и количественного определения интенсивности флуоресценции.
  4. 3.4. Статистический анализ для визуализации отдельных клеточных фенотипов на одну ячейку изображений
    1. Нормализовать входные флуоресцентные интенсивности каждого фенотипических маркеров, центрирование и масштабирование эти переменные, чтобы дать им равный вес.
    2. Самоорганизующаяся карта (SOM) анализ с использованием программного обеспечения среды для статистических вычислений и графики, как описано в предыдущих исследованиях38,39.
      1. Создание 25 сом узлы с отличительной четыре «Справочник кодов векторов» соответствует флуоресцентного света четырех маркеров, DAPI, Эду, Annexin V и OCT4.
      2. Отдельные ячейки в каждом микроокружения назначить узел «победы» (наиболее близок) и сюжет как ячейки частоты, согласно которому таблица кодов векторов победы узла обновляются с использованием средневзвешенной, где вес — коэффициент обучения (здесь, как 0.05 значение по умолчанию).
        Примечание: Исключить данные из камер, содержащих менее чем 1000 ячеек, поскольку наборы данных, содержащие несколько ячеек не предоставляют статистически значимые результаты сом.
    3. Выполняйте без присмотра иерархическая кластеризация с СОМ узел значения с помощью метода среднего связь, основанный на корреляции Пирсона кластеризации программного обеспечения40.
    4. Отображают кластеризации данных дендрограмма и heatmap просмотров41.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME массивы: проектирование и изготовление: В сочетании с технологией нановолокно мы использовали microfluidic клеточной культуры и проверки методов, используемых ранее определить оптимальные условия для hPSC самообновлению или дифференциация35,36 (рис. 1). Это хорошо подходит для создания надежных высокой пропускной способностью на основе ячеек анализов потому что клетки культуры к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует первый метод скрининга для создания системы надежных культуры для поддержания квалифицированных hPSCs. Во-первых мы описали как подготовить платформу, показывая различные искусственные ECMs и клеток, заполнение плотности, используя microfluidic устройства, интегрированные с нановолокно массив, массив MACME. Во-вторых, количественных на основе образа одноклеточных фенотип был выполненных50 для оценки отдельных клеточных Итоги и изменены различные биохимические и биофизич...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим проф. н. Nakatsuji iCeMS, Университет Киото, для обеспечения человеческих клеток ES. Мы также благодарим профессора A. Маруяма в Токийском технологическом институте за его поддержку в использовании атомно-силового микроскопа. Щедро финансировались японского общества для содействия развитию науки (страниц JSP; 22350104, 23681028, 25886006 и 24656502); финансирование было также предоставлено новой энергии и организация развития промышленных технологий (NEDO) и Фондом Terumo науки о жизни. WPI-iCeMS поддерживается мир премьер международного исследовательский центр инициативы (ИЗВ), Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ), Япония. Часть этой работы была поддержана центром нанотехнологий университета Киото и аист нано-перерабатывающего завода в «Нанотехнологии платформы проекта «авторами МПКСНТ, Япония.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Полистирол (PS)Sigma#182435Средний Mw: 290 000, средний Mn: 130 000
Полиметилглутаримид (PMGI)MicroChemG113113
Желатин (GT)SigmaG2625Из свиной кожи, тип A
Набор силиконовых эластомеровDoe Corning Toray#1064291PDMS и основа из силиконового эластомера являются компонентами этого набора.
OpenSCADЭто бесплатное программное обеспечение для компьютерной 3D-графики (http://www.openscad.org/), используемое для проектирования пресс-формы микрофлюидного устройства.
AutoCAD 2014AutodeskЭто программное обеспечение для компьютерной 3D-графики (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview), используемое для проектирования маски, используемой при подготовке нановолоконной матрицы.
3D-принтер, AGILISTA-3000Keyence
, AR-M2KeyenceИспользуется для 3D-печати компанией Agilista.
Уксусная кислотаSigma#338826≥ 99,99%
ЭтилацетатSigma#270989Безводный, 99,8%
Тетрагидрофуран (THF)Sigma#401757
Вакуумное устройствоMSP-30TМагнетронная распылительная машина
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811Это полистирольная базовая плита, на которой создается массив нановолокон. Этот размер пластины обычно составляет 127,7 x 85,5 мм.
Пистолетный коронный разрядный аппаратShinko Electric & Контрольно-измерительные приборыCFG-500Это удобное устройство используется для генерации коронного разряда для активации нижней поверхности слоя PDMS на шаге 1.5 "Сборка массивов MACME" в протоколе.
Шприц объемом 5 млTerumoSS-05SZ
Тупой иглой из нержавеющей стали (23 калибра)Nipro#2166Внешний диаметр и длина составляют 0,6 и 32 мм соответственно.
Высоковольтный источник питанияTechDempaz
1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, гидрохлоридDojindoW001
N-гидроксисукцинимидSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277Этот белок в протоколе обозначен как гелевая матрица базальной мембраны.
CellStick Витронектин, человек, растворSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Питательная среда без питателя, без ксеноса для поддержания человеческих ES и iPS-клеток
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
Фермент TrypLE Express (1X), феноловый красныйThermo Fisher Scientific#12605028Речь идет о рекомбинантной трипсин-подобной протеазе для диссоциации адгезивных клеток млекопитающих.
Набор для визуализации Click-iT EdU с Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086Флуоресцентное мечение пролиферирующих клеток при флуоресцентном окрашивании на пластине было выполнено в соответствии с инструкцией к продукту этого набора.
Аннексин V, Alexa Fluor 594 конъюгатThermo Fisher ScientificA13203
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 антитело (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Это вторичное антитело, используемое при окрашивании флуоресцентных клеток на пластине.
ECLIPSE Ti-ENikonЭто инвертированный флуоресцентный микроскоп, оснащенный объективом CFI Plan Fluor 4&x;/0.13 N.A. объективом (Nikon), ПЗС-камерой (ORCA-R2, Hamamatsu), ртутной лампой (Intensilight, Nikon), автоматизированным столиком XYZ (Ti-S-ER моторизованный столик с энкодерами, Nikon) и кубами фильтра для четырех флуоресцентных каналов (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonЭто программное обеспечение для получения изображений под микроскопом, используемое для автоматического получения изображений.
CellProfiler, версия 2.1.0Это бесплатное открытое программное обеспечение для анализа изображений клеток (http://cellprofiler.org/).
Анализ RSOM выполняется с помощью пакета kohonen этого программного обеспечения. Это находится в свободном доступе (https://www.r-project.org/).
Кластер 3.0Это программное обеспечение для кластеризации с открытым исходным кодом (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). С помощью этого программного обеспечения выполняется неконтролируемая иерархическая кластеризация.
Java TreeViewЭто программное обеспечение с открытым исходным кодом (http://jtreeview.sourceforge.net/) используется для визуализации данных кластеризации в виде тепловой карты и дендрограммы.
H9 человеческие эмбриональные стволовые клеткиWiCell Стволовые клетки банкаWA09
УФ-отверждаемая смола

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473(2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles