Методическая статья

Пункция индуцированной неоваскуляризации Iris как модель мыши Рубеоз Радужки

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57398

⸱

8 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Section of Eye and Vision, St Erik Eye Hospital, Karolinska Institutet

В этой статье

Краткое содержание

Ирис неоваскуляризация, частым осложнением ишемической болезни сетчатки, может привести к зрение угрожая Неоваскулярная Глаукома. Здесь мы описываем мышиных протокол для стимулирования экспериментальной Ирис неоваскуляризация, которые могут быть использованы для неинвазивной оценки по ангиогенез модулирующих веществ.

Аннотация

Мы описываем модель неоваскуляризация прокола индуцированной Ирис как общая модель для неинвазивной оценки по ангиогенез. Эта модель также имеет отношение к ориентации Неоваскулярная Глаукома, прицел угрожая осложнения диабетической ретинопатии. Этот метод основан на индукции Ирис сосудистой реакции ряда самоуплотняющийся увеальной проколы на мышей BALB/c и использует послеродовой созревания глазной сосудистую мыши. Щенков мыши проходят увеальной проколы от послеродового дня 12.5, когда щенки естественно открыть их глаза, до послеродового дня 24.5. Благодаря прозрачности роговицы Ирис сосудистую могут быть проанализированы легко через время методом неинвазивной в естественных условиях . Кроме того полупрозрачная Ирис мышей BALB/c может быть flatmounted для анализа подробные immunohistologic с минимальными неспецифической фон окраски. В этой модели, ангиогенез главным образом управляется воспалительных и плазминогена, активация системы. Пункция индуцированной модели является первым, чтобы побудить неоваскуляризация Ирис в мелких грызунов и имеет то преимущество, позволяя прямой неинвазивной в естественных условиях анализ процесса ангиогенных. Кроме того модель может сочетаться с ангиогенных модулирующих веществ, который подчеркивает свой потенциал в изучении ангиогенеза с перспективой в естественных условиях .

Введение

Ирис, вместе с Цилиарное тело и сосудистое, включает в себя сосудистая оболочка глаза, который является наиболее васкуляризированной ткани глаза. Iris сосудистую имеет важное значение в поддержании гомеостаза в передней камере глаза. В результате обильные анастомоза соединения между артерий и вен Ирис кровеносных сосудов обеспечивают питательных веществ и кислорода не только Ирис, сам, но весь переднего сегмента глаза1.

Формирование новых кровеносных сосудов, или ангиогенеза из уже существующих, является основополагающим в физиологических процессах, таких, как развитие и ранозаживляющее2. Ангиогенез регулируется мелко множество канонических факторов, таких как Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и ингибитора активатора плазминогена (PAI)), а также несколько факторов воспаления, и дисбаланс этих факторов может привести к патологической ангиогенез3.

В глаза неоваскуляризация является причиной зрение опасных заболеваний, как пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR) и Неоваскулярная Глаукома (NVG). В этих глазных заболеваний, фокуса неоваскуляризация обычно расположен в ткани сетчатки, но дисбаланс в воспалительных и ангиогенных факторов в задней и передней окуляр камеры глаза был связан с Рубеоз Радужки, Клинические термин для Ирис патологических neoangiogenesis4. Эти патологии указывают взрослых Ирис возможность пройти ангиогенеза. В мышей глазной сосудистую незрелых после рождения и продолжается созревание послеродовой. Эта особенность развития эксплуатируется в мышиной модели кислорода индуцированной ретинопатии, модель, которая тесно имитирует клинического состояния ретинопатии недоношенных5. Кроме того ангиогенез и воспаления играют ключевую роль в ранозаживляющее механизмы6, и ранозаживляющее, сам был связан с ангиогенеза модели7.

В этом исследовании мы описываем модель прокола индуцированной Ирис неоваскуляризации. Увеальной проколы выполняются внешнее пределе лимба, который побудить Ирис неоваскуляризация, вызывая ранозаживляющее системы. Благодаря прозрачности роговицы, радужной оболочки сосудистую может быть легко проанализировано в vivo неинвазивным методом. Пункцию глаза представляют повышение сосудистого русла в радужке, который был связан с увеличением активации плазминоген и воспалительные маркеры8. Представленная модель имеет большой потенциал как новый инструмент для изучения ангиогенеза и скрининга ангиогенных соединений и позволяет непосредственно в vivo визуализации ангиогенных процессов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Щенков мыши BALB/c обоего пола были использованы в соответствии с заявлением для использования животных в офтальмологические и видение научных исследований, и протоколы были одобрены Комитетом Стокгольма этических исследований животных. Мышей были размещены в пометах, вместе с кормящей матери, с 12 ч. дневной/ночной цикл, свободный доступ к продовольствию и воде и контролируются ежедневно.

Примечание: Для хирургической процедуры, мышей держали под наркозом с летучих изофлюрановая. Глазной мази рекомендуется при глазных процедур, поскольку они могут мешать лечения и веществ, используемых. При необходимости, для предотвращения сухого глаза, капли стерильные нормальный физиологический раствор может применяться. Хотя увеальной проколы самовосстановления, был осторожность во время увеальной проколы для обеспечения стерильности с хирургических инструментов. После хирургического лечения включали гидратации с нормального физиологического раствора подкожно и анальгезии с глазной актуальные администрацией тетракаина гидрохлорида. Щенков было позволено восстановить грудной recumbency на грелку перед возвращением кормящей матери, в чистой клетке. Помёты хранились с же кормящая мать избежать стресса.

1. анестезия

  1. Подготовка камеры индукции анестезии, управлять изофлюрановая анестезии и убедитесь, что маска маленький мышь также сочетании.
    Примечание: Выполнение всех животных эксперименты с согласия всех применимых этических разрешений.
  2. Заполнять индукции камеры с 3-4% летучих изофлюрановая в атмосферном воздухе.
    Примечание: Различные обезболивающий вещества других, чем изофлюрановая может использоваться, согласно этическим разрешений. Летучих анестетиков процедуры следует проводить в проветриваемом скамейке или дыма капот.
  3. Место послеродовой щенка мыши BALB/c 12,5 дневных (P) в зале индукции. Убедитесь, что аппарат анестезии готовы доставить изофлюрановая в зале индукции.
    Примечание: Мышь детенышей являются хрупкими и лучше обрабатываются шиворот. Держите щенков вместе, как мусор или кормящая мать избежать стресса.
  4. Разрешить щенка будет полностью под наркозом.
  5. Осторожно забрать щенка мыши шиворот.
    Примечание: Держать индукции камера закрыта на все времена для безопасной и стабильной индукции.
  6. Передача мышь грызунов маске. Убедитесь в том, чтобы переключиться обезболивающий потока из камеры для индукции маски при перемещении мыши.
  7. Выполните щепотку ног для подтверждения анестезии.

2. пункция процедуры при хирургическом стереоскоп

  1. Поместите указатель мыши в боковых recumbency позиции. Убедитесь, что маска хорошо позиционируется поэтому мышь глаз находится в поле зрения стереоскоп.
  2. Осторожно поверните головку мыши, чтобы глаз вверх к стереоскоп.
    Примечание: Под стереоскоп должен быть достигнут четкий фокус глаза. Для позиционирования, рекомендуется увеличение 16 X, в то время как 40 X должны использоваться для выполнения хирургической процедуры. Если это этические разрешений, обрезки кончик усы может облегчить визуализации глаза.
  3. С помощью небольших связывая щипцы, тщательно торчат глаза щенка, применяя понижательное давление на веки дорсальной и вентральной для глаз.
  4. Держите нежно, но твердо держать веко глаза щенка, с небольшой щипцами.
    Примечание: Рекомендуется для выполнения глаз выступа и крышка Холдинг недоминирующих рукой, как доминирующей рукой следует выполнить процедуру прокола.
  5. Используйте стереоскоп найти лимба роговицы. Альбинос BALB/c лимба может быть легко идентифицирован круговой сосудистого сплетения кзади роговицы.
  6. Скошенная иглой 0,25 мм диаметр (30 G) выполните небольшой увеальной прокол, возле задней послабляющие предел сосудистая оболочка глаза. Использовать только кончик иглы, и не более половины (что эквивалентно 0,5 мм), конические прокол сосудистая оболочка глаза. Если выполняется правильно, увеальной проколы самоуплотняющийся, но внутриглазных инъекций исследования веществ может управляться через же прокол раны.
    Примечание: Если сталкивались с мыши глазной анатомии, увеальной пункция выполняется между Цилиарное тело и Ора Серрата. Будьте внимательны при выполнении увеальной пункция во избежание разрыва объектива.
  7. Выполните второй увеальной прокол в противоположном сайте глаз от первого прокола сайта. Оптимизировать расстояние и положение проколы; Рассмотрим 12 и 6 часов проколы, с 12 часов, как спинной, насколько это возможно.
  8. Повторите процедуру увеальной проколы каждые четыре дня до P24.5. Перед каждой последовательных увеальной прокол контролировать состояние животных, обращая особое внимание на присутствие травматическая катаракта, из-за повреждения объектива при увеальной прокола или очевидное снижение давления. Цель для выполнения повторных проколы на тех же позициях как предыдущий проколы для оптимального эффекта.

3. неинвазивный в естественных условиях мониторинг

  1. До пункции или инъекции каждый экспериментальный день анестезировать мышь, как выше.
  2. С помощью мыши в боковых recumbency позиции аккуратно торчат глаз.
  3. Сосредоточиться на сосудистую ирис с хирургической стереоскоп.
  4. Сделайте снимок сосудистую ирис с камеры установлены на хирургическом стереоскоп.
    Примечание: Хотя не обязательно, вызывая мейоз может быть полезным для нормализации ирис площадь на животных. При выборе мейоз заставить агент учитывать этические разрешений. Тщательное внимание Ирис сосудистую облегчит дальнейшего количественного анализа. Рекомендуется величина 40 X.

4. послеоперационный уход

  1. Удаление BALB/c щенка из грызунов маски и аккуратно перенести его на грелку слоистых с хирургической циновкой.
  2. Нанесите одну каплю 1% раствора тетракаин прокалываться глаза.
    Примечание: Другие болеутоляющие решения может использоваться, согласно этическим разрешений.
  3. Гидрат животное с подкожной инъекции 200 мкл стерильных нормальный физиологический раствор.
  4. Возвращение щенка для кормящей матери в клетку чистой мыши.
  5. Наблюдение за процессом восстановления. Щенка должны быть в состоянии deambulate и вернуться в помете.

5. глаза Энуклеация

  1. Усыпить животных на шейки матки дислокации. Для лучшей визуализации процедуры выполняют Энуклеация и рассечение под стереоскоп.
    Примечание: Различные эвтаназии процедуры могут использоваться. Рекомендуется строго придерживаться этических разрешений.
  2. Тяните за исключением веки для повышения воздействия на глаза.
  3. Сделайте небольшой надрез (примерно 0,5 см) вблизи угла глазной щели веки с изогнутые ножницы глаз Бонн.
  4. Используйте пространство подвергается Периокулярная для вставки микро связывая щипцами за (под) шара на орбите.
  5. Grab тканей, окружающих глаз и аккуратно потяните вверх. Избегайте держась глазного яблока, используйте ближе окружающих тканей глазницы.
  6. Вставьте изогнутые ножницы глаз Бонн позади глаз планеты на орбите.
  7. Прорезать окружающих тканей, до тех пор, пока глаза освобождается от розетки.
    Примечание: Эта техника рассечения поддерживает анатомии глаза и преимущества последующего анализа.
  8. Продолжить удаление посторонних ткани от глаз. Удаление посторонних ткани может выполняться после фиксации, если предпочтительнее.
    Примечание: Мышей BALB/c, меланин несовершенным, таким образом, чтобы увеличить контрастность, темный фон рекомендуется для облегчения процедуры вскрытия.
  9. Кратко промыть в целом глаза в чашке Петри заполнены с стерильных фосфат амортизированное saline (PBS).
  10. Перевести глаза в 2-мл пробирку, содержащего 1,5 мл 4% раствора буфер формалин.
  11. Исправить глаз за 6 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Фиксация придает жесткость ткани и облегчает препарирование радужки. Фиксация времени следует проверены и скорректированы для различных приложений.

6. Ирис процедура диссекции под стереоскоп

  1. Удалите фиксирующие решение из трубки с 1,5 мл Пластиковые пипетки Пастера (или аналогичный) и промойте глаза три раза с свежими PBS.
  2. Место фиксированного глаз в гладкую поверхность сухой (рассечение стенд) с передней камеры вверх.
  3. Скошенная иглой 30 G выполнения точки входа кзади лимба.
  4. Проведение переднего сегмента с небольшой связывая щипцами, вставьте один подсказки Клайманского-беззаботными прямые ножницы в ранее созданную.
    Примечание: Рекомендуется для управления щипцы с недоминирующей руки и ножницы с доминирующей.
  5. При вращении глаз с связывая щипцами, обвести лимба удалить заднего отрезка глаза.
    Примечание: Выполнение частичных сокращений позволит внутренний кончиком ножниц продолжать в ткани и значительно облегчает процесс.
  6. Положение переднего сегмента вниз, обнажая объектива.
  7. Осторожно выньте объектив захвата его с небольшой щипцами и потяните вверх.
    Примечание: Среза иглы могут использоваться для прокола и вытяните объектив.
  8. Положение переднего сегмента с роговицы, вниз и отрезок перпендикулярно поле зрения.
  9. Аккуратно схватить тканей кзади Цилиарное тело с небольшой связывая щипцами.
  10. С Клайманского-беззаботными прямые ножницы, приступить к обрезать только впереди цилиарного тела для удаления Трабекулярная сеть и изолировать радужки. Подтвердите, что удаляется Трабекулярная сеть; Радужная оболочка должна перемещаться в пределах роговицы.
  11. Тщательно передачи переднего наглазник с небольшой связывая щипцами, держа роговицы, 96-луночных пластины, содержащие 200 мкл PBS.
  12. Продолжайте удерживать роговицы в колодец и вскрыть радужки, перемещая с PBS с пипеткой.
    Примечание: Если Ирис остается приверженцем роговицы, некоторые Трабекулярная сеть может быть настоящее и конические иглой 30 G может использоваться для вытесняя радужки.
  13. Удаление роговицы из 96-луночных с небольшой связывая щипцами и держать изолированных Ирис в колодец для дальнейшего анализа.
  14. Хранить образцы свободно плавающего радужки при 4 ° C.
    Примечание: Несмотря на фиксированной, долгосрочного хранения Ирис свободные образцы не рекомендуется.

7. возможные экспериментальные Read-Outs

  1. Чтобы визуализировать кровеносных сосудов в расчлененных ирисы, используйте свободно плавающего состава Гора иммуногистохимия пятная методы для маркеров, такие как молекулы адгезии тромбоцитов эндотелиальных клеток (PECAM) -1 или isolectin B4. Кроме того используйте перфузии всего тела с сосудистой окрашивание, таких как декстраны люминесцентные меченых высокой молекулярной массой.
  2. Используете в vivo неинвазивная изображений для выполнения в silico плоским монтажа и количественно сосудистую полный ирис с соответствующим программным обеспечением обработки изображений.
    Примечание: Может быть квантифицировано сосудистую, как в естественных условиях , так и в пробирке, используя денситометрия или с сосудистую анализ программного обеспечения9.
  3. Процесс всего глазного яблока для нуклеиновых кислот и белка добычу, затем методом ПЦР или immunoblotting, для выполнения молекулярный анализ пункцию глаз.
    Примечание: Молекулярный анализ тканей лучше всего выполняется с нефиксированным ткани, но рассечение нефиксированное Ирис чрезвычайно сложной, и использовать весь глаз вынес статистически значимые результаты предыдущих исследований8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Альбинос щенков мыши BALB/c в P12.5 были подвергнуты увеальной проколы, повторяется каждый четвертый день (экспериментальный день 0, 4, 8, 12), до P24.5. В P27.5 были умерщвлены мышей и ирисы тщательно расчлененный (экспериментальный день 15). Мышь глаз были снимки с камеры, прикрепленной к хирургической стереоскоп перед каждой серии прокол в каждой экспериментальной день оценить неинвазивной оценки сосудистой реакции Ирис. Увеальной проколы побудить сосудистой ответ от радужки, вызывая р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем Протоколе представлен новый метод для индукции Ирис сосудистой реакции увеальной прокол. Пункция запускает механизмы заживления раны и способствует сосудистой ответы в Ирис10,11. Это согласуется с глазных патологий, таких как НДР и NVG, где усугубляется ангиогенных ответы от сетчатки в заднего отрезка глаза кульминацией клинического состояния Рубеоз Радужки, увеличение васкуляризации Ирис12 ,13

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Linnea Tankred и Диана Rydholm для животноводства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Боннские глазные ножницыBausch & Lomb23060
Clayman-Vannas изогнутые ножницыBausch & LombE3383 C
Прямые ножницы Clayman-VannasBausch & LombE3383 S
Адаптер для объектива для фотоаппаратаРучной работыН/ДИли любая система, позволяющая адаптировать фотоаппарат к микроскопу
Грелка 100-110 ВтНеприменимо Н/ДДоступно в зоомагазинах/ветеринарных магазинах
Игла для подкожных инъекций 30г скошеннаяKDM GmBH Германия911914
Iphone 4SAppleНе применимоИли другое устройство для получения изображения с высоким разрешением
IsofluraneBaxterKDG 9623
McPherson связывающие щипцыBausch & LombE1815 S
Щипцы для микросвязыванияBausch & Lomb63140
Minims тетракаина гидрохлоридBausch & LombN/A1 % (w/v) Глазные капли
Нейтральный буферизованный формалинBioreagens0018-40
Обычный солевой растворFresenius Kabi2103520,9 % (w/v) NaCl в инъекционной воде
Фосфатно-солевой буферThermoFisher Scientific10010023Сбалансированный и буферизированный PBS pH 7,4
Чашка Петри 10 смStarstedt83.3902
Чашка Петри 3 смStarstedt83.3900
Safe Seal Tube 2,0 млStarstedt72.685.200Или любая трубка типа eppendorf
TC plate 96-луночнаяStarstedt83.3924
Трансферная пипетка 3,5 млStarstedt86.1171Или любая другая пипетка Пастера типа
Univentor 400 анестезиологический аппаратUniventor LimitedN/AИли эквивалентный регулятор потока с индукционной камерой и маской для летучей анестезии
Wild M650 хирургический микроскопWild HeerbruggN/AИли другой хирургический или увеличительный стереоскоп

Ссылки

  1. Morrison, J. C., Van Buskirk, E. M. Anterior collateral circulation in the primate eye. Ophthalmology. 90 (6), 707-715 (1983).
  2. Dreyfuss, J. L., Giordano, R. J., Regatieri, C. V. Ocular Angiogenesis. J Ophthalmol. 2015, 892043(2015).
  3. Breuss, J. M., Uhrin, P. VEGF-initiated angiogenesis and the uPA/uPAR system. Cell Adh Migr. 6 (6), 535-615 (2012).
  4. Rodrigues, G. B., et al. Neovascular glaucoma: a review. Int J Retina Vitreous. 2, 26(2016).
  5. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  6. DiPietro, L. A. Angiogenesis and wound repair: when enough is enough. J Leukocy Biol. 100 (5), 979-984 (2016).
  7. Eming, S., Brachvogel, B., Odorisio, T., Koch, M. Regulation of angiogenesis: Wound healing as a model. Prog Histochem Cytoc. 42 (3), 115-170 (2007).
  8. Beaujean, O., Locri, F., Aronsson, M., Kvanta, A., André, H. A novel in vivo model of puncture-induced iris neovascularization. PloS One. 12 (6), e0180235(2017).
  9. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A Computational Tool for Quantitative Analysis of Vascular Networks. PloS One. 6 (11), (2011).
  10. Dorrell, M., Uusitalo-Jarvinen, H., Aguilar, E., Friedlander, M. Ocular neovascularization: basic mechanisms and therapeutic advances. Surv Ophthalmol. 52 Suppl 1, S3-S19 (2007).
  11. Kvanta, A. Ocular angiogenesis: the role of growth factors. Acta Ophthalmol. 84 (3), 282-288 (2006).
  12. Salman, A. G. Intrasilicone Bevacizumab Injection for Iris Neovascularization after Vitrectomy for Proliferative Diabetic Retinopathy. Ophthalmic Res. 49 (1), 20-24 (2013).
  13. Jeong, Y. C., Hwang, Y. H. Etiology and Features of Eyes with Rubeosis Iridis among Korean Patients: A Population-Based Single Center Study. PloS One. 11 (8), e0160662(2016).
  14. Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  15. Stefansson, E., Landers, M. B., Wolbarsht, M. L., Klintworth, G. K. Neovascularization of the Iris - an Experimental-Model in Cats. Invest Ophth Vis Sci. 25 (3), 361-364 (1984).
  16. Nork, T. M., Tso, M., Duvall, J., Hayreh, S. S. Cellular Mechanisms of Iris Neovascularization Secondary to Retinal Vein Occlusion. Arch Ophthalmol-Chic. 107 (4), 581-586 (1989).
  17. Hjelmeland, L. M., Stewart, M. W., Li, J. W., Toth, C. A., Burns, M. S., Landers, M. B. An Experimental-Model of Ectropion Uveae and Iris Neovascularization in the Cat. Invest Ophth Vis Sci. 33 (5), 1796-1803 (1992).
  18. Tolentino, M. J., Miller, J. W., Gragoudas, E. S., Chatzistefanou, K., Ferrara, N., Adamis, A. P. Vascular endothelial growth factor is sufficient to produce iris neovascularization and neovascular glaucoma in a nonhuman primate. Arch Ophthalmol-Chic. 114 (8), 964-970 (1996).
  19. Paula, J. S., et al. Rabbit Rubeosis Iridis Induced by Intravitreal Latex-derived Angiogenic Fraction. Curr Eye Res. 36 (9), 857-859 (2011).
  20. Takei, A., Ekström, M., et al. Gene Transfer of Prolyl Hydroxylase Domain 2 Inhibits Hypoxia-inducible Angiogenesis in a Model of Choroidal Neovascularization. Sci Rep. 7, 42546(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivoBALB cPECAM1

Похожие статьи