Методическая статья

Microarray Assay протеина для серологических определения антиген специфические антитела ответы следующие Clostridium difficile инфекции

DOI:

10.3791/57399

⸱

15 июня 2018 г.

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья описывает метод простой протеина microarray для профилирования гуморального иммунного ответа группе 7-plex высоко очищенный Clostridium difficile антигенов в человеческой сыворотки. Протокол может быть продлено определение специфического антитела ответов в подготовке поликлональных внутривенного иммуноглобулина.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставляем подробный обзор assay microarray романный протеин высокой пропускной способностью для определения анти -Clostridium difficile уровни антител в человеческой сыворотки и отдельных препаратов поликлональных внутривенного иммуноглобулина (IVIg). Протокол описывает методологические этапы подготовки проб, печать массивов, процедуры анализа и анализа данных. Кроме того этот протокол может быть дальнейшее развитие для включения различных клинических образцов, включая плазмы и клеточной supernatants культуры. Мы покажем, как microarray протеина может использоваться для определения сочетания изотипа (IgG, IgA, IgM), подкласс (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), и штамм специфических антител к высоко очищенный целый C. difficile токсинов A и B (toxinotype 0, штамм ВПИ 10463, ribotype-087), токсин B от C. difficile токсин B-только выражая штамм (CCUG 20309), предшественник формы фрагмента B бинарный токсин, pCDTb, ribotype специфических всей поверхности слой белков (SLPs; 001, 002, 027) и контролировать белков (столбняка Анатоксин и Candida albicans). В ходе эксперимента, microarrays проверяются с сывороток от физических лиц с C. difficile инфекции (CDI), лица с кистозный фиброз (CF) без диареи, здоровые элементы (HC) и от частных лиц до и пост IVIg терапии для лечение CDI, комбинированного иммунодефицита расстройства и хронических воспалительных демиелинизирующих polyradiculopathy. Мы сталкиваемся с существенные различия между группами пациентов, коммерческие препараты IVIg, и сера до и следующие внутривенное узкоспециализированного нейтрализации токсинов и multi изотип специфическое антитело уровней. Кроме того существует существенная корреляция между microarray и энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для уровней IgG антитоксин в образцах сыворотки. Эти результаты показывают, что microarray может стать перспективным средством для профилирования антитела ответы на антигены C.difficile прививку или инфицированных людей. С дальнейшего уточнения антигена панелей и снижением издержек производства мы ожидаем, что технология microarray дна может помочь оптимизировать и выберите наиболее клинически полезным immunotherapies C. difficile инфицирования пациента конкретным образом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает разработки и проверки assay microarray Роман и индивидуальных белков для обнаружения и полу количественной оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретных ответов на антигены C. difficile . Мы успешно используем наши C. difficile-assay microarray конкретные как перспективный новый инструмент для композиционных bioanalysis специфическое антитело содержание пациента сыворотки1,2, подготовка IVIg3, и выявление особенностей антитела, которые коррелируют с неблагоприятные исходы в CDI4. Мы демонстрируем, как образцы сыворотки biobanked и коммерческие препараты IVIg могут быть проанализированы на microarray слайды, позволяя высокое качество воспроизводимых профилирование C. difficile возбудителя специфические антитела ответов в этот assay.

Многие здоровые дети и взрослые имеют обнаружить сыворотке антител IgG и IgA C. difficile токсинов A и B5,6. Считается, что они возникают после временной экспозиции во время младенчества и после воздействия C. difficile в зрелом возрасте. По этой причине был поликлональных IVIg используется для лечения как периодических, так и молниеносный CDI7,8,9-лейбл. Однако его окончательного роль и режим действий остается неясным. Несколько исследований показали, что гуморального иммунного ответа на C. difficile токсинов играет роль в болезни презентации и результат. В частности бессимптомных больных показывают увеличение сыворотка анти-токсин IgG концентрации по сравнению с пациентами, которые разрабатывают симптоматической болезни10. Очевидном Ассоциация сообщила средний анти-токсин IgG титры и смертности от всех причин 30-день11. Несколько докладов также показали связь с защитой от повторения и антитела ответы на токсин A, B и несколько не токсин антигены (Cwp66, Cwp84, Флик, FliD и поверхностный слой белки (SLPs))12,13 , 14 , 15. Эти соображения стимулировали развитие первая пассивная иммунотерапия наркотиков таргетинга C. difficile токсин B (bezlotuxumab), который недавно был одобрен в США продуктов питания и медикаментов и европейские лекарства Агентство по предотвращению периодических CDI16. Стратегии вакцинации с использованием рекомбинантного токсин фрагменты или инактивированные токсины, также в настоящее время в развитие17,18,19. Эти новые терапевтические подходы, несомненно, будет стимулировать требование для оценки гуморального иммунного ответа на нескольких антигенов в больших выборок.

Сегодня существует заметное отсутствие коммерчески доступных высок объём анализов способны одновременно оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретные ответы на антигены C. difficile . Есть неудовлетворенные потребности в разработке таких анализов для облегчения будущих исследований и клинического применения. Microarrays протеина являются метод для иммобилизации большое количество индивидуально очищенные белки как пространственно организованный массив пятен на микроскопические поверхность на основе слайдов с помощью робототехнической системы, которая может быть либо контакта20 или не контакт Печать инструмент21. Пятна могут представлять собой сложные смеси, например lysates клетки, антитела, гомогенатах ткани, эндогенного или рекомбинантных белков пептиды, выделениями или наркотиков22,23.

Технология microarray протеина имеет явные преимущества над стандартной внутренней ELISA методы, которые традиционно использовались для оценки анти -C. difficile антитела ответов. К ним относятся расширение возможностей для обнаружения широкий спектр мульти изотип специфических антител против более обширная группа белковых мишеней, сокращение объема требований для антигенов, проб и реагентов и расширение возможностей для включения большего количество технических реплицирует, помимо нескольких внутреннего контроля качества (QC) меры1. Microarrays поэтому более чувствительным, точные и воспроизводимые и имеют больший динамический диапазон. Эти факторы делают microarrays дешевле и потенциально выгодные альтернативы ELISAs для крупномасштабных обнаружения известных белков. Однако недостатки технологии microarray главным образом результатом большой авансовые расходы, связанные с созданием группы высокоочищенных антигенов и создание технологической платформы.

Microarrays протеина широко использовались в последние два десятилетия как средство диагностики и базовые исследования в клинических приложений. Приложения включают в себя выражения протеина профилирования, исследование ферментов субстрат отношения, скрининг биомаркеров, анализ хост микробных взаимодействий и профилирование антитела специфика23,24, 25,26,27,28. Созданы многие новые microarrays белка/антиген возбудителя, в том числе малярией (Plasmodium)29, ВИЧ-130, гриппа31, тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)32, вирусные геморрагические лихорадки33 , Герпесвирусы34и35туберкулеза.

Настоящий Протокол относится к созданию легко операционных C. difficile реактивной антигена assay microarray, которая позволяет точной, точной и конкретной количественной оценки multi изотип и штамм специфические антитела ответы на C. несговорчивый антигенов в сыворотки и поликлональными IVIg. Здесь мы включить представителя результаты, относящиеся к приемлемым microarray пробирного производительность по сравнению с ELISA, а также анализа точности и воспроизводимости профили. Этот assay может быть дальнейшее развитие для профилирования других клинических образцов и устанавливает новый стандарт для исследований в молекулярные основы CDI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Microarray пластины

  1. Разбавить C. difficile антигены с буфером печати [PBS-анимации Трегалоза (50 мм)] в оптимальной концентрации, (который был предварительно перед запуском пациента sera): токсин (200 мкг/мл) и токсинном B (100 мкг/мл), pCDTb (200 мкг/мл) и очищенная родной весь SLPs, производный от риботипы 001, 002 и 027 (200 мкг/мл).
    Примечание: Токсинного B был получен от токсин B-выражая штамм CCUG 20309 (90 мкг/мл).
    1. Разбавьте позитивные элементы, лизатов C. albicansи столбнячного анатоксина с печати буфера на 100 мкг/мл. Наконец разбавляют очищенного иммуноглобулина человека соответствия протестированных антителом изотипа последовательно, начиная в 50 мкг/мл через 10 разведений в буфере печати для создания калибровочной кривой.
  2. Передача 10 мкл разведений в буфере печати в 384-ну плиту.
  3. Крышка с пластины печати и центрифуги на 300 x g за 5 мин.

2. Печать массивы с контактной робот

  1. Тепла кремния PIN-код, с помощью ручной газовой горелки 3 x 2 s каждый и прополоскать в чистой воде 3 x 3 s.
  2. Место пластину microarray дна в Загрузка картриджа arrayer.
  3. Место aminosilane слайды на панели слайдов.
    Примечание: Слайд лотка может вместить 27 слайды: три строки девяти слайдов. Слайды расположены в книжной ориентации, начиная с левой стороны в нижней строке, и остальная часть пространства покрыты пустых слайдов для обеспечения охвата всех отверстий на панели слайдов.
    1. Нажмите кнопку ОК и проверьте, что вакуум был включен и все слайды являются безопасными. Оставьте слайды в влажной среде для по крайней мере 1 час перед началом печати.
      Примечание: Aminosilane слайды предоставляются в герметичной упаковке с осушителем. После открытия, любые неиспользованные слайды должны быть немедленно возвращаться сушильный шкаф для хранения до истечения срока.
  4. Настройте программу подходящей печати для печати Clostridium difficile антигены. Запуск ТАС Комплект приложений и откройте файл необходимые параметры печати запуска из каталога «My координатной привязки выполняется». Выберите для печати всех антигенов Clostridium difficile в составленном Clostridium difficile файл.
  5. После двойного щелчка на значке microarray дна на главном окне называется «MicroArraying параметры» появится окно с тремя вкладками.  Три вкладки являются «Источник», «Цель» и «Параметры». Вкладка «Источник» показывает детали, количество проб, используемых в пластину microarray. На вкладке «Мишень» показывает детали как слайды должны быть загружены, где массив должен быть напечатан на слайде и редактировать макет слайда (16 подмассива форматов). На вкладке «Параметры» показывает детали протокола мыть и инструмент будет использоваться например. мыть после каждого завершенного образца. Чистый кремний pin между образцов, чтобы избежать любого загрязнения между различными образцами.
  6. Возможности программирования расположены в разделе Параметры > выполнить настройки на панели инструментов "ТАС" Комплект приложений. Есть 9 вкладки, чтобы работать через, в этом разделе, и как вы полный одну вкладку перейти к следующей, нажав на него. Нажав кнопку «OK» доставит вас из «Run предпочтения.» На вкладке «Общие» «Run предпочтения» существует ряд флажков в этом разделе, касающиеся как инструмент будет вести себя при запуске программы. Установите флажок «Премьер баня до начала выполнения», все три мойки подвергнутся последовательности коротких грунтовки до начала выполнения. Флажок «Мыть в начале выполнения», инструмент pin будет мыть, прежде чем посетить первый источник. Установите флажок «Стирка в конце выполнения», инструмент pin будет мыть после посещения последний источник. Пользователь может задать количество циклов стирки. В «Климат» на вкладке «Run преференций» начало увлажнения. Мы используем параметр заключаются в следующем: начать курс 55%, запуск скорость 55%, Минимальная влажность 55%, целевой показатель влажности 60%. Не запустить запустить до тех пор, пока влажность цель была достигнута, в противном случае пятна будет неправильный размер и библиотека быстро испарится.
  7. В меню бар ТАС нажмите зеленую кнопку.  Запустить запустить и периодически наблюдать что arrayer во время тиража быть определенные всё ОК.
    Примечание: Это позволяет анализ образцов 15 параллельно на каждом слайде, как один из подмассива используется как отрицательный контроль. Дизайн подмассивов определяется количество печатных белки (антигены) и количество печатных биологического реплицирует.
    Примечание: После печати каждого образца, голова движется в сторону стиральной ванны разрешить несколько погружения ПИН в две ванны мыть, содержащие дистиллированной воды и 0,002% 20 анимации для 1,5 s в каждой бане следуют ПИН с ультра-чистой водой для ополаскивания и сушки ПИН-кода в Основная стирка станция 4 s.

3. Хранение массивов

  1. Держите Распечатанные слайды, хранящиеся на ночь при комнатной температуре в эксикаторе.
    Примечание: Распечатанные слайды могут храниться до одной недели.

4. массив зондирование

  1. Осторожно поместите Распечатанные слайды в слайд владельца 16 несколькими хорошо камер формата.
    Примечание: Камер, имея глубину приблизительно 7,5 мм, обеспечивают щедрой поверхность соотношение объема для облегчения смешивания и мытье шаги.
  2. Разрешить все реагенты для тёплого к комнатной температуре перед использованием. Если не указано иное, выполните все следующие действия при комнатной температуре.
  3. 100 мкл отфильтрованных анимации 5% бычьего сывороточного альбумина (BSAT; используйте фильтр шприц 0.2 мкм) для каждого блока, охватывают слайды и инкубировать их встряхивании за 1 ч.
  4. Мыть слайды 5 x 1 мин в 120 мкл фосфата в буфер солевой с 20 анимации (PBST; 0,1% анимации) за хорошо встряхивании. Не дайте высохнуть слайды.
  5. Оттепель образцы сыворотки на льду для 20 мин и развести каждого образца с коммерчески доступных антитела разбавителя с фоном, сокращение компонента (см. Таблицу материалы).
    1. Оптимизируйте разведение образцов сыворотки согласно протестированных иммуноглобулинов, как показано в таблице 2.
  6. Передачи 100 мкл разбавленного сыворотки образцов для всех блоков, за исключением одного, который будет использоваться в качестве отрицательного контроля; в этот блок только добавьте 100 мкл антител разбавителя. Инкубируйте слайды с нежным агитации за 1 час.
  7. Вымойте слайды 5 x 3 мин в 120 мкл PBST (0.1% анимации) за хорошо встряхивании.
  8. 100 мкл антитела анти человека коза биотинилированным разбавленные антитела разбавителя.
    1. Оптимизируйте разрежения вторичные антитела согласно протестированных иммуноглобулинов, как описано в таблице 2. Обложка слайды и инкубировать их с нежным встряхивания в течение 1 ч.
  9. Вымойте слайды 5 x 3 мин в 120 мкл PBST за хорошо встряхивании.
  10. 100 мкл стрептавидина Cy5, для каждого блока, разводят в 1: 2000 в 5% BSA. Обложка слайды с фольгой, чтобы защитить их от света во время встряхивания в течение 15 мин с нежным агитации.
  11. Вымойте слайды 5 x 1 мин каждый в 120 мкл PBST за хорошо встряхивании, следуют 2 моет 1 мин в PBS только встряхивании.
  12. Спиновые слайды для 5 мин на 300 x g чтобы высушить их.
  13. Держите слайды в темной коробке для транспортировки и хранения при комнатной температуре.
  14. Перейти к сканирования массивы немедленно обеспечить последовательность сигнала после зондирования.
    Примечание: Однако, исследуемого слайды можно хранить в темноте и проверены в течение одной недели от зондирования.

5. сканирование массивов

  1. Включите лазерного сканера (см. Таблицу материалы) 30 мин перед сканированием для разогрева лазера. Загрузить программное обеспечение сканера и подключите компьютер к сканеру.
  2. Поместите слайд с лицом печатной стороной вверх в сканер, до тех пор, пока игра свет горит немигающим зеленым светом.
  3. Нажмите кнопку Параметры и настроить следующие параметры при сканировании слайдов следующим: режим сканирования, медиана; Приобретение, 635 только; Приобретение режим, ручной; Прибыль, 20; Мощность, низкая; Тип слайда, неподписанном слайд; Фокус, автоматической фокусировки. Выключить автоматическую прокрутку и равным 10 размер пикселя и сканирования 35 чтение штрих-кодов.
  4. Сохраните полученные изображения как 16-битные оттенки серого несколько изображений TIFF формат. Нажмите кнопку Импорт сетки и выберите в списке соответствующий массив.
    Примечание: Список массива описывает размер и положение подмассивов и имена печатных веществ, связанные с каждой функции индикатор.
    1. Выравнивание сетки пятна на слайде.
  5. Анализ изображений, нажав на кнопку процесс количественной оценки для измерения интенсивности флуоресценции сигнал каждое пятно и сохранить результаты в текстовом формате под названием GenePix результаты (ППГ).
    Примечание: ППГ файл содержит переменные локализации и идентификации целей антигена на массив и сигнал также интенсивности флуоресценции средний и местные фон, представляющий антитела связывая значения каждого пятна.

6. анализ данных

  1. Вычисление медианы для реплицирует каждого антигена после вычитание фона, используя бесплатный microarray анализ программного обеспечения, называется обратной фазы белка массив (RPPA) анализатор, модуль в рамках Статистический язык R на CRAN36.
  2. Участок калибровочной кривой и интерполировать сигналы каждого антигена относительно иммуноглобулина калибровочной кривой с помощью коммерческих научных графиков и статистики программное обеспечение (см. Таблицу материалы) для вычисления уровни антител.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 иллюстрирует блок-схемы, описывающие основные шаги в протоколе описаны. Рисунок 2 показывает тестов корреляции Спирмена, демонстрируя значительное соглашение между microarray и ELISA IgG и IgA анти-токсин A и B уровней в сыворотке пациента тест. Рисунок 3 показывает дифференциальной IgG и IgA антитела класса специфическое антитело ответы на токсин A, токсин B и бинарный токсин (pCDTb) у бол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы показали, что microarray является подходящей платформой для определения гуморального иммунного ответа до C. difficile белков антигенов в пациента сыворотки (рисунки 3 и 6) и коммерческие препараты IVIg (рис. 5). Мы также продемонстрировали, что техника microarray выполняет хорошо, когда по сравнению с обычными ELISA (рис. 2) и показывает отличную воспроизводимость, с внутри и между assay вариативност...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Гермес стипендий Негм Ola и Таня Монаган и через отдельное финансирование от центра Ноттингема пищеварительной заболеваний и NIHR Ноттингем пищеварительной заболеваний биомедицинских научно-исследовательского центра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, СШАN/A Contactarrayer используется для автоматического обнаружения антигенов на предметных стеклах.
Сканер InnoScan 710.InnopsysN/AФлуоресцентный микрочиповый сканер слайдов с красным (Cy5) лазером для считывания реакции.
Программное обеспечение MAPIX версии 7.2.0InnopsysN/AИзмеряйте интенсивность сигнала в пятнах.
Кремниевый контактный штифтParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Распечатайте образцы на предметных стеклах.
Thermo Scientific Nalgene DesiccatorThermo Scientific41102426Для хранения новых и напечатанных слайдов.
384-луночный планшетGenetixX7022UNдля приготовления антигенов.
Крышка пластиныSigma Aldrich, ВеликобританияCLS6570-100EAДля уменьшения испарения образцов.
Аминосилан слайдыSchott,  Германия1064875Слайд выбора для печати антигенов.
Держатели слайдовGraceBio Labs, США204862Разделите слайды на идентичные 16 подмассивов. Эти держатели представляют собой многоразовые, съемные, герметичные колодцы.
Candida albicans lysateNIBSCPR-BA117-SПоложительный контроль
столбнячного анатоксина Athens Research and Technology04/150Положительный контроль
иммуноглобулина G (IgG), нормальная плазма крови человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090707Очищенный нативный иммуноглобулин человека G IgG, плазма крови человека.
Иммуноглобулин G1 (IgG1), нормальная плазма крови человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090707-1Очищенный нативный иммуноглобулин человека G1 IgG1, плазма крови человека. 
Иммуноглобулин G2 (IgG2), нормальная плазма крови человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090707-2Очищенный нативный иммуноглобулин человека G2 IgG2, плазма крови человека.
Иммуноглобулин G3 (IgG3), нормальная плазма крови человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090707-3Очищенный нативный иммуноглобулин человека G3 IgG3, плазма крови человека.
Иммуноглобулин G4 (IgG4), нормальная плазма крови человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090707-4Очищенный нативный иммуноглобулин человека G4 IgG4, плазма человека.
Иммуноглобулин А (IgA), плазма крови человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090701Очищенный нативный иммуноглобулин человека А (IgA), плазма крови человека.
Иммуноглобулин А1 (IgA1), плазма крови миеломы человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090701-1MОчищенный нативный иммуноглобулин человека А1 (IgA1), плазма крови человека.
Иммуноглобулин А2 (IgA2), миелома человека в плазме Афины исследования и  Технологии   16-16-090701-2MОчищенный нативный иммуноглобулин человека А2 (IgA2), плазма крови человека.
Иммуноглобулин М (IgM), плазма крови человека  Афины исследования и  Технологии   16-16-090713Очищенный нативный иммуноглобулин человека М (IgM), плазма человека.
Биотинилированное антитело IgG к человеку у козы, специфичное для гамма-цепиVector LabsBA-3080Антитело к биотину козы против человеческого IgG (γ-chain) специфически реагирует с IgG человека, но не с другими иммуноглобулинами.
Мышиный античеловеческий IgG1 Hinge-BIOTSouthern Biotec9052-08 Антитела к биотину IgG1 козы специфически реагируют с человеческим IgG1, но не с другими иммуноглобулинами.
Мышиный античеловеческий IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08   Антитела к человеческому IgG2-биотину специфически реагируют с человеческим IgG2, но не с другими иммуноглобулинами.
Мышиный античеловеческий IgG3 Hinge-BIOTSouthern Biotec9210-08     Антитела к IgG3-биотину козы специфически реагируют с человеческим IgG3, но не с другими иммуноглобулинами.
Мышиный античеловеческий IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08   Антитела к IgG-биотину козы специфически реагируют с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами.
Антитела к человеческому IgA, специфичные для альфа-цепи, производятся у коз - BiotinylatedVector LabsBA-3030Антитела к IgG к человеческому биотину специфически реагируют с человеческими IgG, но не с другими иммуноглобулинами.
Мышиный античеловеческий IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08Антитело к IgG-биотину козы специфически реагирует с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами.
Мышиный античеловеческий IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08   Антитела к человеческому IgG-биотину специфически реагируют с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами.
Мышиный античеловеческий IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 Антитела к IgG-биотину козы специфически реагируют с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами.
Шприц-фильтр 0,2 ммThermo scientific723-2520Фильтр 5% БСА.
Бычья сыворотка альбумин (БСА)Sigma Aldrich, UKA7284Используйте 5% БСА для блокировки предметных стекол.
Разбавитель антителDako, UKS3022Для разбавления сыворотки и вторичного антитела.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011Обнаружение иммунной реакции.
Очищенные цельные токсины C. difficile A и B (токсинотип 0, штамм VPI 10463, риботип 087)Группа токсинов, Общественное здравоохранение АнглииNA
Очищенный цельный токсин C. difficile B (CCUG 20309 токсин B только экспрессирующий штамм)Группа токсинов, Общественное здравоохранение АнглииNA
Прекурсор формы B-фрагмента бинарного токсина, pCDTbУниверситет Бата NAПроизводится в E. coli из полностью синтетической рекомбинантной генной конструкции. Аминокислотная последовательность на основе опубликованной последовательности из риботипа 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Очищенные нативные белки поверхностного слоя, специфичные для всего риботипа (001, 002, 027),Дублинский городской университет NA
Vigam (подготовка к IVIg 1)Больницы Ноттингемского университета NHS TrustN/A Privigen
(подготовка к IVIg 2)Больницы Ноттингемского университета NHS TrustN/A
Intratect (подготовка к IVIg 3)Больницы Ноттингемского университета NHS TrustN/A

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
  3. Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
  4. Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).
  5. Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
  6. Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
  7. Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
  8. Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
  9. Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
  10. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
  11. Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
  12. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
  13. Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
  14. Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
  15. Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
  16. Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
  17. Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
  18. Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
  19. Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
  20. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  21. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
  22. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).
  23. Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
  24. Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
  25. Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
  26. Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
  27. Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
  28. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
  29. Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
  30. Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
  31. Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529(2011).
  32. Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
  33. Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).
  34. Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842(2013).
  35. Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349(2015).
  36. Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
  37. Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452(2013).
  38. Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
  39. Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
  40. Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Clostridium difficile Antibody DetectionAntigen specific Antibody ResponseSerum Sample AnalysisArray Printing ProcedureFluorescence Intensity MeasurementELISA Correlation AnalysisIsotype Subclass DeterminationToxin A Toxin B DetectionPatient specific Immunotherapy Optimization

Похожие статьи