Эта статья описывает метод простой протеина microarray для профилирования гуморального иммунного ответа группе 7-plex высоко очищенный Clostridium difficile антигенов в человеческой сыворотки. Протокол может быть продлено определение специфического антитела ответов в подготовке поликлональных внутривенного иммуноглобулина.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Microarray Assay протеина для серологических определения антиген специфические антитела ответы следующие Clostridium difficile инфекции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы предоставляем подробный обзор assay microarray романный протеин высокой пропускной способностью для определения анти -Clostridium difficile уровни антител в человеческой сыворотки и отдельных препаратов поликлональных внутривенного иммуноглобулина (IVIg). Протокол описывает методологические этапы подготовки проб, печать массивов, процедуры анализа и анализа данных. Кроме того этот протокол может быть дальнейшее развитие для включения различных клинических образцов, включая плазмы и клеточной supernatants культуры. Мы покажем, как microarray протеина может использоваться для определения сочетания изотипа (IgG, IgA, IgM), подкласс (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), и штамм специфических антител к высоко очищенный целый C. difficile токсинов A и B (toxinotype 0, штамм ВПИ 10463, ribotype-087), токсин B от C. difficile токсин B-только выражая штамм (CCUG 20309), предшественник формы фрагмента B бинарный токсин, pCDTb, ribotype специфических всей поверхности слой белков (SLPs; 001, 002, 027) и контролировать белков (столбняка Анатоксин и Candida albicans). В ходе эксперимента, microarrays проверяются с сывороток от физических лиц с C. difficile инфекции (CDI), лица с кистозный фиброз (CF) без диареи, здоровые элементы (HC) и от частных лиц до и пост IVIg терапии для лечение CDI, комбинированного иммунодефицита расстройства и хронических воспалительных демиелинизирующих polyradiculopathy. Мы сталкиваемся с существенные различия между группами пациентов, коммерческие препараты IVIg, и сера до и следующие внутривенное узкоспециализированного нейтрализации токсинов и multi изотип специфическое антитело уровней. Кроме того существует существенная корреляция между microarray и энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для уровней IgG антитоксин в образцах сыворотки. Эти результаты показывают, что microarray может стать перспективным средством для профилирования антитела ответы на антигены C.difficile прививку или инфицированных людей. С дальнейшего уточнения антигена панелей и снижением издержек производства мы ожидаем, что технология microarray дна может помочь оптимизировать и выберите наиболее клинически полезным immunotherapies C. difficile инфицирования пациента конкретным образом.
Введение
Этот протокол описывает разработки и проверки assay microarray Роман и индивидуальных белков для обнаружения и полу количественной оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретных ответов на антигены C. difficile . Мы успешно используем наши C. difficile-assay microarray конкретные как перспективный новый инструмент для композиционных bioanalysis специфическое антитело содержание пациента сыворотки1,2, подготовка IVIg3, и выявление особенностей антитела, которые коррелируют с неблагоприятные исходы в CDI4. Мы демонстрируем, как образцы ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка Microarray пластины
- Разбавить C. difficile антигены с буфером печати [PBS-анимации Трегалоза (50 мм)] в оптимальной концентрации, (который был предварительно перед запуском пациента sera): токсин (200 мкг/мл) и токсинном B (100 мкг/мл), pCDTb (200 мкг/мл) и очищенная родной весь SLPs, производный от риботипы 001, 002 и 027 (200 мкг/мл).
Примечание: Токсинного B был получен от токсин B-выражая штамм CCUG 20309 (90 мкг/мл).- Разбавьте позитивные элементы, лизатов C. albicansи столбнячного анатоксина с печати буфера на 100 мкг/мл. Наконец разбавляют очищенного иммуноглобулина человека соответствия протестированных антит....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 иллюстрирует блок-схемы, описывающие основные шаги в протоколе описаны. Рисунок 2 показывает тестов корреляции Спирмена, демонстрируя значительное соглашение между microarray и ELISA IgG и IgA анти-токсин A и B уровней в сыворотке пациента тест. Рисунок 3 показывает дифференциальной IgG и IgA антитела класса специфическое антитело ответы на токсин A, токсин B и бинарный токсин (pCDTb) у бол.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе мы показали, что microarray является подходящей платформой для определения гуморального иммунного ответа до C. difficile белков антигенов в пациента сыворотки (рисунки 3 и 6) и коммерческие препараты IVIg (рис. 5). Мы также продемонстрировали, что техника microarray выполняет хорошо, когда по сравнению с обычными ELISA (рис. 2) и показывает отличную воспроизводимость, с внутри и между assay вариативност.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Это исследование было поддержано Гермес стипендий Негм Ola и Таня Монаган и через отдельное финансирование от центра Ноттингема пищеварительной заболеваний и NIHR Ноттингем пищеварительной заболеваний биомедицинских научно-исследовательского центра.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, США | N/A Contact | arrayer используется для автоматического обнаружения антигенов на предметных стеклах. |
| Сканер InnoScan 710. | Innopsys | N/A | Флуоресцентный микрочиповый сканер слайдов с красным (Cy5) лазером для считывания реакции. |
| Программное обеспечение MAPIX версии 7.2.0 | Innopsys | N/A | Измеряйте интенсивность сигнала в пятнах. |
| Кремниевый контактный штифт | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Распечатайте образцы на предметных стеклах. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | Для хранения новых и напечатанных слайдов. |
| 384-луночный планшет | Genetix | X7022UN | для приготовления антигенов. |
| Крышка пластины | Sigma Aldrich, Великобритания | CLS6570-100EA | Для уменьшения испарения образцов. |
| Аминосилан слайды | Schott, Германия | 1064875 | Слайд выбора для печати антигенов. |
| Держатели слайдов | GraceBio Labs, США | 204862 | Разделите слайды на идентичные 16 подмассивов. Эти держатели представляют собой многоразовые, съемные, герметичные колодцы. |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Положительный контроль |
| столбнячного анатоксина | Athens Research and Technology | 04/150 | Положительный контроль |
| иммуноглобулина G (IgG), нормальная плазма крови человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090707 | Очищенный нативный иммуноглобулин человека G IgG, плазма крови человека. |
| Иммуноглобулин G1 (IgG1), нормальная плазма крови человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090707-1 | Очищенный нативный иммуноглобулин человека G1 IgG1, плазма крови человека. |
| Иммуноглобулин G2 (IgG2), нормальная плазма крови человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090707-2 | Очищенный нативный иммуноглобулин человека G2 IgG2, плазма крови человека. |
| Иммуноглобулин G3 (IgG3), нормальная плазма крови человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090707-3 | Очищенный нативный иммуноглобулин человека G3 IgG3, плазма крови человека. |
| Иммуноглобулин G4 (IgG4), нормальная плазма крови человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090707-4 | Очищенный нативный иммуноглобулин человека G4 IgG4, плазма человека. |
| Иммуноглобулин А (IgA), плазма крови человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090701 | Очищенный нативный иммуноглобулин человека А (IgA), плазма крови человека. |
| Иммуноглобулин А1 (IgA1), плазма крови миеломы человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090701-1M | Очищенный нативный иммуноглобулин человека А1 (IgA1), плазма крови человека. |
| Иммуноглобулин А2 (IgA2), миелома человека в плазме | Афины исследования и Технологии | 16-16-090701-2M | Очищенный нативный иммуноглобулин человека А2 (IgA2), плазма крови человека. |
| Иммуноглобулин М (IgM), плазма крови человека | Афины исследования и Технологии | 16-16-090713 | Очищенный нативный иммуноглобулин человека М (IgM), плазма человека. |
| Биотинилированное антитело IgG к человеку у козы, специфичное для гамма-цепи | Vector Labs | BA-3080 | Антитело к биотину козы против человеческого IgG (γ-chain) специфически реагирует с IgG человека, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Мышиный античеловеческий IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Антитела к биотину IgG1 козы специфически реагируют с человеческим IgG1, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Мышиный античеловеческий IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Антитела к человеческому IgG2-биотину специфически реагируют с человеческим IgG2, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Мышиный античеловеческий IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Антитела к IgG3-биотину козы специфически реагируют с человеческим IgG3, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Мышиный античеловеческий IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Антитела к IgG-биотину козы специфически реагируют с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Антитела к человеческому IgA, специфичные для альфа-цепи, производятся у коз - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Антитела к IgG к человеческому биотину специфически реагируют с человеческими IgG, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Мышиный античеловеческий IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Антитело к IgG-биотину козы специфически реагирует с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Мышиный античеловеческий IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Антитела к человеческому IgG-биотину специфически реагируют с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Мышиный античеловеческий IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Антитела к IgG-биотину козы специфически реагируют с человеческим IgG, но не с другими иммуноглобулинами. |
| Шприц-фильтр 0,2 мм | Thermo scientific | 723-2520 | Фильтр 5% БСА. |
| Бычья сыворотка альбумин (БСА) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Используйте 5% БСА для блокировки предметных стекол. |
| Разбавитель антител | Dako, UK | S3022 | Для разбавления сыворотки и вторичного антитела. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Обнаружение иммунной реакции. |
| Очищенные цельные токсины C. difficile A и B (токсинотип 0, штамм VPI 10463, риботип 087) | Группа токсинов, Общественное здравоохранение Англии | NA | |
| Очищенный цельный токсин C. difficile B (CCUG 20309 токсин B только экспрессирующий штамм) | Группа токсинов, Общественное здравоохранение Англии | NA | |
| Прекурсор формы B-фрагмента бинарного токсина, pCDTb | Университет Бата | NA | Производится в E. coli из полностью синтетической рекомбинантной генной конструкции. Аминокислотная последовательность на основе опубликованной последовательности из риботипа 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Очищенные нативные белки поверхностного слоя, специфичные для всего риботипа (001, 002, 027), | Дублинский городской университет | NA | |
| Vigam (подготовка к IVIg 1) | Больницы Ноттингемского университета NHS Trust | N/A Privigen | |
| (подготовка к IVIg 2) | Больницы Ноттингемского университета NHS Trust | N/A | |
| Intratect (подготовка к IVIg 3) | Больницы Ноттингемского университета NHS Trust | N/A |
Ссылки
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
Определение антител к Clostridium difficileантигенспецифический антительный ответанализ образцов сывороткипроцедура печати массиваизмерение интенсивности флуоресценциикорреляционный анализ ИФАопределение изотипов подклассовопределение токсина А и токсина Воптимизация индивидуальной иммунотерапии пациентов
