Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ассамблея и очистки прототип пенистый вирус Intasomes

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57453

⸱

19 марта 2018 г.

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Рекомбинантных ретровирусной интеграза и ДНК олигомеров, подражая вирусной ДНК концы могут образовывать ферментативно активный комплекс, известный как intasome. Intasomes может использоваться для исследования биохимических, структурных и кинетические. Этот протокол описывает собрать и очистить прототип пенистый вирус intasomes.

Аннотация

A определение функции и необходимый шаг жизненного цикла ретровируса является интеграция вирусного генома в геноме принимающей. Все ретровирусы кодировать фермент интеграза (IN), который катализирует ковалентных присоединения вирусных хост ДНК, который известен как стренги передачи. Интеграция может быть моделируется в пробирке с рекомбинантным антиретровирусного лечения в и ДНК олигомеров, подражая концы вирусного генома. Для того, чтобы более тесно пилки интеграции реакции, которая происходит в естественных условиях, интеграции комплексы собираются из рекомбинантных IN и синтетические олигомеров методом диализа в буфере снижение концентрации соли. Интеграции комплекса, называется intasome, может очистить хромотографией размер исключения. В случае прототип пенистый вирус (PFV) intasome Тетрамер IN и два ДНК олигомеров и легко отделяется от мономерных IN и бесплатные олигомера ДНК. Эффективность интеграции PFV intasomes может assayed под целый ряд экспериментальных условиях, чтобы лучше понять динамику и механики ретровирусной интеграции.

Введение

Интеграция вирусного генома в геноме хост это обязательный шаг в жизненном цикле все ретровирусы1. Вирусный фермент интеграза (IN) катализирует ковалентных присоединения каждого конца вирусной ДНК генома к хосту ДНК. Во время сотовой инфекции в является частью комплекса до интеграции, которая опосредует интеграции. В рекомбинантной complexed с двойной мель ДНК олигомеров, подражая вирусной ДНК концы можно также выполнить интеграцию целевых ДНК в пробирке2. Общей интеграции пробирного в vitro использует supercoiled плазмиды ДНАО цели. Интеграция обеих вирусной ДНК олигомеров (vDNA) для плазмида приводит в линейный продукт и называется согласованной интеграции (рисунок 2A). Интеграции пробирного в пробирке может также принести продуктов с ковалентно присоединены к целевой плазмида, что приводит к расслабленной круг только один vDNA. Этот продукт интеграции половину сайт, как представляется, артефакт пробирного в пробирке.

В рекомбинантной и vDNA могут выполнять интеграцию в пробирке, но они не являются идеальным реагенты для изучения динамики или структуры интеграции комплексов, когда мономерных в будет затушевывать соответствующие визуализации. Очищенный интеграции комплексов, или «intasomes,» необходимы для анализа или структурные исследования динамических одной молекулы. PFV IN и vDNAs могут собираться методом диализа с относительно высокой концентрации соли буфера меньше концентрация соли3,4. Во время диализа, преципитат формы. Этот осадок удаляется из диализа и увеличение концентрации соли. Более высокие концентрации соли solubilizes осадок содержащий PFV intasomes. Intasomes затем очищенная методом размер гель-проникающей хроматографии (SEC). Было показано, что рекомбинантных прототип пенистый вирус (PFV) в существование в качестве мономера в растворе в концентрациях до 225 мкм5. SEC фракционирование эффективно отделяет PFV intasomes (225.5 кДа), который включает в себя Тетрамер PFV в и два vDNAs, от мономерных PFV в (44,4 кДа) и бесплатные vDNA (24.0 кДа). PFV intasomes могут быть заморожены и удерживать интеграции деятельности по крайней мере шесть месяцев хранения на-80 градусов.

Рекомбинантных PFV intasomes также могут быть изменены для включения в аминокислотных замен или усечение мутации или vDNAs помечены флуорофоров или биотин4,6. Очищенный intasomes PFV легко выполнить интеграцию в мишень supercoiled плазмида ДНК в пробирке. Массовых анализов биохимической интеграции с intasomes может проверить последствия в мутации, ингибиторы, или других химических добавок. Биотинилированным intasomes может использоваться для датчика близости с нуклеиновых кислот и белков. PFV intasomes функционируют при температуре окружающей среды, позволяя одной молекулы микроскопии анализа Магнитные пинцеты для измерения времени между присоединения двух концах vDNA или полное внутреннее отражение флуоресценции для визуализации intasome Поиск цели ДНК6. Кроме того PFV intasomes были первым быть структурно характеризуется значительно влияющих области антиретровирусного лечения интеграции3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. отжиг из vDNA

  1. Комбинат 1 X 10 буфера (10 X 10 складе: 100 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 M NaCl, ЭДТА 10 мм), 10 мкм 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 мкм складе) и 10 мкм Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', запас 100 мкм) в окончательном объеме 1,5 мл . Аликвота 25 мкл в шестьдесят 0,2 мл полимеразной цепной реакции (ПЦР) трубы.
    Примечание: В зависимости от приложения, олигомеры может быть изменен с флуорофоров или теги в 5'-конце Oligo 2 или как внутреннего амино T в базовый 13 от 5'-конце Oligo 1. Изменение олигомеров должны быть очищены высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) до отжига. Мы нашли, что 5'-конце Cy3 и Cy5 Флюорофор маркировки Oligo 2 снижает эффективность Ассамблея intasome в 10 раз. Внутренние Флюорофор маркировки не снижать эффективность Ассамблеи.
  2. Отжиг Термоциклер с помощью следующих раз и температуры: 1 цикл в 94.0 ˚C 3 мин., 99 циклов в (94.0 ˚C 1 мин, 93,6 ˚C 1 мин) уменьшение обоих температур 0,8 ° c за цикл (последний цикл составляет 14,8 градусов 1 мин, 14,4 ˚C 1 мин) и хранить в 4.0 ˚C.
  3. Объединить отжига реакции от всех шестидесяти трубы. Загрузите 500 мкл до двух 0,5 мл 3 кДа молекулярный вес отсечки (MWCO) ultracentrifugal фильтр концентрации единиц. Концентрат отожженная vDNA центрифугированием в microcentrifuge в 14.000 x g 10 мин при комнатной температуре (RT).
    Примечание: Концентрируются объем должен быть ~ 50 мкл в каждом подразделении концентрации.
  4. Слейте через поток. 250 мкл оставшихся отожженная vDNA, каждый блок фильтра. Повторите спин и отбросить через поток. Буфер обмена в буфер TE (10 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 мм ЭДТА) путем промывания три раза с 450 мкл TE.
  5. Инвертировать фильтр и спина на 1000 x g на 2 мин на RT. Окончательный концентрируются объем для каждого подразделения, фильтр должен быть ~ 50 мкл. объединить retentates и передачи 1,5 мл колпачок.
  6. Измерьте абсорбция 260 Нм ультрафиолетового (УФ) vDNA. Это значение используется для расчета окончательного молярной концентрации ДНК. Коэффициент вымирания (260ε) этот vDNA-622,803 см-1 М-1 и его молекулярная масса является 23,972 ПДР магазина на уровне-20 ° c.

2. Intasome Ассамблея

  1. Если это возможно выполните Ассамблея intasome в маленькой комнате с переменной термостат. Отрегулируйте термостат до приблизительно 18-22 ˚C.
    Примечание: В нашем опыте, неэффективно intasome Ассамблеи на 4 градусов.
  2. Подготовка 1 Л диализа буфера (20 мм бис трис пропан, pH 7.5, 200 мм NaCl, 2 мм Дитиотреитол (DTT), 25 мкм ZnCl2) в 2 Л стакан с баром переполох на табличке, перемешать. Сбалансировать буфер в зале 18-22 ° c для по крайней мере 6 ч.
  3. Чтобы собрать intasomes, сочетать пропан 50 мм бис трис, pH 7.5, 500 мм NaCl, 120 мкм PFV в и 50 мкм vDNA в общем объеме 150 мкл.
    Примечание: PFV в должна быть свободной от загрязнения нуклеиназы деятельности7,8. Если концентрация PFV в слишком разреженных, чтобы вместить 120 мкм в объема 150 мкл, то можно увеличить окончательный объем до 200 мкл. Важнейшими факторами этого шага являются для поддержания молярное соотношение в vDNA (2.4:1) и иметь достаточно комплекс для визуализации при хроматографии.
  4. Очистите ~ 10 см длинный кусок 10-мм 6-8 кДа MWCO диализа НКТ и клипы с двойной дистиллированной воды (ddH2O) или высокой чистоты воды. Прикрепите один конец трубки.
    Примечание: Диализ труб следует рассматриваться с осторожностью во избежание любого возможного загрязнения от пространства в лаборатории.
  5. Сделайте 15 мл буфера промывки труб диализа (пропан 50 мм бис трис, pH 7.5, 500 мм NaCl). Промывайте внутри трубы диализа три раза с 1-2 мл промывки буфера. Удалите как можно больше промойте буфера как можно с пипеткой и тонкого геля загрузки подсказки.
  6. При необходимости используйте чистые лезвия бритвы или скальпеля для резки труб диализа, таким образом, чтобы кончик тонкой гель загрузки может достичь к концу трубки.
  7. Передать intasome Ассамблеи на шаге 2.3 диализа трубки с пипетки и тонкий гель загрузки подсказки. Клип открытый конец трубы диализа, свести к минимуму количество воздуха, представил в трубку. Место труб в буфере диализа.
  8. Dialyze ночи (16-20 ч) с нежным перемешивания так, чтобы трубка вращается, но не в вихрь. Убедитесь, что диализа Трубы погружные и мобильных. После приблизительно одного часа наблюдать видимый преципитат внутри труб.
    Примечание: С Cy3 и Cy5 дневно помечены vDNA, осадок является более очевидным. Это верно для конца помечены и внутренне помечены флуоресцентный vDNA.

3. Intasome солюбилизация

  1. Подготовьте две широкие родила наконечники, удалив 2-4 мм от конца 200 мкл наконечник с нового лезвия бритвы или скальпель на чистую поверхность.
    Примечание: Советы будет использоваться на шаге 3.3 и 3.5.
  2. Удаление диализа труб из буфера диализа. Для того, чтобы избежать разбавления образца intasome с диализа буфера, которые могут оставаться в конце трубки возле клипа, используйте микропипеткой с наконечником небольшой пипетку для удаления любой избыток диализа буфер. Удалите клип из одного конца трубы диализа.
  3. Использование широкого родила наконечник пипетки от шаг 3.1 для передачи образцов, включая осадок внутри трубы диализа для 1.5 мл на льду. Обратите внимание, общий объем изъятых материалов; Общий объем составляет обычно ~ 140 мкл.
  4. Образец с осадком находится на расстоянии 200 мм NaCl; увеличения соли до конечной концентрации 320 мм NaCl, добавив соответствующий объем запасов 5 М раствора NaCl. Например, для образца 150 мкл, мкл 3,9 М NaCl и 1.1 мкл ddH2O для окончательного количества 155 мкл. Передача ведро льда с образца в холодной комнате 4 градусов.
  5. Использование широкого родила наконечник пипетки от шаг 3.1 Ресуспензируйте и солюбилизировать последнего осадок, закупорить. Повторяйте каждые 20 мин для по крайней мере 1 h. наблюдать, что большинство осадок должен идти в раствор.
    Примечание: Дозирование Ресуспензируйте осадок может быть остановлена, когда становится очевидным, что осадок не заметно уменьшается между моментами времени. Когда vDNA не обозначена или внутренне помечены, осадок уменьшается ~ 90% на основе визуального осмотра. В случае Cy5 конец помечены vDNA осадок уменьшается только ~ 20%; Большая часть осадка с Флюорофор концом, помечены vDNA не будет солюбилизировать последнего. Количество осадка, который эффективно солюбилизирован является переменной и должно определяться эмпирически.

4. Intasome очистки

  1. Подготовка 250 мл размер гель-проникающей хроматографии (SEC) работает буфер (20 мм бис трис пропан, pH 7.5, 320 мм NaCl, 10% глицерина). Стерильные фильтр буфер с 0,2 мкм фильтр блока и хранить при 4 ° c.
    Примечание: Все очистки шаги выполняются в холодной комнате 4 градусов.
  2. Сбалансировать столбец сшитого агарозы SEC (диаметр = 10 мм; длина = 300 мм; кровать тома = 24 мл; объем пробы = 25-500 мкл; максимальное давление = 1,5 МПа; исключение предел = 4 x 107 да; отделяет молекулярным весом между 5 и 5000 кДа, см циновка таблицы erials) с SEC идущий буфер со скоростью потока 0,4 мл/мин.
    Примечание: Этот очистки может быть адаптирована к разного размера исключение столбцов если они способны эффективно отделить 300 кДа от 44 кДа, например Superose 12 10/300 GL или Superose 6 увеличение. Superose 12 10/300 GL имеет более низкое разрешение, ведет к более совпадения пиков. И наоборот Superose 6 увеличение имеет высокое разрешение и предлагает лучшее разделение.
  3. Центрифуга intasome образца в отцентрифугировать в 14.000 x g 10 мин на 4 ° c для пеллет любые оставшиеся преципитат. Осторожно удалите супернатант. Загрузите супернатант в цикл впрыска 200 мкл (трубы, который может содержать ~ 200 мкл). Примените образец к столбцу сек.
    Примечание: Меньшие объемы нагрузки позволяют большее разрешение, SEC.
  4. Элюировать с 25 мл сек работает буфер и собирать 95 фракций 270 мкл. наблюдать, что Хроматограмма SEC показывает три вершины260 A280/a (рис. 1).
    Примечание: Первая должна быть агрегатную (~9.0 - элюции 11,5 мл), а затем PFV Тетрамер intasome пик (~12.0 - элюции 14.75 мл) и PFV на мономера с бесплатным vDNA пик (~15.0 - 18,0 мл).

5. Интеграция Strand передачи Assay, фракция выбора и хранения

  1. Объединить 2 мкл каждой фракции пик intasome и 50 нг 3 КБ supercoiled плазмидной ДНК (фондовых концентрация составляет 50 нг/мкл) в реакции буфера (10 мм бис трис пропан, pH 7.5, 110 мм NaCl, 5 мм MgSO4, 4 мкм ZnCl2, 10 мм DTT) в объеме 15 мкл окончательной реакции. Инкубируйте на 37 градусов в течение 5 мин.
  2. Включите отрицательный контроль с не добавлен PFV intasome. Остановить реакции с 0,75 мкл протеиназы K (Стоковый раствор 20 мг/мл) и 0,75 мкл SDS (10% раствор). Инкубируйте на 55 ° c для образцов магазина 1 ч. при необходимости на уровне-20 ° c для последующего анализа.
    Примечание: Этот assay является качественной оценки деятельности по интеграции. Молярная концентрация intasome каждой фракции не определена до этот assay. Фракции, включены в assay переноса стренги интеграции могут храниться на льду (включая ночь хранения) до интеграции деятельность подтверждается и отдельных фракций aliquoted. Здесь мы используем pMP2, производные pUC199. Мы также успешно использовали 5.4 kb плазмида pcDNA 3.1. Плазмиды, которые могут быть решены спокойно круг, линейная, и supercoiled форм может использоваться в качестве целевой для интеграции.
  3. Подготовка 120 мл 1% веса на геле агарозы тома (w/v) 1 X TAE буфера (40 мм трис ацетат, 1 ЭДТА) с 0,1 мкг/мл ethidium бромид (бромистый этидий, раствор 10 мг/мл)10. Растопить агарозы решения и налить его в лоток литья гель 15 x 10 см. Вставка 15-Ну гребень с 5-мм широкий, 0,75 мм толщиной скважин.
    Примечание: Узкий скважин дают лучшее разрешение группы, по сравнению с 1,5 мм толщиной скважин.
  4. Разрешить гель затвердевают при комнатной температуре. Погружайте гель в 1 X TAE с 0,1 мкг/мл бромистый этидий.
  5. Добавьте 3 мкл 50% глицерина в каждой интеграции реакции от шага 5.2. Загрузите весь реакции объем геля. Загрузить 1 мкл 10 kb ДНК размер маркера (150 нг/мкл запасов концентрации) полосы по обе стороны образцов; Иными словами размер маркера ДНК следует фланг образца полос.
  6. В наружной Лейн нагрузки 6 мкл G оранжевый краситель (0,25% оранжевый G, 30% глицерина). Побегите гель при постоянном напряжении, 10 V/см (100 V) при температуре окружающего воздуха за 1 ч, или до тех пор, пока краска передний оранжевый G достигает конца геля.
  7. Сразу же изображение агарозном геле с флуоресцентные сканера, набор для обнаружения бромистый этидий (532 нм возбуждения, 610 Нм фильтра выбросов). Если Флюорофор помечены vDNAs были использованы, также изображения с соответствующим Флюорофор параметры.
    Примечание: например, для обнаружения Cy5 помечены ДНК, изображения с помощью 633 нм возбуждения и 670 нм выбросов фильтры. Согласованной интеграции продуктов (CI, линейной ДНК) следует выставить истинный размер ~ 3 КБ, непрореагировавшего supercoiled плазмиды (SC) должны быстрее (~ 2 kb), и половина сайт интеграции продуктов (HSI, расслабленной круг ДНК) должен выполняться медленнее (~3.5 kb). Непрореагировавшего vDNA следует выставить истинный размер ~ 40 bp.
  8. Количественно полос в каждом Лейн с изображений программного обеспечения7. Рассчитать долю ДНК в каждой полосе, CI, HSI или SC; vDNA не входит в этот расчет.
    Примечание: Эффективность интеграции, или часть SC, преобразованы в линейный продукт, был рассчитан путем деления пиксель объем согласованной интеграции продуктов (CI) по объему всего пиксель трех диапазонах (HSI + CI + SC). Если intasomes Флюорофор с надписью, HSI и CI продукты могут также предел по флуоресценции.
  9. Выберите фракции, которые имеют наиболее согласованной интеграции деятельности.
    Примечание: В нашем опыте, пик согласованной интеграции деятельности совпадает с пик белка, определены как tetrameric PFV intasomes. Измерить A280 каждого из этих фракций и вычислить окончательное intasome концентрации. Ε280 для Тетрамер дикого типа PFV в с двумя vDNAs, описанные здесь-908,339 см-1М-1 и молекулярная масса является 225.5 кДа. Концентрации должны следовать той же схеме, как пик Хроматограмма SEC и в assay переноса стренги.
  10. Распространять каждой фракции в 5 мкл аликвоты и защелкните замораживание в жидком азоте. Хранить аликвоты на-80 градусов. Фракции, отобранных для хранения, как правило, между 200-600 Нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

PFV intasomes собираются из рекомбинантных IN и vDNA. После сборки intasomes очищаются от SEC (рис. 1). Интеграция деятельности каждой фракции assayed с supercoiled цели и агарозы электрофорез геля дна (рис. 2). Этот гель образы с флуоресцентные сканера, набор для обнаружения бромистый этидий (и Флюорофор, если используется Флюорофор меченых vDNA). С помощью программного обеспечения для анализа изображений, группа пикселей тома м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Антиретровирусные модулей образуют multimeric комплекс с вирусной геномной ДНК для выполнения интеграции и продолжить вирусный жизненного цикла. Количество в мономеров в intasome может быть тетрамера, octamers или возможно выше порядок мультимеры11,12,,1314. PFV intasomes являются Тетрамер рекомбинантного с двуцепочечной ДНК олигомеров, которые имитируют вирусный геномной ДНК заканчивается

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана низ AI099854 и AI126742 к ключу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДНК-олигомерыIDTN/ACustom DNA Oligos
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
NaClP212121RP-S23020
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
Amicon Ultra 0,5 мл центробежные фильтрыSigma-AldrichZ677094-24EA3 кДа MWCO
DTTP212121SV-DTT
BIS-TRIS пропан, >=99,0% (титрование)Sigma-AldrichB6755-500G
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
MgSO4Amresco0662
GlycerinThermo Fisher ScientificG37-20
Гелеобразные наконечники, 1 - 200 μ LЛезвие бритвы CorningCLS4853-400EA
; Однолезвийные; 100/Пк.; Упаковка из 100Fisher Scientific12-640
с мембраной PES > 250 млThermo Fisher Scientific568-0020
Зажимы для диализных трубокSpectrum Labs132734
6-8 кДа 10 мм Диализная трубкаSpectrum Medical132645
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Медико-биологические науки17517201
Hi-Res Standard AgaroseAGTC BioproductsAG500D1
бромида этидияThermo Fisher ScientificBP1302
Orange GFisher Scientific0-267
Hyladder 10kb, 500 дорожекDenville ScientificCB4225-4
стерильных одноразовых фильтрующих установок

Ссылки

  1. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  2. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
  4. Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
  5. Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
  6. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409(2016).
  7. Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
  8. Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  9. Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
  12. Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
  13. Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
  14. Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
  15. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
  16. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сборка интасомыэксклюзионная хроматографияинтеграция вирусной ДНКрекомбинантная интегразазамена диализного буфераанализ хроматограммы ЭХанализ эффективности интеграцииэлектрофорез в агарозном гелестабильность при замораживании-оттаивании
Ассамблея и очистки прототип пенистый вирус Intasomes
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.