Method Article

ExCYT: Графический интерфейс пользователя для упорядочения анализ высокого мерных данных цитометрии

DOI:

10.3791/57473

⸱

January 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Bloomberg~Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Immunology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ExCYT, что на основе MATLAB графический пользовательский интерфейс (GUI), позволяет пользователям анализировать их потока данных цитометрии через часто используемые аналитические методы для высоких мерных данных, включая сокращение размерности через t СНЭ, целый ряд автоматизированных и ручных Кластеризация методы, карты и Роман высокой мерного потока участков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С появлением цитофлуориметрами потока, способный измерять все большее количество параметров ученые продолжают развивать больших панелей фенотипически исследовать характеристики их клеточных образцов. Однако эти технологические усовершенствования принести высокого мерного наборы данных, которые становятся все более трудно объективно проанализировать в рамках традиционных программ на основе руководства стробирования. Для того, чтобы лучше анализировать и представлять данные, ученые партнера с биоинформатики с опыт в анализе высокой мерных данных для разбора данных цитометрии их потока. Хотя эти методы показали весьма ценным в изучении проточной цитометрии, они еще должны быть включены в простой и легкий в использовании пакет для ученых, которые не имеют опыта программирования и вычислительная. Для удовлетворения этой потребности, мы разработали ExCYT, MATLAB-графический пользовательский интерфейс (GUI) что упрощает анализ данных цитометрии высокой мерного потока путем реализации обычно занятых аналитических методов для высоких мерных данных включая размерность сокращение t СНЭ, целый ряд автоматизированных и ручных методов кластеризации, карты и Роман высокой мерного потока участков. Кроме того ExCYT предоставляет традиционные стробирования варианты выбора населения интерес для дальнейшего t СНЭ и кластеризации, анализа, а также способность применять ворота непосредственно на t сне участков. Программное обеспечение предоставляет дополнительное преимущество работы с либо компенсацию или безвозмездное ФТС файлы. В том случае, если после получения компенсации не требуется, пользователь может выбрать предоставить программу каталога одного пятна и безупречный пример. Программа обнаруживает позитивные события во всех каналах и использует этот выбрать данные для более объективно расчета компенсации матрицы. В целом ExCYT обеспечивает всесторонний анализ конвейера потока данных цитометрии в виде файлов FCS и разрешить любой человек, независимо от вычислительных обучения, использования современных алгоритмических подходов в понимании их данных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения в проточной цитометрии, а также появлением массового цитометрии позволило врачей и ученых, чтобы быстро выявлять и фенотипически характеризуют биологически и клинически интересные образцы с новыми уровнями резолюции, создавая большие высокий мерных наборов данных, которые информации богатые1,2,3. В то время как обычные методы для анализа потока данных цитометрии например ручной стробирования были более простым для экспериментов, где есть несколько маркеров и эти маркеры имеют визуально заметной населения, этот подход не может генерировать воспроизводимые результаты при анализе выше мерных наборов данных или с маркерами, Окрашивание спектра. Например в исследовании, многоучрежденческого, где внутри клеточных окрашивание (ICS) анализы выполняются для оценки воспроизводимости quantitating реакции антиген специфические Т-клеток, несмотря на хорошие межлабораторные точности, анализ, особенно Строб, представил значительный источник изменчивости4. Кроме того процесс вручную стробирования населения интересов, помимо того, что весьма субъективный интенсивно очень много времени и труда. Однако проблема анализа высокой мерных наборов данных на основе надежной, эффективной и своевременной является не один из новых наук исследования. Ген выражение исследования часто создают чрезвычайно высокой мерных наборов данных (часто порядка сотен генов) где ручной формы анализа будут просто неосуществим. Для того, чтобы решать анализ этих наборов данных, было много работы в разработке bioinformatic инструменты для разбора данных выражение гена5. Этих алгоритмических подходов просто были недавно приняты в анализе данных цитометрии увеличилось количество параметров и оказались очень полезными при анализе этих высоких мерных наборов данных6,7.

Несмотря на создание и применение различных алгоритмов и программных пакетов, которые позволяют ученым применять эти высокий мерного bioinformatic подходы к их данным цитометрии потока эти аналитические методы по-прежнему во многом неиспользуемых. Хотя может существовать целый ряд факторов, которые ограничивают широкое внедрение этих подходов к цитометрии данных8, основным препятствием которых мы подозреваем в использование этих подходов ученых, является отсутствие вычислительные знания. В самом деле многие из этих пакетов программного обеспечения (т.е., flowCore, flowMeans и OpenCyto) записываются в языках программирования, например R по-прежнему требующих основной знания программирования. Пакеты программного обеспечения, таких как FlowJo нашли пользу среди ученых благодаря простоте использования и природа «plug-n-play», а также совместимость с операционной системой компьютера. Для того, чтобы обеспечить разнообразие принятых и ценных аналитических методов для незнакомых программирование ученого, мы разработали ExCYT, графический пользовательский интерфейс (GUI), который может быть легко установлен на PC/Mac, который тянет многие из новейших методов включая снижение размерности для интуитивно визуализации, разнообразные методы кластеризации, цитируется в литературе, наряду с новизну для изучения вывода этих кластеризации алгоритмы с карты и Роман высокой мерного потока/прямоугольные.

ExCYT — это графический пользовательский интерфейс, построенный в MATLAB и поэтому можно либо запустить в MATLAB непосредственно или установщик предоставляется, который может использоваться для установки программного обеспечения на любой PC/Mac. Программное обеспечение доступно на https://github.com/sidhomj/ExCYT. Мы представляем подробный протокол о том, как импортировать данные, предварительно обработать его, провести сокращение размерности t СНЭ, кластер данных, сортировка и фильтр кластеров на основе предпочтений пользователя и отображения информации о кластерах интерес через карты и Роман высокий мерного потока/прямоугольные ()Рисунок 1). Топоры в t сне участков являются произвольными и в произвольных единицах и как таковые не всегда показано на рисунках для простоты пользовательский интерфейс. Раскраска точек данных в «T СНЭ карты» — от синего до желтого, основанный на сигнал указанного маркера. В кластеризации решения, цвет точки данных на основе произвольных номер кластера. Все части рабочего процесса может осуществляться в одной панели GUI ()Рисунок 2 & таблицы 1). Наконец мы продемонстрируем использование ExCYT ранее опубликованных данных, изучение иммунного пейзаж ренальной карциномы клетки в литературе, также проанализированы с аналогичными методами. Образец набора данных, который мы использовали для создания фигур в этой рукописи вместе с протоколом ниже можно найти на https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, после регистрации учетной записи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. сбор и подготовка данных цитометрии

  1. Поместите все одного пятна в папке сами и метка, имя канала (по Флюорофор, не маркер).

2. данных импорт и предварительной обработки

  1. Чтобы приостановить или сохранить на протяжении всего этого анализа трубопровода, используйте кнопку Сохранить рабочую область в нижнем левом углу программы для сохранения рабочей области как '. МАТ ' файл, который впоследствии может быть загружен через кнопку Рабочей нагрузки . Не запускайте одновременно более одного экземпляра программы. Таким образом при загрузке новой рабочей области, убедитесь, что проверить, что нет никакой другой экземпляр ExCYT работает.
  2. Чтобы начать анализ трубопровода, сначала выберите тип цитометрии (поток цитометрии или массы цитометрии – CYTOF), под Параметры выбора файла выберите количество событий для выборки из файла (для этого примера используйте 2000). После успешного импорта данных диалоговое окно хлопнет вверх информирование пользователя о том, что данные успешно импортированы.
  3. Нажмите кнопку Auto-компенсации для проведения Факультативный auto компенсация шаг, как сделано Bagwell и Адамс9. Выберите каталог, содержащий одного пятна. Выберите безупречный образец в рамках диалога интерфейса пользователя.
    1. Место вперед/сторона точечной ворота на любой из образцов в этот каталог, который будет использоваться для выбора событий для расчета компенсации матрицы. Рекомендуется использовать безупречный образец для этой цели. На данный момент алгоритм реализован для последовательного пороги 99ой персентили неокрашенных образца, чтобы определить положительные события в каждом из одного пятна для расчета компенсации матрицы. Когда это закончится, появится диалоговое окно будет информировать пользователя о выполнения компенсации.
  4. Затем нажмите Ворота населения и выберите популяции клеток интереса, как Конвенция в потоке cytometry анализ. При выборе популяция клеток, введите количество процент вниз по течению анализ событий (в данном 10 000 событий).
  5. Далее, выберите число каналов использоваться для анализа в listbox в крайнем правом поле предварительной обработки (используйте специфические каналы, показано в примере).

3. t СНЭ анализ

  1. Нажмите на кнопку T СНЭ чтобы начать Пуск программа для вычисления набора данных снижение размерности для визуализации в окне ниже кнопку t сне. Чтобы сохранить изображение t СНЭ, нажмите Сохранить изображение TSNE. На машине с 8 CPU @ 3,4 ГГц и 8 GM оперативной памяти, этот шаг должен принять около 2 минут за 10 000 событий, 10 минут для 50000 событий и 20 минут для 100 000 событий.
  2. Для создания 't СНЭ heatmap', как видно в нескольких CYTOF публикации10,11, выберите вариант во всплывающем меню Маркер-специфических т НСЗ (Используйте конкретные маркеры CD64 или CD3, как показано в примере). Фигура будет всплывающее показаны heatmap представление t СНЭ заговор, который может быть сохранен для поколения рисунок.
  3. Выберите области интересов в t сне участков пользователем для дальнейшего течению анализа с использованием T СНЭ ворота кнопку.

4. кластерный анализ

  1. Чтобы начать, кластеризации, анализа, выберите вариант в Кластеризации метод listbox (в этом примере нас DBSCAN с коэффициентом расстояние 5 в диалоге поле справа от элемента управления listbox). Нажмите на кнопку кластера .
  2. Используйте один из следующих параметров для автоматической кластеризации алгоритмов в панели «Параметры автоматической кластеризации»:
    1. Жесткий KMEANS (на т СНЭ): применять k средства кластеризации данных снижение 2-мерной t СНЭ и требует количество кластеров, чтобы оказываться алгоритм12.
    2. Жесткий KMEANS (по данным HD): применять k средства кластеризации к исходным данным высоким мерного которое было дано на t СНЭ алгоритм. Еще раз количество кластеров должна быть предоставлена для алгоритма.
    3. DBSCAN: Применять метод кластеризации кластеризации, называется на основе плотности пространственных кластеризации приложений с шумом13 кластеров данных снижение 2-мерной t СНЭ и требует-мерного Расстояние фактор, который определяет общий размер кластеры. Этот тип алгоритм кластеризации хорошо подходит для кластера t СНЭ сокращения, как она способна кластер не чугун с шаровидным, которые часто присутствуют в сокращение t СНЭ представительства. Кроме того с тем, что она работает на 2-мерных данных, это один из алгоритмов, быстрее кластеризации.
    4. Иерархической кластеризации: Применяйте метод обычных иерархической кластеризации для высоких мерных данных, где вычисляется обратная матрица весь евклидового расстояния между всеми событиями до предоставления алгоритм Расстояние фактор, который задает размер кластера.
    5. Сетевой график- Основан: Применяйте метод кластеризации, который совсем недавно был введен в анализе данных цитометрии потока, когда есть редкие субпопуляций, которые пользователь хочет обнаружить11,14. Этот метод полагается на первый создание графа, который определяет связь между всеми событиями в данных. Этот шаг состоит из предоставления начальный параметр для создания графа, который является номером k ближайших соседей. Обычно этот параметр регулирует размер кластеров. На данный момент еще один диалог всплывает окно, задавая пользователю использовать один из 5 алгоритмов кластеризации, который применяется к графу. К ним относятся 3 варианта для максимальной модульности граф, метод Danon и спектральные кластеризации алгоритм14,,1516,17,18. Если один хочет обычно быстрее кластерного решения, мы рекомендуем спектральных кластеризации или быстро жадные максимальной модульности. В то время как методы максимизации модульность наряду с методом Danon определить оптимальное количество кластеров, спектральные кластеризация требует количество кластеров необходимо уделять программе.
    6. Самостоятельно организовал карта: Используют искусственные нейронные сети для кластера высокой мерных данных.
    7. ГИМ – максимизация ожидания: создать модель Гаусса смеси методом максимизации ожидания (EM) для кластера высокой мерных данных. 19 этот тип метода кластеризации также требует от пользователя ввода количество кластеров.
    8. Вариационные Байесовский вывод для GMM: создать модель Гаусса смесь, но в отличие от EM, он может автоматически определить количество смеси компонентов k.20 в то время как программа требует количество кластеров следует уделить (больше, чем Ожидаемое количество кластеров), алгоритм будет определить оптимальное число на свой собственный.
  3. Для изучения конкретной области участка t СНЭ, нажмите кнопку Выберите кластер вручную рисовать набор определяемых пользователем групп. Следует отметить кластеры не разделяют членов (т.е., которую каждое событие может принадлежать только 1 кластера).

5. блок фильтрации

  1. Набора(ов) кластеров выявленных либо вручную или через один из автоматических методов, описанных выше можно отфильтровать через следующим образом.
    1. Чтобы отсортировать кластеры (в панели Фильтр кластера ) по любой из маркеров, измеряется в эксперименте, выберите параметр из всплывающего меню Сортировка . Чтобы задать ли порядок по возрастанию или по убыванию, нажмите кнопку справа от всплывающего меню Сортировка По возрастанию/по убыванию . Это обновит список кластеров в listbox «Кластеры (фильтрации)» и повторно заказать их в порядке убывания средний кластера выражения этого маркера. Процент, отмечены в списке «Кластеры (фильтрации)» обозначает процент населения, что представляет собой этот кластер.
    2. Чтобы задать минимальное пороговое значение для данного кластера через определенный канал, выберите параметр во всплывающем меню порог (в этом примере нас маркер CD65 и установить порог 0,75). Либо введите значение в поле Числовой под диаграммой или использовать слайд бар установить порог. После того, как порог установлен, нажмите кнопку Добавить выше порога или Добавить ниже порогового значения для указания направления порога. После того, как этот порог, будут перечислены в поле пороговые значения рядом с панелью «Фильтр кластера», где маркер, порогового значения и направления будут перечислены так, что пользователь осознает какие пороговые значения применяются в настоящее время. Наконец t СНЭ сюжет будет обновлять путем размытия, кластеры, которые не отвечают требованиям фильтрации и listbox «Кластеры (фильтрации)» будет обновлять для отображения кластеров, которые отвечают требованиям фильтрации.
    3. Чтобы задать минимальный порог для частоты кластера, введите численного отсчета в Кластер порог частоты (%) окно в панели фильтр кластера (в этом примере использования 1%).

6. кластер, анализ и визуализация

  1. Чтобы выбрать кластеры для дальнейшего анализа и визуализации, в кластерах (фильтрации) listbox выберите кластеров и нажмите кнопку выбрать меню , чтобы переместить их в Кластер анализировать listbox.
  2. Для создания диаграммы кластеров, выберите кластеры интерес в listbox Анализировать кластера и нажмите кнопку HeatMap кластеров . Когда эта кнопка нажата, фигура будет всплывающее содержащая тепловую карту вместе с dendrograms на оси кластера и параметров. Дендрограмма на вертикальной оси будет группировать кластеры, которые тесно связаны во время дендрограмма на горизонтальной оси будут группы маркеров, которые совместно связаны. Чтобы сохранить heatmap, нажмите файл | Экспортировать установки | Экспорт.
  3. Для создания «Высокой размерной блочной» или «Высоких размеров потока участок», выберите кластеры интерес в списке Кластер анализа и нажмите кнопку Высокой размерной блочной или кнопку Высоких размеров потока участок . Эти участки могут использоваться для визуально оценить распределение каналов различных кластеров с учетом во всех измерениях.
  4. Чтобы показать кластеров в традиционной 2D потока участков, выберите преобразование (линейная, log10, arcsinh) и канал в Обычных потока участок панели и нажмите обычного потока участок.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того чтобы испытать удобство использования ExCYT, мы проанализировали куратор набор данных, публикуемых Chevrier et al. , под названием «иммунной Атлас из четких почечная карцинома» где группа провела анализ CyTOF с обширной иммунной группа на опухоль проб, взятых из 73 11больных. Два отдельных панелей, миелоидной и лимфоидных группа, были использованы для фенотипически характеризуют микроокружения опухоли. Целью нашего исследования было охарактеризова...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем ExCYT, Роман графический пользовательский интерфейс, работает на основе MATLAB алгоритмы для упрощения анализа данных высокой мерного цитометрии, позволяющие лицам без фона в программировании для реализации последней в высоких мерных данных алгоритмы анализа. Наличие этого программного обеспечения для более широкого научного сообщества позволит ученым для изучения их потока данных цитометрии в интуитивно понятный и простой рабочий процесс. Через проведение t СНЭ размерность сокращения, применяя мето...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют без подтверждений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Настольныйкомпьютер SuperMicroс пользовательской сборкой, используемый для запуска анализа
MATLABMathworksN/AПрограммное обеспечение, используемое для разработки ExCYT

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoist, C., Hacohen, N. Flow cytometry, amped up. Science. 332 (6030), 677-678 (2011).
  2. Ornatsky, O., et al. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of immunological methods. 361 (1), 1-20 (2010).
  3. Tanner, S. D., et al. Flow cytometer with mass spectrometer detection for massively multiplexed single-cell biomarker assay. Pure and Applied Chemistry. 80 (12), 2627-2641 (2008).
  4. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC immunology. 6 (1), 13(2005).
  5. Brazma, A., Vilo, J. Gene expression data analysis. FEBS letters. 480 (1), 17-24 (2000).
  6. Pyne, S., et al. Automated high-dimensional flow cytometric data analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (21), 8519-8524 (2009).
  7. Ge, Y., Sealfon, S. C. flowPeaks: a fast unsupervised clustering for flow cytometry data via K-means and density peak finding. Bioinformatics. 28 (15), 2052-2058 (2012).
  8. Venkatesh, V. Determinants of perceived ease of use: Integrating control, intrinsic motivation, and emotion into the technology acceptance model. Information systems research. 11 (4), 342-365 (2000).
  9. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677 (1), 167-184 (1993).
  10. Lavin, Y., et al. Innate immune landscape in early lung adenocarcinoma by paired single-cell analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
  11. Chevrier, S., et al. An immune atlas of clear cell renal cell carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
  12. Hartigan, J. A., Wong, M. A. Algorithm AS 136: A k-means clustering algorithm. Journal of the Royal Statistical Society. Series C (Applied Statistics). 28 (1), 100-108 (1979).
  13. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Density-based spatial clustering of applications with noise. International Conference Knowledge Discovery and Data Mining. 240, (1996).
  14. Levine, J. H., et al. Data-driven phenotypic dissection of AML reveals progenitor-like cells that correlate with prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  15. Blondel, V. D., Guillaume, J. L., Lambiotte, R., Lefebvre, E. Fast unfolding of communities in large networks. Journal of statistical mechanics: theory and experiment. 2008 (10), P10008(2008).
  16. Le Martelot, E., Hankin, C. Fast multi-scale detection of relevant communities in large-scale networks. The Computer Journal. 56 (9), 1136-1150 (2013).
  17. Newman, M. E. Fast algorithm for detecting community structure in networks. Physical review E. 69 (6), 066133(2004).
  18. Hespanha, J. P. An efficient matlab algorithm for graph partitioning. , University of California. 1-8 (2004).
  19. Moon, T. K. The expectation-maximization algorithm. IEEE Signal processing. 13 (6), 47-60 (1996).
  20. Bishop, C. M. Pattern recognition and machine learning. , Springer. (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Dimensional CytometryFlow Cytometry Analysist SNE Dimensionality ReductionAutomated Clustering MethodsHeatmap VisualizationGraphical User InterfaceCompensation Matrix CalculationConventional Flow PlotsHigh Dimensional Flow PlotsCluster Analysis Thresholding

Related Articles