Методическая статья

CARIP-Seq и чип Seq: методы для идентификации связанных Chromatin РНК и ДНК белковых взаимодействий в эмбриональных стволовых клеток

DOI:

10.3791/57481

⸱

25 мая 2018 г.

1Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine, 2Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем методы для выполнения чип-Seq и CARIP-Seq, включая подготовку библиотека для виртуализации нового поколения, для создания глобального epigenomic и связанные хроматина РНК карт в ES клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональных стволовых (ES) мобильный самообновления и дифференциация регулируется внешние сигналы и внутренней сети факторов транскрипции, эпигеномные регуляторов и после перевода модификаций гистонами влияют combinatorially гена Выражение состояния близлежащих генов. Также было показано, что РНК взаимодействовать с различными белками, чтобы регулировать динамику хроматина и экспрессии генов. Хроматин связанные РНК иммунопреципитации (CARIP) следуют секвенирование нового поколения (CARIP-Seq) — роман метод обследования РНК, связывается с белками хроматина, а иммунопреципитации chromatin, следуют (секвенирование нового поколения ChIP-Seq) является мощным геномики техника для сопоставления расположения столб-поступательные изменения гистонов, факторов транскрипции и эпигеномные модификаторов в глобальном масштабе в ES клеток. Здесь мы описываем методы для выполнения CARIP-Seq и чип-Seq, включая строительство библиотеки для виртуализации нового поколения, для создания глобальных хроматина связанные РНК и epigenomic карт в ES клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Решения судьбы клетки эмбриональных стволовых (ES), регулируются связь между внеклеточных сигналов и множество transcriptional регуляторы, включая модификаторы гистонов и после перевода изменения гистона хвосты. Эти взаимодействия облегчить доступность хроматина и упаковка хроматина в одном из двух состояний: euchromatin, которая является открытой и транскрипционно активных, и гетерохроматина, который является компактным и вообще транскрипционно неактивным. Факторы транскрипции с ДНК последовательности конкретные привязки сходство и эпигеномные модификаторы ассоциированных с эухроматиновых регионов участвовать в контроле экспрессии генов. Секвенирование нового поколения методов, в том числе чип-Seq1, сыграли важную роль в картирования генома общесистемной транскрипционный анализ сетей, которые являются основополагающими для ES клеток самообновления и плюрипотентности2,3,4 ,5,6. Кроме того во время immunopreciation РНК, следуют следующего поколения виртуализации (RIP-Seq)7 оценок РНК белковых взаимодействий предположить, что протеины дна binding взаимодействуют с РНК регулировать транскрипционный анализ событий7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, несколько исследований изучили генома всей локализации РНК, связанные с хроматином12, или глобальных взаимодействий между изменения РНК и гистонов. Один класс молекул РНК, которые были найдены регулировать активность хроматина связанных белков13,,1415длиной некодирующих РНК (lncRNAs). К примеру Xist является lncRNA, который регулирует, в женских mammalian клеток, инактивацию одной Х-хромосомы, путем набора эпигеномные подавляющего16,17. Однако полный спектр РНК, связанные с хроматином практически неизвестны. Здесь мы описываем Роман протокол, связанные хроматина РНК иммунопреципитации (CARIP) следуют секвенирование нового поколения (CARIP-Seq), чтобы идентифицировать связанные хроматина РНК в масштабах геном-ES клеток, включая подготовку библиотека для Секвенирование нового поколения и чип-Seq для сопоставления глобальные размещение изменения гистона, факторов транскрипции и эпигеномные модификаторы. В отличие от других методов RIP-Seq7CARIP-Seq включает сшивки и sonication меры, которые позволяют для прямого определения РНК, связанные с хроматином. Вместе чип-Seq является мощным инструментом для выявления генома общесистемной протеин дна взаимодействий, в то время как CARIP-Seq является мощный метод обследования РНК, связанные с компонентами хроматина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура мыши ES клеток в условиях свободной подачи.

Примечание: Клетки мыши ES условно культивировали в СМИ на клетки культуры блюдо покрытием с желатином и моно слой мыши эмбриональных фибробластов (MEF), которые были mitotically инактивированных (iMEFs). Однако MEFs должны быть удалены перед течению эпигеномные или выражение анализы для предотвращения загрязнения, связанных с MEF хроматина и РНК.

  1. Подготовка фидер слоя: желатин Пальто плиты культуры клеток 6-хорошо, добавив 2 мл 0,1% желатина в воде и инкубировать пластины при 37 ° C для 20-30 мин.
  2. Подготовьте DMEM 10% глюкозы высокого СМИ содержащие 2 мм L-глютамином, 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 x пенициллина/стрептомицина.
  3. Изолировать MEFs от E13.5 до E14.5 мышей18,19 или приобрести от коммерческих поставщиков. Mitotically инактивирует MEFs, рассматривая с митомицин C или гамма-облучения, используя стандартные протоколы19. Кроме того mitotically инактивированная MEFs (iMEFs) могут быть приобретены у коммерческих поставщиков.
  4. Культивирование MEFs. Предварительно теплой MEF СМИ при 37 ° C, оттепель замороженных флакона iMEFs и культура в 10% FBS MEF СМИ при 37 ° C с 5% CO2. Пластина MEFs на ~ 200 000 ячеек на хорошо 6-ну культуры блюдо.
  5. Культивирование клеток ES на слое фидер клеток (iMEFs).
    1. 12-24 ч после покрытия iMEFs, предварительно теплой 50 мл трубки ES клеток СМИ (DMEM высокой глюкоза, LIF (10 нг/мл), 15% ES клеток квалифицированные FBS, 1 × 2 клетки культура квалифицированных-меркаптоэтанол, 1 × глутамина, заменимые аминокислоты (NEAA), 1 × пенициллина/стрептомицина), при 37 ° C с 5% CO2.
    2. Аспирационная СМИ от плиты культуры клеток, содержащих iMEFs, вновь приостановить ES клеток в 2 мл СМИ (после оттаивания при 37 ° C) и плиты клетки в слое iMEFs. При размещении культуры блюдо в инкубаторе, важно переместить блюдо в форме «t» для равномерно распределить клетки и предотвращения агрегации, отношению к центру блюдо.
  6. Проход клетки ES на фидер бесплатно желатин покрытием блюда. Проход ES клеток, прежде чем они станут вырожденная. Колонии клеток ES поддерживать самообновлению лучше если колоний равномерно и не вырожденная. Наличие многих колоний клеток ES, которые соприкасаются указывает, что плотность ячеек слишком высока.
    1. Покройте 6-ну культуры блюдо с желатином, как описано выше. Инкубировать 0,25% трипсина ЭДТА при 37 ° C ~ 10-15 мин до предварительно теплой трипсина.
    2. Далее проход клетки ES первой стирки с 1 x-фосфатный буфер (PBS) и добавление 1 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА. Подождите 1-2 мин для колоний для отсоединения. Отделить колоний к приостановке одноклеточных, дозирование с 1 мл подсказка для ~ 5 раз.
    3. Использование микроскопа для подтверждения одноклеточного диссоциации клеток ES. Чтобы утолить реакции, или «нейтрализовать» трипсина, добавьте 10% FBS MEF СМИ. Центрифуга клетки на 300 x g при комнатной температуре 3-5 мин и аспирационная средств массовой информации.
    4. Вновь приостановить сотовой гранулы в 2 мл СМИ (ES клеток) дополнены гликогена синтазы киназы-3 (GSK3) ингибиторы (CHIR99021; GSK3i), или 2i условия (MEKi/GSK3i) (2-3 мкм GSK3i: CHIR99021, 1 мкм MEKi: PD0325901).
    5. Аспирационная желатин из клетки культуры блюдо и добавить 2 мл средства массовой информации, содержащие ЭСК в блюдо и поместите блюдо в инкубаторе 37 ° C (рис. 1A-D). Двойной ингибитирование GSK3i и MEKi способствует основное состояние наивно плюрипотентности ES клеток в отсутствие подачи клеток (iMEFs) и без сыворотки20. ES клеток должно быть пассированный два-три раза, чтобы удалить MEFs прежде чем сшивки.

2. сшивки ES клеток для чипа и CARIP

  1. Урожай клетки ES промывкой PBS, а затем добавить трипсин 0.25%, предварительно нагревают при 37 ° C. Инкубируйте клетки в течение нескольких минут при комнатной температуре. Избегайте над trypsinization ES клеток, которые приведут к клеточной гибели. Используйте микроскоп для оценки диссоциации одной ячейки.
  2. Утолить Пищеварение трипсина, как описано выше для пассированый ES клеток и центрифуги клетки на 300 x g при комнатной температуре 3-5 мин.
  3. Вновь приостановить клетки в СМИ MEF подогретым (37 ° C) (10% FBS/DMEM) на 2 × 106 клеток/мл.
  4. Чтобы crosslink клетки, добавить 37% раствор формальдегида в конечной концентрации 1% и инкубации клеток в коническую пробирку (15 мл или 50 мл) при 37 ° C за 8 минут перевернуть трубку несколько раз в период 8 мин для достижения однородной фиксации.
    Примечание: Время фиксации могут быть эпирически оптимизированы для CARIP. Если изменяется время фиксации, следует также скорректировать число циклов sonication. Кроме того 37 ° C температуры увеличивает эффективность сшивки, по сравнению с сшивки при комнатной температуре. Температура фиксации могут быть оптимизированы эмпирически.
  5. Чтобы остановить фиксацию реакции, добавить 1,25 М глицин (предварительно охлаждается при температуре 4 ° C) к концентрации 0,125 м. инвертировать трубку 8 об/мин, с использованием ротатор для 5 мин при комнатной температуре. Центрифугуйте образцы на 300 g x 5 мин при комнатной температуре и аспирационная средств массовой информации.
  6. Вымыть клетки лепешка с PBS предварительно охлажденные (4 ° C), Центрифугуйте образцы на 300 g x 5 мин при комнатной температуре и аспирационная PBS. Снова Вымойте клетки с PBS. Далее, аликвота 15 × 106 клеток на 15 мл.
  7. Замораживание клеток Пелле, поместив ее в жидком азоте за 1 мин., на сухой лед для 5 мин, или сразу же месте-80 ° C.
    Примечание: Фиксированная ES клеток гранулы могут храниться на срок до 6 месяцев без снижения качества в нижнем течении экспериментов.

3. chromatin sonication для чипа и CARIP

  1. Оттепель фиксированной Пелле клеток ES на льду. Вновь приостановите Пелле ячейки в буфер sonication (2,5 мл). Для факторов транскрипции или эпигенетическая регуляторы (белок факторы), вновь приостановите гранулы в 1 x TE, 1 мм PMSF, 1 x ингибитора протеиназы коктейль. Для изменения гистона, вновь приостановите гранулы в 1 x TE, 0.1% SDS, 1 мм PMSF, 1 x ингибитора протеиназы.
    Примечание: Хотя добавлением SDS повышает эффективность sonication, может оказаться полезным для оценки определенных составляющих хроматина или факторов транскрипции.
  2. Для иммунопреципитации chromatin (обломока), sonicate хроматина с 14-18 циклов (30 s на, отдых 30 s) на 40% амплитуды. Для связанных хроматина РНК иммунопреципитации (CARIP) уменьшить количество циклов sonication (8-10 циклов). Благодаря сотовых, фиксации и sonifier изменчивость условия для sonication должен решаться эмпирически.
  3. Дополнение sonication буфер с 28 мкл 10% SDS для белка факторы, 28 мкл Дезоксихолат натрия и 0,28 мл 10% Тритон-X100, и смесь хорошо.
    Примечание: Добавление этих компонентов в буфер sonication создает буфер RIPA.
  4. Центрифуга для выборки в 10 000 x g 10 мин при 4 ° C для предварительной очистки хроматина. Переместить супернатант свежие трубки и продолжите иммунопреципитации chromatin.
  5. Кроме того sonicated хроматина может храниться при температуре-80 ° C до использования. Однако хранения sonicated хроматина в-80 ° C может привести к снижению качества для обломока протеина фактор.

4. чип и CARIP процесс

  1. Добавьте 40 мкл белка A или G магнитные шарики в 1,5 мл, низкий привязка трубки. 600 мкл PBS мыть бисер. Поместите трубку на стойку, содержащие магнит, инкубировать трубки для 1 мин при комнатной температуре, удалить PBS и вновь приостановить магнитные шарики в 100 мкл PBS.
  2. Добавьте 2-4 мкг антитела к трубке с магнитной бусины. Инкубировать и поверните трубку при комнатной температуре за 40 мин при 8 об/мин, с использованием ротатор для облегчения антитела связывая к магнитной бусины. Вставьте трубу на магнитные стойки, инкубировать 1 мин при комнатной температуре, а затем удалите PBS.
  3. 200 мкл PBS мыть магнитные бусы. Стирка с PBS производится для удаления бесплатно IgGs. Инкубировать и поверните трубку при комнатной температуре за 5 мин между мыть шаги. Подсоедините трубку к магнит и удалить PBS.
  4. Immunoprecipitate хроматина прыгните белки путем инкубации sonicated хроматина экстракт (4 × 106 клеток на чип), с магнитной бусины и поворота образца при температуре 4 ° C (на ночь).
  5. Вымойте магнитные бусы. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре с следующие буферы и вращать образец для 10 мин с каждого буфера: дважды с 1 мл раствора Буфер RIPA (TE (10 мм Tric-HCl, ЭДТА 1 мм) рН 8,0, 1% тритон X-100, 0.1% натрия deocycholate, 0.1% SDS), дважды с 1 мл раствора c Буфер RIPA ontaining 0,3 М NaCl, дважды с 1 мл один раз в 1 мл TE LiCl буфера (0,5% натрия deocycholate, 0,5% NP40, 0.25 M LiCl), буфер с 0,2% Тритон X-100 и один раз с 1 мл раствора TE.
  6. Де сшивки для чипа. Вновь приостановите магнитные шарики в 100 мкл TE. Добавьте 3 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл). Инкубируйте образца при температуре 65 ° C (на ночь).
    Примечание: Важно покрыть трубы во время этого шага с парафина или полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения.
    1. Следующий день, Инвертируйте трубки несколько раз перемешать. Далее используйте магнит стойку для передачи супернатант свежие трубки. Мыть магнитные бусы, 100 мкл TE, содержащих 0,5 М NaCl и впоследствии объединить два supernatants.
  7. Де сшивки для CARIP. Вновь приостановите магнитные шарики в 100 мкл TE. Добавьте 3 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл). Инкубируйте образца при 65 ° C для 4-12 ч инкубации время при температуре 65 ° C необходимо эмпирически определить вследствие изменчивости между типы клеток, sonication и фиксации условий и т.д.
    1. Инвертировать трубку 3 - 5 раз смешивать, применить трубку к магнитной стойке, и впоследствии перейти супернатант свежие трубки.
    2. Мыть магнитные бусы, 100 мкл TE, содержащих 0,5 М NaCl и впоследствии объединить два supernatants.
      Примечание: Важно использовать бесплатно нуклеиназы реагенты (например., TE буфера, SDS, и т.д.) для предотвращения потери ДНК или РНК во время шага де сшивки.
  8. Извлечь ДНК/РНК с помощью 200 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта (PCI) (25:24:1, v/v).
    Примечание: РНК можно также извлечь коммерческие наборы, с помощью инструкции производителя. Shake для 30 s, спина на 10000 x g при комнатной температуре в течение 10 мин и переместить супернатант свежие трубки.
    1. Чтобы осадить ДНК/РНК, 2 мкл GlycoBlue, 20 мкл ацетат натрия 3 M и 600 мкл этанола. Микс по преобразованию ~ 5-8 раз и поместите образец на сухой лед или в-80 ° C для по крайней мере 1-2 ч.
    2. Центрифугуйте образцы на 10000 x г за 30 мин с помощью центрифуги Настольные холодильные (4 ° C). Воздух сухой гранулы для < 1 мин и вновь приостановить его в 40 мкл EB буфера (10 мм трис-HCl). Для приготовления чип-Seq библиотека перейдите к шагу 6.
  9. Удалите из хроматина связанные образцов РНК IP с помощью DNase ДНК. Добавьте 10 x DNase буфер 1 x концентрации в CARIP образце. Мкл DNase для 1 до 10 мкг РНК (50 мкл реакции). Инкубируйте образца при 37 ° C для 30 min. извлечение RNA образца с PCI. Ресуспензируйте в свободной от нуклеиназы H2O.

5. double-stranded синтез для CARIP-Seq cDNA

  1. Синтез cDNA перв стренги. Для реакции, реверс транскрипция, настройте следующие реакции в трубу, предназначенные для ПЦР машины: 10,5 мкл РНК и 1 мкл случайных праймеров hexamer (3 мкг/мкл).
  2. Инкубировать трубки при 65 ° C за 5 мин до денатурировать вторичную структуру и хранить его на льду на 2 мин Mix следующие компоненты: 4 мкл буфера перв стренги, 2 мкл 0,1 м DTT, 1 мкл dNTP и 0,5 РНКазы OUT. Далее для ПЦР-пробирку, мкл 7,5 Мастер смеси. Инкубировать трубки для 2 мин при 25 ° C. 1 мкл надстрочный II (200 U/мкл) и инкубировать следующим: 25 ° C в течение 10 мин, 42 ° C 50 мин, 70 ° C на 15 мин и провести на 4 ° C.
  3. Синтез cDNA стренги второй. Место труб на льду. Затем добавьте следующие компоненты в порядке: 91 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) лечение водой, 30 мкл 5 x второй стренги реакции буфера, 3 мкл dNTP смеси (10 мм), 1 мкл E. Coli ДНК лигаза (10 U/мкл), 4 мкл ДНК-полимеразы кишечной палочки (10У/мкл) и 1 мкл E. Coli РНКазы H (2U/мкл). Смешайте нежно vortexing и Инкубируйте на 16 ° C в течение 2 ч.
    Примечание: Смешивание, стряхивая или инвертирование трубка не может быть достаточно тщательно смешать реактивы.
  4. 2 мкл T4 ДНК-полимеразы и Инкубируйте на 16 ° C в течение 5 минут очистить cDNA (double-stranded, dscDNA) с помощью ПЦР очистка kit. Элюировать dscDNA в 40 мкл буфера EB.
  5. Фрагмент двойной мель cDNA. Сдвига cDNA (dscDNA) с помощью sonifier ванна воды и 1,5 мл размер 250-500 bp. Sonication dscDNA имеет решающее значение для уменьшения размеров фрагмента для облегчения последовательности всей стенограммы РНК.
  6. При использовании стандартной модели sonifier ванну водой, sonicate образец для 3 × 10 мин, или 4 × 10 мин.
    Примечание: Три цикла должны использоваться для до 1 мкг всего РНК, тогда как четыре циклы рекомендуются для 1-5 мкг всего РНК. Центрифуга трубки кратко после каждого цикла sonication и поддерживать ванну прохладной водой, добавляя свежий лед.
  7. При использовании sonifier Пико, рекомендуется использовать шесть циклов для 1-5 мкг всего РНК и следующих условий Велоспорт (30 s на, 90 s выкл). Центрифуга трубки кратко после 2-3 sonication циклов. Эффективность sonication можно определить путем загрузки часть стриженый dscDNA (3-4 мкл) на геле агарозы (2%). Важно, чтобы эмпирически тест sonication условий вследствие изменчивости между sonifiers.
  8. Выполните подготовку Библиотека, как описано в шаге 6 для виртуализации нового поколения.

6. чип Seq и CARIP-Seq библиотека строительство

  1. Ремонт заканчивается ДНК с помощью ДНК-конец-ремкомплект. Этот набор используется для создания туп законченному дна. Для этой реакции, созданы следующие 1,5 мл, низкая привязка трубки: 34 мкл ДНК, 5 мкл 2,5 мм dNPTs, 5 мкл 10 мм АТФ, 5 мкл 10 x ремонтно конец буфера (5 мм DTT, ацетат 100 мм магния, калия ацетат 660 мм Мм 300 трис ацетат, pH 7,8) и 1 мкл конец ремонт фермент смесь (T4 полинуклеотид киназы, T4 ДНК-полимеразы).
  2. Проинкубируйте образцы для 45 мин при комнатной температуре.
  3. Очищайте ДНК, используя комплект для очистки реакции. Элюировать отремонтированы конец ДНК в 32 мкл буфера EB подогретым (65 ° C). Хотя мы обычно не quantitate концентрации ДНК после чип, или РНК, после CARIP, до подготовки Библиотека, рекомендуется начать с по крайней мере 5-10 нг чип ДНК или РНК CARIP.
  4. Добавление навеса 3' «A», чтобы отремонтировать конце ДНК. Добавьте компоненты в 1,5 мл, низкий привязка трубки: 30 мкл ДНК сверху, 5 мкл 10 x НЭБ буфера 2, 1 мкл dATP от фондовой 10 мм, 11 мкл H2O и 3 мкл 5 U / мкл фрагменты фрагмент (3' - 5' Exo-) и осторожно перемешать, закупорить.
  5. Инкубировать образца на 30 минут при 37 ° C.
  6. Используйте комплект очистки реакции для того чтобы очистить ДНК. Элюировать ДНК в 25 мкл буфера EB подогретым (65 ° C).
  7. Перевязать адаптер. Добавьте следующие компоненты на льду: 23 мкл ДНК от выше, 3 мкл 10 x T4 ДНК лигаза буфера, 1 мкл отожженная PE или соединительный адаптер (4 мкм) и 3 мкл T4 ДНК лигаза (400 U/мкл), и смесь осторожно, закупорить.
    Примечание: Адаптер последовательностей могут также быть получены из коммерческих источников.
    Последовательности олигонуклеотида:
    PE адаптеры
    5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Мультиплексирование адаптеры
    5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
  8. Инкубируйте образца на 30 минут при комнатной температуре.
  9. Выполните выбор размера ДНК с помощью сборного геля агарозы (2%). Побегите гель на 10 мин.
  10. Акцизный региона соответствует 250-450 bp.
    Примечание: путем разрезания гель выше выше 200 bp, снизилась вероятность загрязнения от unligated адаптера димеры. Важно удалить любые unligated адаптеры перед PCR шаг.
  11. Используйте набор извлечения геля для очистки ДНК. Элюировать в 20 мкл буфера EB.
  12. PCR и библиотека очистки для перевязаны ДНК образцов содержащие парные конец (PE) Адаптеры. Добавьте компоненты в ПЦР-пробирку: 12 мкл 50% ДНК от выше, 12 мкл воды, 25 мкл главный микс (Phusion HF), 1 мкл праймера PE PCR 1.0 и 1 мкл праймера PE PCR 2.0.
    Примечание: Последовательности олигонуклеотида также могут быть получены из коммерческих источников.
    Последовательности олигонуклеотида:
    Праймера PCR PE 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Праймера PCR PE 2.0
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
  13. PCR и библиотека очистки для перевязаны образцы, содержащие индекс PE адаптеры. Добавьте компоненты: 12 мкл 50% ДНК от выше, 12 мкл воды, 1 мкл PCR праймер ИНПЕ 1.0 (разбавленных 1:2), 1 мкл PCR праймер ИНПЕ 2.0 (разбавленных 1:2) и 1 мкл PCR праймер индекс (разбавленных 1:2).
    Примечание: последовательности олигонуклеотида также могут быть получены из коммерческих источников.
    Последовательности олигонуклеотида:
    Мультиплексирование PCR праймер 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Мультиплексирование PCR праймер 2.0
    5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    PCR праймер индекс последовательности 1-12
    PCR праймер, индекс 1
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 2
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 3
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 4
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 5
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 6
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 7
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 8
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 9
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 10
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 11
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
    PCR праймер, индекс 12
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC
  14. Выполнять ПЦР Велоспорт с использованием следующих условий (денатурировать 30 s на 98 ° C, 18 циклов 10 s на 98 ° C, 30 s при 65° C, 30 s при 72 ° C, 5 мин при 72 ° C, удерживайте при температуре 4 ° C).
    Примечание: Число циклов PCR должна определяться эмпирически.
  15. Выбор размера продуктов ПЦР. Запустите ДНК на сборного E-гель EX (2%), или домашний 2% гель (агарозы) и акцизных регионе ВР 300-500.
  16. Используйте комплект извлечения гель для очистки дна от геля. Элюировать конечный продукт PCR в 20 мкл буфера EB.
  17. Используйте флуориметр для измерения концентрации библиотеки. Выполнение виртуализации нового поколения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы успешно допрашивали генома всей привязки H3K4me3, H3K4me2 и KDM5B в клетки ES, используя этот чип-Seq протокол6. Клетки ES были культивировали в условиях свободной подачи (рис. 1) и сшитого как описано выше. Sonication был впоследствии выполняется, как описано в шаге 3.2 чип-Seq протокола и оцениваются путем запуска ДНК на 2% агарозном геле (рис. 2). Далее чип была выполнена, как описано в шаге 4, и под...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чип-Seq является полезным методом для оценки местоположения глобального белка ДНК взаимодействий (например., транскрипция факторы/гистона модификации ДНК и ферменты/гистона изменения) в ES клеток, в то время как недавно разработанный протокол CARIP-Seq является полезным в допрос генома общесистемной Ассоциация РНК с избирателями хроматина. Чип-Seq является основным инструментом, который используется для оценки эпигеномные пейзажи клеток ES и других типов клеток. Качество CARIP-Seq библиотек и чип-Seq в значитель...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Уэйн государственного университета, Карманос институт рака, Грант от национального сердца, легких и крови института (1K22HL126842-01A1) присуждена B.L.K. Эта работа использовали Уэйн государственного университета высокой производительности вычислительной сетки для вычислительных ресурсов (< https://www.grid.wayne.edu/>). Мы благодарим Jiji Куруп за помощь с CARIP-Seq анализа данных.

АВТОРОВ ВЗНОСОВ:

B.L.K. задуман метода CARIP-Seq, разработаны и проведены эксперименты чип-Seq и CARIP-Seq, проанализировали данные последовательности и составлен рукопись. Все авторы прочитал и одобрила окончательный вариант этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фактор ингибирования лейкемии у мышей (ESGRO LIF)EMD Millipore106 или 107 units
GSK3β ингибитор CHIR99021 (GSK3i)Растворитель: ингибитор DMSO 10mM
MEK PD0325901 (MEKi)Растворитель: DMSO 10mM
модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), высокий уровень глюкозыИнвитроген11965092
PBS (фосфатно-солевой буфер)Инвитроген10010031
трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красныйGibco25200056
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Gibco15140122
2-меркаптоэтанол (50 мМ)Gibco31350010
раствор заменимых аминокислот MEM (100X)Gibco11140076
EmbryoMax ES Qualified Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, 500 млEMD MilliporeES-009-B
EmbryoMax 0,1% Раствор желатинаEMD MilliporeES-006-B
GlycineSigmaG7126-500G1,25 М конвентация в воде
Раствор формальдегидаSigmaF8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8,0 1XQuality Biological351-011-131
Фенилметансульфонилфторид (PMSF) растворSigma93482-250ML-F
cПолный коктейль ингибиторов протеазыRoche11697498001
раствор додецилсульфата натрия (20%)Quality BiologicalA611-0837-10
Q125 сонификаторQsonica4422
Раствор Triton X-100Sigma93443-100ML
Дезоксихолат натрияSigma30970
NaClSigmaS7653
Dynabeads Protein G для иммунопреципитацииInvitrogen10004D
Dynabeads Protein A для иммунопреципитацииInvitrogen10002D
Dynabeads Protein A/Protein G и Магнитный стартовый наборInvitrogen10015D
Литий хлоридSigmaL4408
IGEPAL CA-630SigmaI8896
RNeasy Mini KitQiagen74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (для очистки мРНК от общего количества РНК препс)Invitrogen61006
SuperScript Двухцепочечный синтез кДНК НаборInvitrogen11917010
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
End-it DNA End-Repair KitLucigenER81050
фрагмент Klenow (3'→ 5' экзо-)NEBM0212L
dATP (10 mM)Invitrogen18252015
T4 DNA ligaseNEBM0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA LadderInvitrogen10488085
E-gel EX агарозные гели, 2%InvitrogenG402002
Phusion высококачественная мастер-смесь 2X с HF буферомThermo Fisher
ChIPAb+ Триметил-гистон H3 (Lys4) - Валидированное антитело ChIPEMD Millipore17-614
Антитело против гистона H3 (di methyl K4) [Y47] - Класс ChIP (ab32356)Abcamab32356
Corning Costar Плоскодонные клеточные культуральные планшеты (6-луночные)Стандартные чашки
Falcon (10 см)Fisher08772E
Bioruptor picoDiagenodeB01010001
Qubit Flurometer 2.0Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Набор для анализаThermo FisherQ32851
MinElute Reaction Cleanup KitQiagen28204
MinElute Gel Extraction KitQiagen28604
Anti-Histon H4 (tri methyl K20) антитела - Класс CHIP (ab9053)Abcamab9053
Вращатель LabquakeThermo Fisher400110Q
Платформа Illumina HiSeqIllumina
TURBO DNaseInvitrogenAM2238
Stemgent StemgentF531LPM для культуры тканей Fisher 720083

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32(2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28(2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи