Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Доклинические оценки отпорности противораковые кумарина OT48 сфероидов, колонии формирования анализов и ксенотрасплантатов данио рерио

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57490

⸱

26 июня 2018 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Seoul National University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем доклинические скрининг противораковые кумарины, с использованием 3D культуры и данио рерио.

Аннотация

В пробирке и в естественных условиях доклинические скрининга новых терапевтических агентов являются важным инструментом обнаружения рака наркотиков. Хотя линий человеческих раковых клеток реагировать на терапевтические соединений в 2D (мерной) монослоя клеточных культур, чтобы понять эффективность препаратов в более физиологически соответствующих моделей были разработаны системы 3D культуры. В последние годы было отмечено парадигмы в доклинических исследованиях для проверки потенции новых молекул в 3D культуры системах, более точно имитирует микроокружения опухоли. Эти системы характеризуют состояние болезни более физиологически соответствующим образом и помочь получить более механистических постижения и понимания фармакологических потенции данной молекулы. Кроме того с текущей тенденцией в улучшении в естественных условиях модели рака, данио рерио стала важным позвоночных модель для оценки в естественных условиях образования опухоли и изучить влияние терапевтических агентов. Здесь, мы исследовали Терапевтическая эффективность hydroxycoumarin OT48 отдельно или в сочетании с BH3 mimetics в линии клеток рака легких A549 с помощью трех различных 3D культуры систем, включая колонии формирования анализов (CFA), сфероиде формирования пробирного (SFA) и в естественных условиях ксенотрасплантатов данио рерио.

Введение

Рак вызывается клеточных мутаций и как следствие биохимических сигнальные пути разрушаются, вызывая неконтролируемому делению клеток и устойчивость к смерти клетки. Опухоли мешают физиологических функций пищеварительной, нервной, сердечно-сосудистой систем и впоследствии соседних тканей1. Несмотря на обширные исследования усилия рак остается наиболее распространенных опасных для жизни заболеваний в мире2. Прецизионные медицины была признана как основа будущего рака терапии. Новых молекулярных структур регулярно тестируются в сочетании с существующих препаратов для улучшения клинических результатов.

Однако одним из значительных ограничений, связанных с развитием новой эффективной целевой терапии является неспособность часто используемых анализов для имитации итоги точные биологические воздействия наркотиков3. Обнаружение рака наркотиков по-прежнему главным образом опирается на тестирования эффективности терапевтических агентов в рак клеточных линий культивировали в 2D монослоя культур, которые трудно проверить в клинических испытаниях4. Таким образом существует растущий интерес для разработки лучше модели рака, которые лучше имитировать родной особенностей опухоли в vivo5. В последние годы растущий интерес к модели 3D культуры привело к разработке усовершенствованных методик производить 3D опухоли модели5.

Здесь мы представляем подход с тремя культуры различных 3D клеточные технологии, позволяющие улучшить понимание потенции hydroxycoumarin OT486 в сочетании с mimetics BH3 раньше больше в глубину в vivo анализов. Наш метод состоит из сочетания колонии и ОТВС с в vivo опухоли формирования тест, основанный на zebrafish модель для дальнейшей проверки эффективности комбинации OT48 и BH3 mimetics в клетках рака легких и мониторинга прогрессии рака в живых организм.

Колонии формирования анализов обычно используются для оценки эффективности противоопухолевых агентов, как твердых, так и кроветворная рака. Assay определяет способность клетки размножаться бесконечно и формируют колонии7. Эффект противоопухолевых агентов на колонии, формирование способности клеток определяется снижение числа и/или размер колоний.

Сфероидов представляют в vitro модели опухоли и служить в качестве платформы лоу кост скрининга для противоопухолевых агентов. Сфероидов агрегаты клеток, растущих в суспензии или встроенные в матрице 3D. Такой подход широко используется для скрининга наркотиков и исследований опухолевого роста, распространение и иммунной взаимодействия8.

Чтобы полностью понять свойства нового препарата, важно проводить эксперименты в естественных условиях на грызунов. Однако этот обычных метод является дорогостоящим и трудоемким. В последние годы данио рерио (Danio рерио) стала широко изучены Лаборатория организма, что дешевле и быстрее, чтобы поднять. Опухоли разработан в подходе культура клеток представляют 3D данио рерио, но в рамках сотрудничества в vivo позвоночных9.

В общей сложности мы используем здесь три различных 3D культуры подходов, включая лигнин, ОТВС и данио рерио в естественных условиях образования опухоли продемонстрировать противоопухолевой потенциал hydroxycoumarin OT48 в легких Рак A549 клеток модели в сочетании с BH3 mimetics.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. колонии формирования анализов

  1. Культура клетки A549 в концентрации 20 000 клеток/см2 в 15 мл RPMI1640 клетки питательной среды с 10% FBS (плода бычьим сывороточным) и 1% антибиотиков в колбе2 75 см в инкубатор CO2 при 37 ° C и 5% CO2.
  2. В день эксперимента определения концентрации клеток с помощью Горяева. Собрать 50000 клетки центрифугированием при 400 x g 7 мин в пробки microcentrifuge 1,5 мл и вновь приостановить клетки в 100 мкл стерильные ПБС (фосфат буфер солевой) в 1,5 мл пробирок.
  3. Отказаться от 1,1 мл полутвердых на основе метилцеллюлоза среды (MCBM) в 15 мл пробирок с multipipette. Подготовка одной трубки для каждого условия.
  4. 110 мкл FBS, до 1,1 мл MCBM, с помощью микропипеткой P200.
  5. Семена клетки на 1000 клеток/мл. Собирать 2.4 мкл суспензии клеток от Стоковый раствор (50 000 ячеек в 100 мкл ПБС) с использованием микропипеткой P2 и добавить в 1,1 мл MCBM, дополненный 10% FBS.
  6. После добавления клетки, вихревой трубы за 1 мин, держа их вертикально на высокой скорости, чтобы перемешать MCBM и клетки.
  7. Добавьте тест соединений (OT48 самостоятельно или в комбинации с A1210477). Подготовить отдельную трубу как элемент управления для использованного растворителя (здесь диметилсульфоксида (ДМСО)). В зависимости от концентрации соединений и объем, добавлены для каждого условия растворителей управления будет включать в себя самую высокую концентрацию растворителя используется для разбавления тест соединения, для оценки неблагоприятных последствий, вызванных растворителя.
  8. Вихревой трубы на 1 минуту.
  9. Для калибровочных добавьте 1 мл смеси с P1000 микропипеткой центр хорошо плиты культуры 12-ну клеток.
  10. Заполните пустой скважин с 1 мл стерильной воды или 1 x PBS для стабилизации влажности.
  11. Инкубируйте культуры пластин на 10 дней в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
  12. После 10 дней инкубации добавьте 200 мкл раствора MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium бромид) штока (5 мг/мл) в каждой скважине до конечной концентрации 1 мг/мл.
  13. Инкубируйте 10 мин в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2. Жизнеспособных колоний превратит фиолетовый.
  14. Захват изображения с цифровой камеры с использованием белом фоне пластины (LAS белый dia лоток). Используйте следующие параметры: метод, оцифровки; Выдержка тип, точность; Время экспозиции, руководство, 1 секунда; Чувствительность/резолюции, высоким разрешением. Сохраните изображение в формате tiff.
  15. Количественно жизнеспособных колоний с помощью ImageJ программного обеспечения. Выберите меню «изображение | Тип | 8 bit». Выберите меню «настройки | Порог». Установить порог для контроля и поддержания постоянной для всех условий; Выберите меню «Анализ | Анализ частиц». Сохранить данные и анализировать с помощью статистики программного обеспечения для графического представления.

2. сфероида формирования Assay

  1. Культура клетки A549 в концентрации 20 000 клеток/см2 в 75 см2 фляги с 15 мл среды RPMI 1640 с 10% FBS и 1% антибиотиков.
  2. В день эксперимента, подготовить 96 хорошо U-днище.
  3. Пластина 10 000 ячеек в колодец, который уже содержит соединение интереса (здесь 50 мкм OT48) или 20 мкм A1210477. Окончательного громкость до 100 мкл клеток питательной среды. Количество ячеек, которые образуют единый сфероидов с нетронутыми внешняя граница считается достаточным для формы сфероидов.
  4. Инкубируйте 3 дней в инкубаторе при 37 ° C и на 5% CO2.
  5. После 3 дней инкубации захвата изображения с использованием световой микроскоп с увеличением 4 x сфероидов.

3. данио рерио ксенотрансплантата Assay

Примечание: Этот технический подход визуализируется как схема (рис. 1).

  1. Подготовка запасов реагентов
    1. Подготовка 1 Л 30 x Danieau в решение: 1740 мм NaCl, 21 мм KCl, 12 мм MgSO4∙7H2O, 18 мм Ca (№3)2и 150 мм HEPES. Приспособиться к pH буфера с помощью рН метр 7.6.
    2. Приготовляют раствор 1% (50 x) tricaine: растворяют 20 мг этиловый метансульфонат 3-аминобензоат (tricaine) в 2 мл дистиллированной воды.
    3. Подготовка 1% раствор фенола Красного PBS: добавить 2 мкл соли раствора фенола Красного натрия до 198 мкл стерилизованные PBS раствора в трубу 1,5 мкл.
    4. Подготовка 3% метилцеллюлоза: добавить 3 g метилцеллюлоза до 100 мл 1 x Danieau в раствор.
  2. Данио рерио производство яиц и инкубации
    1. Отдельные одна женщина и один мужчина данио рерио в раздел танк заполнены с УФ стерилизации и фильтрованной водопроводной водой в 28,5 ° C в темноте. После 24 ч разделения смесь рыбы обоих полов начать спаривания. Передавать оплодотворенные яйца от спаривания танк чашку Петри, содержащий 5 мл свежего Danieau раствора.
    2. Мыть яйца три раза с 5 мл раствора в Danieau. Для стирки, тщательно аспирационная яйца с пипеткой и передачи в 5 мл свежего раствора. Инкубируйте 8 h на 28,5 ° C.
      1. После 8 ч инкубации в Danieau и решение измените Danieau в раствор, содержащий 0,03% 1-фенил-2-тиомочевины (PTU) для подавления пигментации. Сортировать непрозрачный яйца (неоплодотворенные или содержащих неразвитой эмбрионов) для предотвращения загрязнения.
  3. Dechorionation эмбрионов
    1. 24 h пост оплодотворение (hpf), dechorionate zebrafish эмбриона, используя острые щипцы. Инкубировать штриховкой эмбрионов в Danieau в растворе с 0,03% ПТУ на 28,5 ° C до 48 hpf.
  4. Подготовка комплекса лечение клетки
    1. Семя A549 клеток на 20 000 клеток/см2 в 25 см2 культуры колбы. После 24 часов посева, добавить соединений (здесь OT48 на 50 мкм и или A1210477 на 20 мкм) для 24 h в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2. Настроить время лечения для каждого соединения для поддержания жизнеспособности клеток, но совершить их к смерти клетки. На этот раз точка должен быть индивидуально настроить основанные на жизнеспособность клеток, морфология и молекулярных маркеров.
    2. 2 ч до конца лечения, пятно клетки с 4 мкм люминесцентные клеток трекер красителя CM-Дил при 37 ° C и 5% CO2. После 2 ч инкубации trypsinize клетки с 0,05% трипсина ЭДТА и развести 106 клеток в 50 мкл раствора фенола Красного PBS до инъекции.
  5. Микро инъекции клеток рака для формирования ксенотрансплантата
    1. Анестезировать данио рерио в 0,02% раствора tricaine за 5 мин до тех пор, пока они располагаются на плите агар.
    2. Тянуть 1,0 мм (вне диаметра (OD) стеклянный капилляр) съемник микропипеткой (настройки программы: P: 300, жара: 260, тянуть: 60, VEL: 50 и время: 200). Вырежьте микрокапиллярной с помощью шприца для образоваться острые края. Загрузить microcapillaries с 20 мкл клеток/фенола Красного-PBS решения. Установить давление впрыска и время отказаться от 2 nL на инъекцию.
    3. Придать желточного мешка 100 – 200 клеток путем инъекций 6-10 nL через 3-5 инъекций. После инъекции позволяют рыбы для восстановления для 10-30 мин в 5 мл свежего Danieau раствора, содержащего решение ПТУ. Диспетчеризации рыбы в 24-ну пластины с 1 мл раствора Danieau в раствор, содержащий ПТУ решения являются и инкубировать в течение 72 часов при 28,5 ° C.
    4. После 72 ч инкубации анестезировать рыбы в tricaine раствор 0,02% и иммобилизации на слайде стекла с капелькой метилцеллюлоза 3%. Возьмите фотографии 5 x по микроскопии флуоресцирования на длине волны 620 до 750 Нм.
    5. Определить размер флуоресцентные опухоли ImageJ программного обеспечения. Выберите меню «Анализ | Мера». Сохраните значения, соответствующие флуоресцентного сигнала и анализировать с помощью статистики программного обеспечения для графического представления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 2рака легкого ячейки линия, которую A549 был посеян в MCBM форме колоний после лечения с OT48 отдельно или в сочетании с BH3 подражательный A1210477 в указанных концентрациях. Результаты показали, что сочетание значительно сократить число, размер и площадь поверхности колоний после 10 дней инкубации.

На рисунке 3A549 клетки лечили OT48 самостоятельно или в сочет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Темпы формирования колонии, полученные с MCBM, зависит от типа ячейки. Обычно для non сторонник клеток, количество колоний гораздо выше по сравнению с адэрентных клеток. Мы наблюдали, что клетки A549 образуется 30-40 колоний после 10 дней. Ранее мы сообщили для различных лейкозных клеток, что количество колоний составляет от 200 до 2509. Наши результаты показали, что OT48 только не производят значительное уменьшение количества колоний только. Однако в сочетании с BH3 подражательный A1210477 колони...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Исследования в СНС поддерживается национальной исследовательский фонд (СРН) MEST Корея опухоли микроокружения глобальной основной исследовательский центр (GCRC) Грант, [номер гранта 2011-0030001]; Национальный исследовательский грант университет Сеула и мозг Кореи (BK21) плюс программы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материалы, необходимые для анализов на образование колоний
A549ATCCCCL-18537 C°
RPMI 1640Lonza300964 C°
FBSBiowestS1520-500-20C°
Пенициллин-стрептомицинLonza17-602E-20C°
Колба для клеточных культур T75SPL70075RT
PBS растворHycloneSH30256.02RT
1,5 млтуба ExtrageneTube-170-CRT
15 мл тубаHyundai MicroH20015RT
12 лунок планшетSPL30012RT
MethoCultStemCell technologies4230-20C°
Тиазолил синий бромид тетразолия (порошок МТТ)SigmaM56224 C°
LAS4000GE Healthcare TechnologiesRT
strong>Необходимые материалы для анализа образования сфероидов
A549ATCCCCL-18537 C°
RPMI 1640Lonza300964 C°
FBSBiowestS1520-500-20C°
Пенициллин-стрептомицинLonza17-602E-20C°
Колба для клеточных культур T75SPL70075RT
PBS растворHycloneSH30256.02
RT Trypsin-EDTAGibco25-300-0544 C°
Corning costar ultralow attachemnt 96 луночный планшетCorning3474RT
МикроскопияNikonEclipse TS100RT
strong>Материалы, необходимые для ксенотрансплантатов данио
A549ATCCCCL-18537 C°
RPMI 1640Lonza300964 C°
FBSBiowestS1520-500-20C°
Пенициллин-стрептомицинLonza17-602E-20C°
Колба для клеточных культур T25SPL70025RT
Колба для клеточных культур T75SPL70075RT
Колба для клеточных культур T175SPL71175RT
1,5 млтуба ExtrageneTube-170-CRT
24-луночная пластинаSPL30024RT
PetridishSPL10100RT
PBS растворHycloneSH30256.02RT
Trypsin-EDTAGibco25-300-0544 C°
Хлорид натрияSigma-Aldrich71382RT
Хлорид калия (KCL)Sigma-AldrichP9541
RT Гептагидрат сульфата магния (MgSO4.7H2O)Sigma-AldrichM2773RT
Тетрагидрат нитрата кальция (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396RT
HEPES растворSigma-AldrichH0887RT
Этил3-аминобензоат метасульфонат (трикаин)Sigma-AldrichE10521RT
Фенол Красный растворSigma-AldrichP0290
RT МетилцеллюлозаSigma-AldrichM0512RT
1-фенил-2-тиомочевина (PTU)Sigma-AldrichP7629RT
CM-Dil красительInvitrogenC7001-20C°
Стеклянный капиллярWorld Precision InstrumentsTW 100F-4RT
Съемник микропипетокИнструмент для затвора, СШАP-97RT
МикроинъекторWorld Precision InstrumentsPV820RT
ШприцKOVAX1млRT
МикрозагрузчикEppendorf5242956003RT
Стеклянное стеклоMarienfeldHSU-1000612RT
Флуоресцентная микроскопияLeicaDE/DM 5000BRT
<<

Ссылки

  1. Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
  2. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  3. Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
  4. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).
  5. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
  6. Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
  7. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  8. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
  9. Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
  10. Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
  11. Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
  12. Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).
  13. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
  14. Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

A549BH33DImageJ
Доклинические оценки отпорности противораковые кумарина OT48 сфероидов, колонии формирования анализов и ксенотрасплантатов данио рерио
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.