Методическая статья

Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

DOI:

10.3791/57491

⸱

17 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biology at Irkutsk State University, 2Institute of Biology at Karelian Research Centre of Russian Academy of Sciences, 3Baikal Research Centre, 4Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology, and Research (A*STAR), 5University of Oulu, Optoelectronics and Measurement Techniques Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья демонстрирует принципы быстро, миниинвазивная инъекции флуоресцентные микрочастиц в circulatory system рыбки и визуализации в vivo микрочастиц в крови рыб.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Системного администрирования микро размера частиц в живой организм может применяться для визуализации сосудистую, наркотиков и вакцинации, имплантации крошечные оптических датчиков и трансгенных клеток. Однако внутривенного введения микроинъекций в мелких животных, которые в основном используются в биологических и ветеринарных лабораторий, очень сложны и требуют квалифицированного персонала. Здесь мы демонстрируем надежный и эффективный метод для введения микрочастиц в кровеносную систему взрослых рыбок данио (Danio рерио) путем инъекций в рыбы почек. Чтобы визуализировать введено микрочастиц в сосудистую, мы предлагаем простой метод прижизненной визуализации в жабры рыбы. В естественных условиях мониторинг pH крови данио рерио была выполнена с использованием вводят Микрокапсулированный флуоресцентный зонд, SNARF-1, чтобы продемонстрировать один из возможных применений описанные методики. Эта статья содержит подробное описание инкапсуляции рН чувствительных красителя и демонстрирует принципы быстрой инъекции и визуализации полученных микрокапсулы для записи в vivo флуоресцентного сигнала. Предложенный метод впрыска характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования. Все описанные процедуры можно выполнять на других мелких рыб, таких как гуппи и оризии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Администрация микро размера частиц в организм животных является одной из важных задач в таких областях, как наркотиков и доставки вакцины1, сосудистую визуализации2, трансгенными ячейку имплантации3и имплантации крошечные оптический датчик 4 , 5. Однако, трудно процедура имплантации микромасштабной частиц в сосудистой системе мелких лабораторных животных, особенно для деликатной водных организмов. Для популярных исследований образцов как данио рерио, он сообщил, что эти процедуры необходимо уточнить с помощью видео протоколов.

Внутрисердечной и капиллярной микроинъекций требуют квалифицированного персонала и уникальных микрохирургии зал для доставки microobjects в zebrafish кровь. Ранее ретро орбиталь ручной инъекций3 было предложено как простой и эффективный метод для управления всей клетки. Однако по нашему опыту, из-за небольшой площади глаз капиллярной сети, это занимает много практики для достижения желаемых результатов от этого метода.

Здесь мы описываем метод для надежной и эффективной микрочастица имплантации в кровеносную систему путем ручной инъекции непосредственно в ткани почек взрослых рыбок данио, который богат капилляров и почечных сосудов. Эта техника основана на протоколе видео для трансплантации клеток в zebrafish почек6, но болезненным и длительным микрохирургическое шаги были ликвидированы. Предложенный метод характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования.

Важной частью предлагаемого протокола является визуализация имплантированных микрочастиц (если они флуоресцентные или раскрашенная) в капиллярах Гилл, который позволяет для проверки качества инъекции, грубый относительной оценки числа вводят частицы и обнаружение спектрального сигнала для физиологических измерений непосредственно из циркулирующей крови. В качестве примера возможных применений описаны методики, мы демонстрируем протокол для измерений в vivo данио рерио рН крови с помощью Микрокапсулированный флуоресцентного зонда, SNARF-1, первоначально предложенных в Borvinskaya и др. 20175.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с директивой ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных и были одобрены животное темам исследований Комитета из Института биологии Иркутского государственного университета.

1. Изготовление микрокапсулы

Примечание: Микрокапсулы, ношение флуоресцентные краски готовятся с использованием слой за слоем Ассамблеи противоположно заряженных полиэлектролитов7,8. Все процедуры были выполнены при комнатной температуре.

  1. Для синтеза пористых СаСО3 microcores, включающего Люминесцентную краску, смешайте 2 мл раствора SNARF-1-декстрана (большинство полимер прыгните Люминесцентную краску например FITC-BSA могут использоваться) в концентрации ~ 2 мг/мл с 0,6 мл каждого из решений CaCl2 1 моль/Л и Na2CO3 под быстро помешивая.
    Примечание: Обратить внимание на различные чувства флуоресцентных красителей в Фотообесцвечивание; Если используется светочувствительные флуоресцентного зонда (как SNARF-1), манипулирования и хранения микрочастиц должны выполняться с как мало света как можно скорее.
  2. После 5-10 s агитации, передать подвеска 2 мл microcentrifuge трубы и центрифуги для 15 s на 10000-12000 g для пеллет СаСО3 microcores.
  3. Отменить супернатанта, мыть ядер с ~ 2 мл деионизированной воды и Ресуспензируйте гранулы путем встряхивания.
  4. Повторите процедуру центрифугирования промывание три раза в общей сложности. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
  5. Инкубируйте microcores за 1 мин в ультразвуковой ванне для уменьшения их агрегирования.
    Предупреждение: Не забудьте защитить уши с наушниками.
  6. Внести первый полимерный слой на шаблоны, Ресуспензируйте ядер в ~ 2 мл 4 мг/мл раствора poly(allylamine hydrochloride) (ПАУ) в 1 моль/Л NaCl.
    1. Держите microcores в растворе для ~ 5 мин при постоянном встряхивании.
    2. После 15 s центрифугирования, удалить супернатант с несвязанных ПАУ. Вымойте покрыты microcores с дейонизированной водой по крайней мере 3 раза через несколько центрифугирования и мытье шаги. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
    3. Инкубируйте microcores за 1 мин в ультразвуковой ванне для уменьшения их агрегирования.
      Примечание: Если прикладной флуоресцентного красителя катионного, начните с поли (натрия 4-styrenesulfonate) (PSS) в 1 моль/Л NaCl (см. шаг 1.7).
  7. Повторите шаг 1.6 с ~ 2 мл 4 мг/мл раствора PSS (также содержащие 1 моль/Л NaCl) для депозита второй полимерный слой на шаблоны.
  8. Повторите шаги 1.6 и 1.7 шесть раз депозита 12 полимерные слои.
    Примечание: Не рекомендуется сделать длинный перерыв (~ 12 ч или больше) в процедуре до ~ 3-5 слоев сдали потому что СаСО3 microcores без покрытия могут, как правило, recrystallize. Обратите внимание, что PSS покрытие вызывает выше агрегации microcores, и долгой паузы рекомендуется только тогда, когда ПАУ или поли L-лизин привитый с полиэтиленгликоля (PLL-g-PEG) является исключительно слой.
  9. Проинкубируйте покрыты microcores в 2 мг/мл PLL-g ПЭГ (~ 1 мл микропробирок) для по крайней мере 2 ч.
    1. Мыть microcores с водой через последовательные центрифугирования и ресуспендирования шаги. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
  10. Чтобы получить полые микрокапсулы, Растворите СаСО3 шаблоны, добавив 2 мл раствора 0,1 моль/Л Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (с учетом рН 7,1 с NaOH) покрыты microcores.
    1. После ~ 5 минут инкубации, центрифуга микрокапсулы для 45 s и удалить супернатант с ЭДТА.
    2. Повторите шаги 1.10-1.10.1 дважды.
  11. Вымойте микрокапсулы с 0,9% NaCl три раза через несколько центрифугирования шаги в пределах 45 s следуют мытья шаги. После последнего шага центрифугирования удалить супернатант.
    Примечание: Окончательный микрокапсульная раствор для инъекций должны храниться стерильные (например, путем добавления ампициллин, 0,1 мг/мл), и средства массовой информации должны быть биологически совместимого с целью расследования (изотонические СМИ с нейтральным pH).
  12. Оценки концентрации подготовленных микрокапсулы в Горяева под флуоресцентным микроскопом. Сделать серию фотографий микрокапсулы, измерить диаметр о ста микрокапсулы, используя ImageJ9 или эквивалент программного обеспечения и исследовать распределение по размерам, с помощью гистограммы.
  13. Хранилища, полученные инкапсулированные зонд в темноте.
    Примечание: после нескольких стирок в стерильного 0,9% NaCl, микрокапсулы могут храниться месяцами при 4 ° C. Полного высыхания микрокапсулы во время хранения не рекомендуется.

2. Подготовка оптические установки и калибровки Микрокапсулированный SNARF-1

Примечание: Грубая рН измерения с микрокапсулами SNARF-1 могут быть сделаны с использованием изображений в двух каналах флуоресцентный Микроскоп7, но в настоящем Протоколе, один одноканальной флуоресцентный Микроскоп связаны волоконно-спектрометр был применен.

  1. Установите необходимый набор фильтров флуоресценции флуоресцентный Микроскоп согласно характеристикам применяемых Люминесцентную краску и включите люминесцентных ламп.
    1. Вытяните рычаг окуляры.
      Предупреждение: Избыток света может повредить спектрометр матрицы. Таким образом убедитесь, что рычаг находится в режиме «окуляр», когда не используется спектрометр.
    2. Подключите один конец волоконно-оптических спектрометр и другой конец к коллиматора. С помощью адаптеров, место коллиматор в фокус камеры трубки или другой доступный порт флуоресцентный Микроскоп.
    3. Включите спектрометр. Запустите программу управления спектрометр и подготовить спектрометр для измерений.
  2. Для калибровки микрокапсульная партии место ~ 5 мкл микрокапсульная подвески (~ 10 000 микрокапсулы за мкл в деионизированной воде) на слайде микроскопа и сухой капли в темном месте (например, в термостат при температуре 35 ° C).
    1. Для калибровки спектральные характеристики Микрокапсулированный SNARF-1, используйте серию буферов с различными pH в диапазоне ~ 6-9. Падение ~ 10 мкл буфера на сушеные микрокапсулы с SNARF-1-декстран и покрывают его с coverslip.
    2. Место стеклянное скольжение на микроскопа. Найдите микрокапсулы, используя × 40 цель.
    3. Поверните рычаг Микроскоп к порту камеры. Зарегистрируйте их флуоресценции с помощью спектрометра. Поверните рычаг обратно в окуляры.
      Примечание: Убедитесь, что спектральная сигнал выходит далеко за рамки фонового уровня и убедитесь что микрокапсулы в поле зрения не в пузырь (путем переключения на нижней увеличение при необходимости). Избегайте длительного освещения же микрокапсулы. SNARF-1 чувствителен к Фотообесцвечивание.
    4. Повторите шаг 2.2.3 для различных микрокапсулы 10 - 15 раз.
  3. Рассчитать коэффициенты пика флуоресценции (например, с помощью R или Scilab) для всех зарегистрированных спектров и определить линии регрессии между средний коэффициент (для каждого буфера) и Средний рН, по следующей формуле:
    figure-protocol-1
    Примечание: SNARF-1 имеет спектр с двумя пиками, соответствующих выбросов протонированных и депротонированная красителя, и соотношение между пиками реагировать рН среды. В этом исследовании используется соотношение между интенсивностью флуоресценции для 605 и 660 нм. Эти длины волн выбираются в зависимости от используемых набор фильтров. и b являются коэффициенты определяются нелинейной регрессии (например, с помощью R). Значения, 0,15 и 1.1 являются, соответственно, минимальное и максимальное значения я605/iий660 наблюдается во время калибровки.
  4. Соберите около 10 мкл крови рыб от приблизительно 5 взрослых животных. Место рыбы в чашке Петри с 1 мкл/мл воды подвеска гвоздичное масло для анестезии и подождать до тех пор, пока животное оказывается на его стороне и перестает отвечать на щепотки плавника (обычно ~ 2-3 мин). Передача рыбы на стеклянное скольжение. Отрезать хвост рыбы с стрельчатые и собирать примерно 2 мкл крови рыб из Вены хвост.
    Примечание: Для предотвращения свертывания крови, лечить разрез с гепарином (5000 ед/мл) и использовать гепаринизированным стеклянные капилляры и microcentrifuge трубки для сбора крови.
    1. Капельного около 10 мкл крови с пипеткой на кончик микроэлектродные и определить с помощью рН метр pH.
    2. Капля крови на слайд с микрокапсулами сушеные и зарегистрировать отношение интенсивности флуоресценции, как описано для калибровки буферов (шаги 2.2-2.3).
  5. Отрегулируйте коэффициент линейной калибровочной кривой сделать кривой соответствуют измерениям в крови рыбы (для более подробную информацию см. Borvinskaya et al. 20175).

3. подготовка для инъекций

  1. Выпуск стальной иглой от кончика инсулина пера (или шприц), удалив пластиковые с острым Ланцет.
    Примечание: Любой тонкой иглой (Ø0.33 мм или меньше) или стеклянные капиллярные (обычно Ø1 мм) могут быть подготовлены для микроинъекции10,11.
  2. Вставьте иглу на полпути в микрокапиллярной стекла; быстро и аккуратно спаять его с помощью газовой горелки.
  3. Подключите микрокапиллярной стекла к microinjector и промыть стерильной водой три раза. Убедитесь, что жидкость течет через иглу.
  4. Заполните систему с дистиллированной водой.
    Примечание: Убедитесь, что в системе существует никаких пузырей.

4. инъекции

  1. Ресуспензируйте подготовленный подвеска микрокапсулы (стерильного 0,9% NaCl, или любые другие средства массовой информации используются для инъекций, с концентрацией 0,5 до 6 миллионов микрокапсулы в микролитр) с помощью Ультразвуковая ванна на 1 мин.
    Примечание: Поскольку микрокапсулы, как правило, осадок, во время следующей инъекции, встряхните флакон с микрокапсулами механически (с помощью ротора) или вручную каждые несколько минут, чтобы Ресуспензируйте их и предотвращать их агрегирования.
  2. Место рыбы в чашке Петри с анестетиком (0,1 мл/Л масла гвоздики, взвешенных в воде) ~ 2-3 минут ждать пока рыба превращается на его стороне и перестает отвечать на легкий Пинч плавника.
  3. С помощью ложки, передача рыбы из анестетиков и осторожно поместите его на влажной губкой в боковой позиции с головой влево (для правша) или вправо (для левшей человека).
  4. Как раз перед инъекцией сосать 1-2 мм воздуха в стеклянный капилляр связаны с microinjector. Затем загрузите его с приблизительно 2 мкл дисперсной микрокапсулы.
    Примечание: Перед инъекцией, микрокапсульная решения должны быть скорректированы до температуры, на котором хранятся рыбы.
  5. Аккуратно стабилизируйте тело рыбы на губку с недоминирующей руки.
    1. Найти боковой линии рыб. Мысленно выделите сегмент, который простирается от крышечки до конца брюшной полости. Найти в середине этого сегмента. Положите иглы 1 мм ниже в вентральной направлении.
    2. Соскоб движением аккуратно переместите Рыба весы в сторону и сделать прокол. Вставьте иглу в тело под углом 45° к поверхности стола.
    3. Вставьте иглу к позвоночника до тех пор, пока он тщательно лежит против него.
    4. Выпуск примерно 1 мкл суспензии микрокапсулы в почках и медленно снять иглу.
      Примечание: Чтобы найти надлежащее прокол сайт более легко, полезно практике найти ствол почек, к рыб, используя свет снизу, как показано на рис. 2A и 2B.
  6. Промывайте рыбу от головы до хвоста с потоком воды, чтобы удалить любые пролитой микрокапсулы в месте инъекции.

5. Визуализация в естественных условиях

  1. Используйте ножницы рассечение, чтобы удалить жаберной крышки из головы рыбы и оголять жабры рыбы. Промывайте жабры с водой.
  2. С помощью ложки, передача рыбы для микроскопа и поместите его на сцене флуоресцентный Микроскоп.
    Примечание: Убедитесь, что жабры рыбы не высохнуть в течение последовательных процедур. Чтобы избежать этого, периодически смачивают их водой с помощью пипетки Пастера (примерно каждые 1-2 мин).
  3. Затемнить номер и используя низкий масштаб (x 10 цель) осмотрите жабры найти флуоресцентные микрокапсулы.
    Примечание: При процедуре используется для внедрения некоторых флуоресцентные частицы в рыбы сердечно-сосудистой системы, рекомендуется проверять жабры нескольких лиц для неожиданных флуоресцентные частицы до инъекции. Жабры данио рерио одичал типа не имеют аутофлюоресценция, но в некоторых случаях отдельные флуоресцентные частицы (как куски пищи или одноклеточные симбионтами) могут присутствовать на жабры. При необходимости, такие частицы могут быть признаны на основании их определенной формы (например, куски пищи имеют неправильную форму, в отличие от сферического микрокапсулы) или спектр флуоресценции (то есть, цвет).
    1. Переключитесь выше величины (цель × 40) объектив и положение микрокапсульная или группы микрокапсулы в центре поля зрения.
    2. Поверните рычаг в порт с подключенного спектрометр. Запись спектрального сигнала.
    3. Поверните рычаг обратно в окуляр.
    4. Повторите измерения для различных микрокапсулы несколько раз.
  4. Трансфер рыбы в аквариуме с надлежащей аэрации для восстановления.
    Примечание: С минимальной практике, это возможно для выполнения инъекций и сигнал записи с приблизительной скоростью 2-3 мин на рыбу. Измерение может быть повторен для отдельных несколько раз с использованием повторных доз низкой, безвредные анестезии или другой метод фиксации. Для долгосрочного наблюдения используйте систему с непрерывной анестезии12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полученные результаты приходят от одного из трех основных категорий представленных протокола: формирование флуоресцентный микрочастиц путем инкапсуляции флуоресцентные краски (рис. 1), почки инъекции микрокапсулы с дальнейшей визуализации в Джилл капилляров (рис. 2 и 3) и, наконец, в естественных условиях спектральная записи SNARF-1 флуоресценции для мониторинга рН крови (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы продемонстрировать инъекции микрочастиц в почках данио рерио, мы использовали полупроницаемой микрокапсулы, загружен с красителем индикатора. Таким образом в протоколе содержатся инструкции для изготовления микрокапсулы, используя слой за слоем Ассамблея противоположно заряженных полиэлектролитов7,8,,1516,17 ,18 (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают значительно помощью Богдан Осадчий и Евгений Протасов (Иркутский государственный университет, Россия) в рамках подготовки видео протокола. Это исследование было поддержано Российского научного фонда (#15-14-10008) и российского фонда фундаментальных исследований (#15-29-01003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

3

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SNARF-1-dextran, 70000 МВтFluor Fisher ScientificD3304Флуоресцентный зонд. Любой другой подходящий флуоресцентный краситель, связанный с полимером, может быть использован в качестве наполнителя микрокапсул
Альбумин-флуоресцеин изотиоцианат конъюгат (FITC-BSA)SIGMAA9771Флуоресцентный зонд
Родамин B изотиоцианат-декстран (RITC-декстран)SIGMAR9379Флуоресцентный зонд
Образование шаблонов
Образованиекарбоната натрия SIGMAS7795CaCO3
поли(аллиламина гидрохлорид), MW 50000 (PAH)SIGMA283215катионный полимер
поли(4-стиролсульфонат натрия), MW 70000 (PSS)SIGMA243051анионный полимер
поли-L-лизин [20 кДа], привитый полиэтиленгликолем [5 кДа], g = 3,0 до 4,5 (PLL-g-PEG)SuSoSPLL(20)- g[3.5]-PEG(5)Готовый полимер для повышения биосовместимости микрокапсул
Хлорид натрияSIGMAS8776Для растворения применяемых полимеров
Система очистки водыMilliporeSIMSV0000Для приготовления деионизированной воды
Магнитная мешалкаSteglerДля формирования
шаблонов CaCO3Eppendorf  Исследования  плюс пипетка, 1000 & микро; LEppendorfДозирующие решения
Eppendorf  Исследования  плюс пипетка, 10 и микро; LEppendorfДозаторы
Наконечники для дозаторов, диапазон объема от 200 до 1000 и микро; LF.L. Medical28093Дозирующие растворы
Наконечники для пипеток, диапазон объема 0,1-10  μ LEppendorfZ640069Дозирующие решения
Мини-центрифуга Microspin 12, высокоскоростнаяBioSanДля процедуры центрифугирования-промывки микрокапсул
Микроцентрифужные пробирки, 2 млEppendorfZ666513Синтез и хранение микрокапсул
Шейкер Intelli-миксер RM-1LELMY Ltd.Для снижения агрегации микрокапсул
Ультразвуковой очистительДля снижения агрегации микрокапсул
Головные телефоны Для защиты ушей от ультразвука
Этилендиаминтетрауксусная кислотаSIGMAEDSДля растворения шаблонов CaCO3
МононатрийфосфатSIGMAS9638Приготовление pH-буферов
Динатрий-фосфатSIGMAS9390Приготовление pH-буферов
Гидроксид натрияSIGMAS8045Для регулировки рН раствора ЭДТА и буферов
Термостатная камераДля сушки микрокапсул на предметном стекле
Гемоцитометр КамераДля исследования распределения размеров и концентрации приготовленных микрокапсул
Флуоресцентный микроскоп Микмед 2ЛОМОВизуализация микрокапсул в крови
рыб in vivoКомплект флуоресцентных фильтров для СНАРФ-1 (следует выбирать в зависимости от модели микроскопа; пример предоставляется)Chroma79010Визуализация микрокапсул с помощью флуоресцентных зондов
Волоконный спектрометр QE ProOcean OpticsКалибровка микрокапсул под микроскопом
Оптическое волокно QP400-2-VIS NIR, 400μ m, 2 мОкеаническая оптикаДля подключения спектрометра к порту микроскопа
Коллиматор F280SMA-AThorlabsДля подключения спектрометра к порту микроскопа
Предметное стекло микроскопаFisherbrand12-550-A3Калибровка микрокапсул под микроскопом
Покровные стекла, 22 x 22 ммЖемчугMS-SLIDCVКалибровка микрокапсул под микроскопом
Стеклянные микрокапилляры Intra MARK, 10 & микро; LBlaubrandBR708709Для сбора крови рыб
Гвоздичное маслоSIGMAC8392Обезболивание рыб
Ланцет No 11Apexmed international B.V.P00588Для разрезания рыбьего хвоста и освобождения стальной иглы от кончика инсулинового автоинъектора
Гепарин, 5000 Ед/млCalbiochemL6510-BCДля обработки всех поверхностей, соприкасающихся с рыбьей кровью во время забора рыбьей крови
Seven 2 Go Pro pH-метр с микроэлектродомMettler ToledoДля определения pH крови рыб
Инсулиновые ручки иглы Micro-Fine Plus, 0,25 х 5 ммBecton, Dickinson and CompanyДля инъекционной процедуры. Подойдет любая тонкая игла (Ø 0,33 мм или меньше) Стеклянные
капилляры, 1 х 75 ммHirschmann Laborgerä te GmbH & Co9201075Для инъекционных процедур
Газовая горелкаДля пайки стальной иглы к стеклу капилляра
Микроинъектор IM-9BNARISHIGEДля точного дозирования микрокапсул суспензии
чашки Петри, 60 мм х 15 мм, полистиролSIGMAP5481Для манипуляций с рыбами под наркозом
Пластиковая ложкаДля манипуляций с рыбами под наркозом
Влажная губкаДля манипуляций с рыбами под наркозом
Диссекционные ножницыThermo Scientific31212Для снятия жаберной крышки с головы рыбы
Пипетка Пастера, 3,5 млBRANDZ331767Для увлажнения жабр рыб
хлорида кальция SIGMA C1016 CaCO матриц для подсчета клеток крови

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
  2. Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
  3. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).
  4. Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427(2016).
  5. Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
  6. Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).
  7. Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
  8. Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
  9. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
  10. Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).
  11. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960(2008).
  12. Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).
  13. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).
  14. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
  15. Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
  16. Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
  17. Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
  18. Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
  19. Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microparticle InjectionFish KidneyIntravital ImagingMicrocapsule PreparationFluorescent ProbeBlood pH MonitoringZebrafish Circulatory SystemLayer by Layer EncapsulationGill VisualizationSpectral Analysis

Похожие статьи