Поколение сфероидов человеческого носа эпителиальных клеток для исследования регулятор трансмембранной проводимости индивидуализированные муковисцидоза

Кистозный фиброз (CF) является фатальным, аутосомно-рецессивный заболевание, которое поражает свыше 70 000 человек во всем мире¹. Эта жизнь укорочение генетическое заболевание вызвано мутациями в кистозный фиброз трансмембранной проводимости регулятор белка (МВТР)². МВТР является членом семьи кассеты аденозинтрифосфат привязки, и функций как ионного канала, позволяя движение хлора и бикарбоната через Апикальное мембраны нескольких поляризованные эпителия, включая желудочно-кишечного тракта, потовых желез, и дыхательные дерево, среди прочих^3,4. Таким образом дисфункциональные МВТР приводит к мультисистемный эпителиальных дисфункции, с большинство смертности, обусловленной респираторных заболеваний¹. В легких CF, потерей МВТР driven сократимость поверхности жидкости (ASL) регулирование и слизи релиз приводит к утолщенные слизи, обструкции дыхательных путей, хронической инфекции и прогрессивного сократимость ремоделирования и легких функция^1,5.

Несмотря на выявление МВТР дисфункции как причина болезни терапии в CF традиционно ориентировалась на смягчение симптомов (например, поджелудочной ферменто-заместительную терапию, сократимость Распродажа терапии)¹. Этот подход был недавно произвел революцию, появлением новых терапевтов, называют «МВТР модуляторы, «которые предназначены непосредственно для неблагополучных МВТР. Этот подход сместился клинических пейзаж с симптом управления Болезнь модифицирующие уход, но носит несколько ограничений^6,,78,9,10. Модулятор деятельности конкретного дефекта белка, сопровождающие каждый МВТР мутации и ограничивается выбрать генетических населения¹¹. Это ограничение определяется неоднородный характер дефектов белка, но и с непрактичности клинических испытаний в редкой мутации групп. Кроме того среди предметов с хорошо изученных генотипов (например, F508del/F508del МВТР, наиболее распространенных МВТР мутации), есть большой изменчивости в болезни бремя и модулятор ответ^{6,7,8 ,9,11}.

Чтобы преодолеть обе эти проблемы, следователи предложил использовать персонализированные модели для доклинических испытаний¹². Эта концепция использует ткани пациента специфичные для создания индивидуализированных ex vivo модель системы для тестирования соединения, прогнозирования в vivo ответ тему терапии в персонализированные образом. После проверки, такая модель может использоваться клиницистам диск точность терапии независимо от базовой МВТР генотипа пациента.

Человека бронхиальной эпителиальных клеток (HBE), полученные от экспланта ткани во время пересадки легких предусматривает возможность такой модели для CF^13,14. HBEs, выращенных на интерфейс воздуха жидкость (Али) позволяют функциональных МВТР количественной оценки непосредственно через электрофизиологическое тестирования или косвенно мер ASL гомеостаза^13,15. Эта модель имеет чрезвычайно важное значение для понимания МВТР биологии и было ключевым фактором в развитии МВТР модуляторы¹⁶. К сожалению HBE модели не являются прочными как персонализированные модели вследствие захватнический характер приобретения (пересадка легкого или бронхиальной щеткой) и отсутствие образцов для тех, кто с редкой мутации или легкое заболевание. И наоборот кишечных тканей, полученных от ректального или двенадцатиперстной биопсии образцов, может использоваться для кишечных измерения тока (ICM) или на основе опухоль органоид пробирного для изучения индивидуального МВТР функция^{17,18, 19}. органоид анализы, в частности, являются очень чувствительных моделей МВТР деятельности^20,21,22. Обе модели ограничены ткани источника (кишечные ткани, в то время как большинство болезней патологии органов дыхания) и полу инвазивный метод приобретения. Кроме того некоторые следователи изучили человеческого носа эпителиальных клеток (HNE) до модели МВТР реставрации^23,24,25. HNEs могут быть безопасно собраны кистью или выскабливание предметам любого возраста и, когда культивировали в Али, пилки многие характеристики HBEs^25,26,27,28. HNE монослой культуры традиционно были ограничены плоскоклеточный трансформации и долгое время до погашения²⁹. Кроме того, сообщил короткого замыкания измерения токов в HNEs меньше, чем в HBEs, предлагая меньше окно для обнаружения терапевтической эффективности²⁵.

Учитывая необходимость персонализированные, неинвазивный, дыхательной техники культуры тканей модели МВТР функции, мы стремились объединить чувствительность основанные на опухоль, пробирного органоид с неинвазивные и дыхательных характер HNEs. Здесь мы описываем наш метод генерации 3-мерной «сфероиде» культур HNEs для индивидуального изучения МВТР в опухоль на основе анализа³⁰. HNE сфероидов поляризовывайте надежно с эпителиального Апекс к сфере центр, или люмен. Эта модель перечисляет многочисленные характеристики ниже эпителия дыхательных и созревает быстрее, чем Али культур. Как функционального анализа HNE сфероидов надежно количественно спектр МВТР функции, а также модуляции в хорошо изученных мутации групп (например, F508del МВТР). Этот assay, основанные на опухоль капитализирует на Ион/соль транспортных свойств МВТР, косвенно измерения приток жидкости в сфероида следующим апикальной соли измеряем воды. Таким образом стимулируется сфероидов с полностью функциональный МВТР зыбь надежно, в то время как те, с неблагополучной МВТР зыбь меньше или сжать. Это количественно посредством предварительного анализа изображений и 1 час после стимуляции сфероидов, измерения Люминал области и определения процент изменения. Эта мера можно сравнить экспериментальных групп экран для отпорности наркотиков в форме конкретного пациента.

HNE образцы были закуплены от субъектов, набранных через Цинциннати-Детская больница медицинского центра CF исследовательский центр. Все методы, описанные здесь были одобрены организационного обзора (КИБ) Цинциннати Детская больница медицинского центра. Письменное согласие было получено от всех субъектов до тестирования.

1. Подготовьте расширения средств массовой информации и антибиотиков

1. Соберите мультимедийные компоненты, перечисленные в таблице 1. Оттепель замороженных материалов при комнатной температуре и сделать необходимых запасов решений, как указано в таблице 1 под «Расширение медиа».
   Примечание: Будьте внимательны при обработке холеры токсин, который является токсичным, если его проглотить и кожи, глаз и Респираторные раздражитель. Сделать и объединить все решения и СМИ в чистых условиях в кабинете биобезопасности.
2. С помощью Пипетки серологические 50 мл, снимите и выбросьте 50 мл базовой среды (Дульбекко изменение Eagle среднего/F12) из одного контейнера, чтобы компенсировать добавлением других материалов. Залейте все базы СМИ вручную в газобетона стеклянная бутылка 1 Л.
3. С помощью пипетки Серологические Пипетки или 1 мл 50 мл как необходимости, передача всех остальных компонентов из раздела «Расширение медиа» в таблице 1 в газобетона стеклянный флакон, содержащий средства массовой информации. Слегка взболтать флакон вручную, чтобы смешивать.
4. Фильтр СМИ в свежий, стерильные 1 Л, 0,22 мкм Полиэфирсульфон (PES) фильтр колбу с помощью инструкции производителя и аннотировать с «Расширение медиа» и дата.
5. Подготовьте антибиотики СМИ. Сделать необходимые антибиотик акций решения, как указано в таблице 1 под «Антибиотик СМИ.»
   1. С помощью Пипетки серологические 50 мл, 150 мл расширения СМИ передать свежие 250 мл газобетона стеклянной бутылке.
   2. С помощью пипетки 1 мл, добавьте все компоненты из раздела «Антибиотик СМИ» в таблице 1 в газобетона стеклянный флакон, содержащий средства массовой информации. Взболтать вручную до тех пор, пока средства массовой информации единый внешний вид.
   3. Фильтр СМИ в свежий, стерильные 250 мл, 0,22 мкм PES фильтр колбу с помощью инструкции производителя и аннотировать с «Антибиотик медиа» и дата.
6. Хранить при 4 ° C на срок до одного месяца, отбрасывая если облачно, предлагая загрязнения.

2. подготовить дифференциация СМИ

1. Соберите мультимедийные компоненты, перечисленные в таблице 2. Оттепель замороженных материалов при комнатной температуре и сделать необходимых запасов решений, как указано в таблице 2.
   Примечание: Будьте внимательны при обработке ретиноевой кислоты, которая является репродуктивного токсин, могут быть токсичными, если проглотил и вызывает раздражение кожи. Сделать, аликвота и объединить все решения и СМИ в чистых условиях в кабинете биобезопасности.
2. Снимите и выбросьте 52 мл базовой среды из одного контейнера, чтобы компенсировать добавлением других материалов. Залейте все базы СМИ в газобетона стеклянная бутылка 1 Л.
3. С помощью Серологические Пипетки 25 мл или 1 мл пипетки в соответствующих случаях, передача всех остальных компонентов из таблицы 2 газобетона стеклянной бутылке, содержащий средства массовой информации и вихревой мягко вручную смешивать.
4. Фильтр СМИ в свежий, стерильные 1 Л, 0,22 мкм Полиэфирсульфон (PES) фильтр колбу с помощью инструкции производителя и аннотировать с «Медиа дифференциации» и дату.
5. Хранить при 4 ° C на срок до одного месяца, отбрасывая если облачно, предлагая загрязнения.

3. слой культуры блюда и пластинчатый питатель фибробластов

Примечание: Выполните все шаги в чистых условиях в кабинете биобезопасности.

1. Перемешать 0,5 мл акций коллагена и 37,5 мл стерильной воды в 50 мл Конические трубки.
2. Пипетка 4-5 мл раствора коллагена в каждой чистой культуры блюдо P100, обеспечить что вся поверхность покрыта.
3. Обложка блюда с крышкой и инкубировать на ночь при 37 ° C и 5% CO₂.
4. В области биобезопасности кабинета удалите все блюдо крышками. Вихрем решение для покрытия блюдо, а затем удалить.
5. Стерилизуйте под воздействием ультрафиолетового (УФ) света на 1 ч. место крышки обратно на блюда, стека и крышка блюда с алюминиевой фольгой.
6. Магазин с покрытием блюда на 4 ° C на 3-6 месяцев, повторной стерилизации под УФ света 15-30 мин перед использованием культуры клеток.
7. 24 ч до получения HNE образца, стерилизовать предварительно покрытых блюдо и ярлык как мышь эмбриональных фибробластов (MEF) и дату.
8. Добавьте расширение СМИ крышка (примерно 5 мл) с Серологические Пипетки.
9. Оттепель флакон 2 х 10⁶ облученных MEFs в капилляре 37 ° C. Как только разморозить MEFs, добавьте половину флакона (приблизительно 10⁶ клеток) на блюдо с 1 мл пипетки, вращая вручную разойтись.
10. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ на ночь в рамках подготовки к HNE культуре.
    Примечание: При необходимости, шаги 3,7-3.10 может быть выполнена как в конце 60 мин до обшивки клетки, хотя на ночь идеально.

4. получить и обработать HNE образец

1. Убедитесь, что IRB утвержденных согласии/согласие получено для всех субъектов.
2. У пациента удар нос для очистки сыпучих слизи.
3. Визуализируйте нижней носовой раковины, с помощью rhinoscope. Убедитесь, нет повреждений или полипов являются подарком, который может препятствовать проб.
4. Соберите носовой клетки от первого ноздрю кюретаж или щеткой.
   1. Кюретаж: Загиб кюретки в середине для создания небольшой, ~ 135^° угол с вершиной от кюретка Кубок. Вставьте кюретки в ноздрю и заранее кюретка Кубок под нижней носовой раковины. Аккуратно нажмите кюретка Кубка против нижней носовой раковины и циклюют раковин, потянув кюретка вперед, повторяющиеся всего 3 - 4 раза.
   2. Кисти: Перевал цитологии кисть ниже нижней носовой раковины, затем поворот и перемещайте щетку и слегка 4 - 5 раз, без выхода из ноздрей.
5. Место кюретка/кисть в 15 мл конические заполнены с антибиотиком СМИ. Повторите шаги 4.3-4.4 для другой ноздри, поместив кюретка/кисти в же конической трубки.
6. Храните конические на льду пока готовы для обработки. Убедитесь, что обработка происходит в течение 4 ч приобретения образца, но может произойти как поздно как 24 часа после приобретения, в случае необходимости.

5. процесс и расширять HNE клетки в блюда

Примечание: Выполните все шаги в чистых условиях в кабинете биобезопасности.

1. С помощью пипетки в 1-мл и СМИ из образца конические, мыть все клетки прочь кюретки/цитология кисти в же коническую пробирку. После того, как чистый, отбросить кюретки / кисти.
2. Центрифуга для конических 360 x g и 4 ° C за 5 мин.
3. Супернатант аспирата, стараясь не нарушить Пелле ячейки.
4. Вновь приостановите Пелле клеток в 3 мл раствора отряд клеток, дозирование с 1 мл наконечником для гомогенизации смеси.
5. Центрифуга для конических 360 x g и 4 ° C за 5 мин.
6. Повторите шаги 5.3-5.5 раз.
7. Аспирационная оставшиеся супернатанта, стараясь не нарушить Пелле ячейки.
8. Вновь приостановите гранулы в 1 мл антибиотик СМИ и подсчет количества ячеек с Горяева.
9. С помощью пипетки 1 мл, плиты клетки каплям на покрытием, фибробластов посеян блюдо, приготовленное в шаге 3.10. Добавление антибиотик СМИ в полной мере охватывать блюдо и разогнать ячейки по всей поверхности. Ярлык блюдо с содержание и Дата и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂.
10. После 48 ч убедитесь, что клетки прикреплены к культуре блюдо. Аспирационная СМИ и замените достаточно свежие антибиотик СМИ для покрытия плиты.
11. Изменить СМИ 3 x в неделю, аспирационных старых СМИ с разрежением и пипетка Пастера и заменив достаточно свежие СМИ для покрытия плиты. После 5 дней антибиотик СМИ измените средства массовой информации для расширения средств массовой информации, продолжая заменить три раза в неделю.
    Примечание: Риск загрязнения является высоким в течение первой недели культуры. Храните свежие образцы в отдельном инкубатор для сведения к минимуму риска перекрестного загрязнения.
12. Проверьте рост клеток несколько раз в неделю. После того, как клетки являются примерно 70-80% притока, продолжать переход клеток.

6. проход HNE клетки

1. Подготовьте 0,1% раствор трипсина в Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
   Примечание: Будьте осторожны, обработка трипсина, которая является кожи, дыхательных путей и раздражение глаз.
   1. Вес 15 мг трипсина из поджелудочной железы свиней в коническую пробирку.
   2. Вешу 56 мг ЭДТА в отдельном Конические трубки.
   3. В кабинете биобезопасности передачи трипсина и ЭДТА в стеклянной бутылке газобетона 250 мл. Используйте для полоскания трипсина/ЭДТА трубы для обеспечения полной передачи небольших Алиготе стерильных фосфат амортизированное saline (PBS).
   4. Добавление стерильные PBS довести общее решение до 150 мл. Плотно закройте крышкой.
   5. Инкубируйте раствор трипсина в капилляре 37 ° C до полного растворения. Проверять каждые 15 минут и удалите оперативно раз распущен.
      Примечание: Не устанавливайте для длительных периодов времени (например, на ночь), как трипсина в растворе будет денатурировать если нагревается слишком долго.
   6. Экологически чистые бутылки с спреев 2-3 70% этанола и вернуться к биобезопасности кабинета.
   7. Фильтр 0,1% раствор трипсина-ЭДТА в свежие, стерильные 250 мл, 0,22 мкм PES фильтр колбу с помощью инструкции производителя и аннотировать содержимое и дата.
   8. Хранят раствор трипсина ЭДТА на 4 ° C на срок до одного месяца, отбрасывая если Облачно.
2. Довести до комнатной температуры свыше 30 мин Clean с 70% этанола и передачи чистых биобезопасности кабинета дифференциация СМИ, 0,1% раствор трипсина-ЭДТА и стерильные PBS.
3. В области биобезопасности кабинета используйте разрежением и пипетка Пастера аспирационная и отказаться от средств массовой информации из тканевой культуры блюдо. Вымойте блюдо, добавив, закрученного и аспирационных 5 мл PBS с помощью чистой Серологические Пипетки.
4. С помощью Пипетки серологические 5-мл, добавить 5 мл 0,1% раствора трипсина-ЭДТА на культуре ткани блюдо и вернуться к инкубатора при 37 ° C и 5% CO₂ на 5 мин.
5. Визуализируйте клетки на инвертированным микроскопом на 4-10 X. Убедитесь, что клетки оторваться от блюдо, стать раунд и плавать. Аккуратно нажмите на стороне культуры блюдо выбить клетки, и/или повторно инкубировать еще 5 минут до тех пор, пока большинство клеток отсоединены.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы быстро удалить ячейки, после отсоединения от культуры блюдо; длительное воздействие на 0.1%, трипсин-ЭДТА нарушит ячейки жизнеспособность.
6. С помощью Пипетки серологические 10 мл, добавить 5 мл расширения средств массовой информации на блюдо и собрать все жидкого содержимого (всего 10 мл) в обозначенные, стерильные 50 мл Конические трубки.
7. Если клетки остаются приверженцами культуры блюдо, повторите шаги 6,4 до 6,6 два раза, сбор содержимого в том же конической трубки.
   1. Если клетки остаются приверженцем культуры блюдо после трех раундов трипсина решение экспозиции, используйте стерильные клеток скребок аккуратно удалить остаток. После соскабливания блюдо, мыть скребок и блюдо с 5 мл расширения средств массовой информации и собирать в же надписью конической трубе.
      Примечание: Если пассированый сфероидов, измените эту процедуру для выполнения дифференциального trypsinization. После добавления трипсина решение (шаг 6.4.), проверьте блюдо часто пока фибробластов отдельный (обычно 1-2 мин), оставив только полигональных эпителиальные клетки придают блюдо. Собирать и отложите это супернатанта, который может быть пассированной вперед для расширения. Повторите шаги с помощью того же решения трипсина 6.4-6.6 и собирать только оставшиеся эпителиальных клеток на сфероиде культуры.
8. Центрифуга для конических в 360 x g для 5 минут и 4 ° C. Аспирационная СМИ от конической.
9. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл расширения средств массовой информации и количество клеток с помощью hemacytometer.
10. После того, как количественно, клетки можно разделить при необходимости и пассированной вперед на новой культуры блюдо (включая подготовку совместного культуры фибробластов, шаг 3 и покрытие клетки для расширения, шаги 5,9-5.12) либо культивировали как сфероидов (шаг 7).
    Примечание: Если пассированый для новой культуры блюдо для расширения, посева плотностью 0.5-1 × 10⁶ клеток в блюдо P100 рекомендуется.

7. Заполнение клеток для HNE сфероида культур

Примечание: Выполнять все процедуры на этом этапе, помимо центрифугирования, в чистой биобезопасности кабинета.

1. Оттепель базальной мембраны матрицы на льду за инструкциями изготовителя (100 мкл на сфероиде хорошо).
   Примечание: Рассмотреть возможность сделать стерильной 500 мкл аликвоты базальной мембраны матрицы на чеке; Эта сумма будет инициализировать одной пластине 4-хорошо.
2. Отдельные соответствующее количество дифференциально trypsinized, пассированный клеток (от шага 6.9) для окончательного концентрации 500000 клеток / мл матрицы. Для 4-ну плиты используйте 200 000 ячеек. Собирают в 1,5 мл.
3. Центрифуга для клеток и СМИ смеси на 360 x g 5 мин при 4 ° C. Полностью, но тщательно аспирационная и отбросить 1 мл пипетки, стараясь не нарушить Пелле ячейки с помощью средств массовой информации.
4. С помощью кончика пипетки 1 мл, добавьте 100 мкл за планируется также матрицы базальной мембраны для 1.5 мл, содержащие клетки. Держите трубку на льду.
5. Пипетка вверх и вниз, чтобы внимательно и тщательно Ресуспензируйте клетки в матрице базальной мембраны. Двигаться быстро, чтобы избежать затвердевания матрицы. Избегайте полностью опорожнить наконечник пипетки для обеспечения воздушных пузырьков не вводятся в ячейки матрицы микс.
6. Семя 100 мкл матрица аликвоты в каждой скважине плиты культуры эко 4-хорошо.
   1. Использование чистого пара ножниц, обрежьте дистальной части 3-4 мм кончика пипетки 200 мкл.
   2. Тщательно используя кончик подстриженные, Пипетка µL 100 клеток/матрица смеси в центр каждого хорошо. Пипетка медленно, с целью сделать одну матрицу «капля» в центре каждой скважины. Падение должно оставаться сферической и не должен касаться стороны колодца. При перемещении пластину, делаете так тщательно избегать, нарушая эти капли.
   3. Инкубируйте базальной мембраны матрица капель при 37 ° C и 5% CO₂ на 30 мин, до твердого тела.
   4. Тщательно Пипетка 500 мкл дифференциации СМИ в каждой скважине, стараясь не нарушить падение матрицы. Убедитесь, что средства массовой информации просто крышка матрицы падение и при необходимости добавить больше.

8. дифференцировать и зрелые сфероидов HNE

1. Аккуратно с помощью кончика пипетки 1 мл, аспирационная всех средств массовой информации из скважины; Избегайте аспирационных матрица, которая уничтожит сфероидов в той части матрицы, хотя любой сфероидов оставил может оставаться жизнеспособным.
2. С помощью кончика пипетки свежий 1 мл, осторожно добавьте 500 мкл дифференциации СМИ хорошо вокруг матрицы. Не трогайте матрицу с пипеткой и не мешать падение матрицы.
3. Возвращение в инкубатор на 37 ^oC и 5% CO₂ для продолжающегося роста сфероидов. Повторите шаги 8.1 через 8.3 три раза в неделю.
4. Оцените сфероида морфология ежедневно под инвертированным микроскопом 20 X. Сфероидов следует сформировать в течение 3-5 дней обшивки и достигают зрелости в течение приблизительно 10 дней.

9. предварительной обработки, стимулировать и изображение HNE сфероидов для анализа

1. Предварительной обработки сфероидов нужным до изображений как описано³⁰.
   Примечание: Для предварительной VX809, добавьте 3 мкм VX809 в СМИ за 48-72 ч до изображений. Смешайте 1 мкл 10 мм VX809 запасов (см. Таблицу материалов) в 3,3 мл средств массовой информации для этой концентрации.
2. Измените каждое хорошо из сфероидов до 1 мл свежего дифференциация СМИ, включая предварительной обработки (шаги 8.1-8.3) до визуализации сфероидов.
3. Подготовьте свежие стимуляции решения (форсколин, 3-изобутил-1-метилксантина [IBMX], VX770 и МВТР ингибитор 172 [Inh172]) препараты из запасов (см. Таблицу материалов). Для форсколин/IBMX добавьте 1 мкл каждого фонда в 98 мкл в одном меткой 1,5 мл стерильной воды. Для VX770 и Inh172 добавьте 1 мкл каждого фонда в 99 мкл стерильной воды в отдельных помечены 1.5 мл пробирок. Сделайте общий объем, позволяя для 50 мкл раствора для каждой хорошо протестированы. Подготовка решений в стерильных условиях в кабинете биобезопасности.
4. Передача сфероида пластины инкубируют палату, 37 ° C и 5% CO₂, установленный на инвертированным микроскопом оснащены электронным образ захвата программного обеспечения и механический этап для регулировки XY. Включите микроскопом и камеры, а также создания образов компьютеров.
5. Захвата изображения исходных сфероидов в одной скважиной.
   1. Откройте программное обеспечение захвата изображения (Slidebook 5.5 для указания ниже). После инициализации, откройте новый файл, нажав кнопку «Файл», затем «Новых». Соответственно имя файла и нажмите кнопку «Сохранить».
   2. Тщательно удалите крышку плиты культуры и центр одна капля матрицы над целью.
   3. Начиная с верхней части матрицы падение, переключите в сетке найти сфероидов при 20-кратном с окуляр микроскопа. Фокус вверх и вниз для захвата области в самом широком месте. Аннотируйте расположение каждого сфероида на карте матрица падения повторно определить после съемки.
   4. В программном обеспечении нажмите «Захват изображений». Для экспозиции, выберите «Вручную» и введите 50 г-жа обеспечить другие параметры подходят (Бен фактор: 1 x 1, ш: 512, H: 512, X и Y смещение: 0). Введите соответствующее имя для каждого изображения в поле «Имя» (например, сфероиде 1 базовый). Нажмите кнопку «Старт» для просмотра live-образа и «Сохранить», чтобы захватить базового образа.
   5. Повторите шаги 9.5.1-9.5.4, пока не будет достигнута цель номер, или отражаться вся матрица падение.
      Примечание: Группа различия могут быть обнаружены с всего лишь 3-5 сфероидов за состояние, однако, он стал нашей практики для изображения 10 или более сфероидов за условие для увеличения мощности. Изменчивость assay проявляется в рисунке 2 секции «Представитель результаты», с образцами сфероидов 8-10 на предмет как, например.
6. Стимулировать сфероидов.
   1. С помощью пипетки 200 мкл, добавьте 50 мкл препарата на соответствующей стимуляции в СМИ в колодец, стараясь не нарушить матрицы.
      Примечание: После этого десятикратного разрежения (50 мкл в 500 мкл СМИ), концентрация окончательный наркотиков будет: форсколин 10 мкм, IBMX 100 мкм, мкм VX770 1, Inh172 10 мкм.
   2. Для лагеря добавьте только форсколин/IBMX.
   3. Лагерь + VX770 добавьте форсколин/IBMX, а затем VX770 через 2 мин.
   4. Для тормозится условий, добавить Inh172 первый, а затем форсколин/IBMX через 2 мин.
7. Сразу же после стимуляции контролировать сфероида, опухоль, timelapse изображений на 1 ч. В программном обеспечении нажмите «Захват изображений». Нажмите кнопку «Timelapse» и задать интервал 30 сек, с продолжительностью 60 минут введите соответствующее имя и нажмите кнопку «Сохранить», чтобы начать timelapse.
   Примечание: Стандартные timelapse является для захвата изображения одного сфероида каждые 30 s для обеспечения высокого качества видео. Кроме того выполняйте нижний увеличение захват всего хорошо (например, 4 X) и меньше изображения, снятые при желании. Если используется автоматизированный этап, выполняют timelapse всех сфероидов с использованием предопределенных координат; в противном случае, используйте timelapse подмножество сфероидов предоставить качественный обзор набухания и обеспечить никаких систематических вопросов возникают во время обработки изображений (например, матрица отряд из колодца).
8. Сразу же после завершения имиджа timelapse 1 h, захвата изображения после стимуляции всех сфероидов (за шаг 9.5) с использованием карты, созданные на шаге 9.5.3.
   1. Обратитесь к предварительной стимуляции изображения, чтобы убедиться, что же плоскости фокуса используется для последующей изображений (фокуса качество окружающих клеток, сфероидов или мусора значительно облегчить этот процесс).
   2. Сохраняйте файлы с парными аннотации от шага 9.5.4 (например, сфероиде 1 после стимуляции).
      Примечание: завершить этот шаг сразу же после timelapse, как сфероидов могут продолжать расти.
9. Замените СМИ в образ хорошо свежий дифференциация СМИ.
10. Повторите шаги 9.5 через 9,9 для каждого хорошо/состояние, регулируя препараты стимуляции, как указано для экспериментальных условиях.
11. После завершения всех изображений, возвращение сфероидов в инкубатор при 37 ° C и 5% CO₂.
    Примечание: В зависимости от бесплодия инкубирован микроскоп камера, после стимуляции загрязнение сфероидов может быть довольно часто. Держите образ сфероидов в отдельном инкубатор, чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения, или отменить сфероидов сразу после съемки.

10. анализ HNE сфероида изображения

1. Экспортируйте все отснятые изображения в формате, совместимом с программного обеспечения для анализа изображений. В программном обеспечении нажмите «Вид», наведите «Экспорт» и выберите «По умолчанию вид из всех изображений как TIFF...». Сохраните на жесткий диск или флэш-накопитель для анализа.
   Примечание: A анализ коммерческого программного обеспечения (Таблица материалов) и TIFF-файлов выполнять хорошо и описаны здесь, хотя анализ может также производиться с использованием других платформ. При именовании файлов, сотрудники, анализ изображений должны быть ослепленный в экспериментальных условиях, но знать какие образы в паре (до и после стимуляции) для обеспечения эквивалентного анализа.
2. С помощью программного обеспечения для анализа, разграничить области Люминал каждого изображения сфероида и экспортировать в программное обеспечение для анализа данных.
   1. Программное обеспечение открытого анализа. Нажмите кнопку «Файл», затем «открыть» и перейдите к папке файл, содержащий сфероида изображений. Выберите все изображения для анализа и нажмите кнопку «Открыть».
   2. Нажмите «Мера» и выберите «Область измерений». В диалоговом окне область измерения выберите droptab «Конфигурация» и убедитесь, что «Имя изображения» и «Район» флажки.
   3. Нажмите кнопку «Журнал» и выберите «Открыть данные журнала». Нажмите кнопку «ОК» на файле поле и имя диалога журнала данных соответственно (например, условие X, дата). Это будет передавать все измерения в электронную таблицу.
   4. Выберите кнопку инструмента «След региона» и тщательно отслеживать люмен сфероида в первом изображении для анализа. В диалоговом окне область измерения нажмите кнопку «Данные журнала «Журнал измерений в Excel.
   5. Повторите шаги 10.2.2-10.2.4 до тех пор, пока анализируются все сфероидов.
3. Рассчитать процент изменения (100 * [пост stim - базовые] ÷ базовых) в районе Люминал от базового плана для каждого индивидуального сфероида изображение пары и сбор данных для анализа.

HNEs следует придавать культуры блюдо и формируют малые острова клеток в течение 72 ч посева; соответственно в рисунке 1A и 1B, приведены примеры формирования хорошей и плохой остров на одну неделю. Эти острова следует расширить для охвата блюдо в течение 15-30 дней. Небольшие или неоптимальной образцов может занять больше времени и часто не даст полезные сфероидов. Загрязнение с инфекционными агентами подтверждается глубокий желтый/облачно СМИ, клетки для присоединения к культуре блюдо, и/или прямой визуализации бактерий, грибов. Любые зараженных культур следует немедленно отказаться чтобы избежать перекрестного загрязнения.

В течение первых 3-4 дней культуры в матрице базальной мембраны мелких кистозных структур должны начинают формироваться в матрице. Эти будут перерастет нетронутыми сфероидов, демонстрируя тонкие стены и просветный поверхности в течение приблизительно 10 дней. Если покрытие в описанных плотности, успешно культур будет содержать сфероидов 50-100 на каплю матрицы. Люмен может быть относительно ясно (рис. 1 c) или заполнены с сотовой мусора и слизи (рис. 1 d); Первый является более распространенным в сфероидов с одичал тип МВТР (wtCFTR) и последний в CF сфероидов. Маскирование разграничить области Люминал сфероидов в Рисунок 1 c и 1 D проявляется в рисунке 1E и 1F, соответственно. Рисунок 1 g и 1 Hприводятся примеры плохо сформирован/неудачных сфероида культур.

Представитель функциональных данных для дикого типа и F508del МВТР гомозиготных HNE сфероидов показано на рисунке 2A и 2B, соответственно; Эти данные является представителем > 10 уникальных образцов HNE дикого типа и F508del МВТР гомозиготных субъектов30. Короче говоря сфероидов с функциональной МВТР набухают, пока те с неблагополучной МВТР зыбь значительно меньше, или может сократиться. В частности, сфероидов от субъектов с wtCFTR следует зыбь над часом когда стимулировали и следует зыбь меньше или сжать если стимулировали присутствии МВТР ингибитор Inh172. И наоборот сфероидов от субъекта гомозиготных для F508del МВТР следует либо уменьшить или зыбь очень незначительно, с увеличился отек (или менее усадки) когда фармакологически исправлены с МВТР модуляторы, VX809 и VX770. Предыдущий анализ сфероида надежности как внутри, так и между субъектами же генотипа продемонстрировать функциональная сегрегация МВТР генотипов и скромный изменчивости в неоднократные меры30.

Таблица 1: Компоненты расширения и антибиотик средств массовой информации.

Таблица 2: Компоненты среды дифференциации.

Рисунок 1 : Расширение HNE и структурные характеристики HNE сфероидов. Brightfield образы HNE расширения культур, принятых через семь дней после покрытия продемонстрировать успешные (белая стрелка, группа A) и формирования колонии HNE неудачной (группа B) на фоне фибробластов фидера. Успешно wtCFTR и гомозиготных сфероидов F508del показаны в панели C и D, соответственно. Маскирование разграничить области Люминал сфероидов из c/d приводится в панели E и F, соответственно. Неудачной сфероида культуры характеризуются небольшой, неорганизованное сотовой мусора (группа G) и/или дезорганизованы скопления клеток (группа H). Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Функциональные характеристики HNE сфероидов. Представитель функциональных реакций wtCFTR сфероидов от одного донора, при стимуляции с форсколин/IBMX с/без присутствия МВТР ингибитором Inh172, отображаемые в панели (A) каждая точка представляет ответ в одном сфероида. Представитель функциональных реакций F508del гомозиготных сфероидов от одного донора, при стимуляции с форсколин/IBMX с/без присутствия VX809 и VX770, отображаемые в панели (B). Планки погрешностей = SEM. ** p < 0,01; p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.