Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Эта статья описывает подробная методология для случайных мутагенеза целевого гена в деления дрожжей. В качестве примера мы нацелены на rpt4 +, которая кодирует Субблок 19S протеасомы, и экран для мутации, которые дестабилизируют гетерохроматина.

Abstract

Случайные мутагенеза целевого гена обычно используется для выявления мутаций, которые дают желаемого фенотип. Из методов, которые могут быть использованы для достижения случайных мутагенеза, ошибкам ПЦР является удобной и эффективной стратегии для генерации совокупность разнообразных мутантов (т.е., мутант библиотека). Ошибкам ПЦР является методом выбора, когда исследователь стремится мутировать предопределенных региона, например кодирвоания гена оставляя других регионах геномной не влияет. После того, как мутант библиотека усиливается ошибкам ПЦР, это должны клонироваться в подходящей плазмиду. Размер библиотеки, генерируемых ошибок ПЦР ограничивается эффективность клонирования шаг. Однако в деления дрожжи, Делящиеся дрожжи, клонирования шаг можно заменить с помощью высокоэффективных Одношаговая фьюжн ПЦР для создания конструкций для преобразования. Мутанты желаемый фенотипы могут быть выбраны с помощью соответствующих журналистам. Здесь мы опишем эту стратегию в деталях, взяв в качестве примера, репортер, вставляются в прицентромерного гетерохроматина.

Introduction

Форвард генетика является классическим методом, в котором исследователи стремятся естественным мутантов, которые отображают особое фенотип и генетического анализа. В обратной генетики мутации вводятся в ген интереса и изучены фенотипа. В последнем случае случайные мутагенеза целевого гена часто используется для создания пула мутантов, которые впоследствии выбраны для желаемый фенотипы, такие как чувствительность температуры или изменены ферментативную активность. Различные методы могут использоваться для достижения случайных мутагенеза, включая ошибкам ПЦР¹; УФ облучения²; Химические мутагены, таких как этиловый метансульфонат (EMS) или азотистой кислоты³; использование временных мутатора штаммов, например чрезмерной выражая mutD5 ⁴; и⁵Перетасовка ДНК.

Здесь мы описываем реверс генетика стратегия, в которой мы используем ошибкам ПЦР для создания мутантных бассейны для целевых генов в деления дрожжей. Как один догадаться из названия, этот метод создает мутаций, умышленно внося ошибки во время ПЦР. В отличие от других методов мутагенеза ошибкам ПЦР позволяет пользователю определять области, чтобы быть mutagenized. Это делает его особенно полезным в усилия для изучения функции белка/домена интерес.

Для демонстрации этой процедуры случайного мутагенеза, мы здесь использовать rpt4 +, которая кодирует Субблок 19S протеасомы, в качестве примера. Rpt4 было показано, что Протеолиз независимые функции в организмах Кроме деления дрожжевой^6,,78,9, и дефект в протеолиза может вызвать косвенные эффекты изменяя белки уровнях. Мы, таким образом, для мутантов, которые вызвали протеолиза независимые изменения, с целью изучения функции протеасомы на гетерохроматина.

Ошибкам ПЦР может применяться к любому региону гена, настроив расположение, в котором праймеры привязки. Мутантов, которые демонстрируют желаемого фенотипические изменения могут быть идентифицированы с соответствующим журналистам. Здесь, мы использовали ade6 + репортер вставлены в центромер 1 внешний Повторите региона (otr)¹⁰. Учредительный гетерохроматин формируется в этом регионе¹¹, поэтому ade6 + репортер замолчать в состоянии дикого типа; Это обозначается красным колоний¹⁰. Мутации, что дестабилизирует учредительного гетерохроматин на центромер приведет к выражению ade6 + репортер, который визуализируется как белых колоний.

Protocol

1. Подготовка носителя

1. Подготовьте экстракт дрожжей с добавками (да), да без аденин (да низкий Аде), средний Pombe глутамата (PMG¹²) и PMG без аденин (PMG-Ade) путем смешивания компонентов, как описано в таблице 1. Да-Аде (низкий Аде) и PMG-фасадные плиты имеют все те же компоненты, но аденин опущен из последнего.
   1. Используйте следующие запас соли (50 x): 52,5 г/Л MgCl₂·6H₂O, 2 г/Л CaCl₂·2H₂O, 50 г/Л хлористого калия, 2 г/Л Na₂,₄ в дистиллированной воде. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
   2. Используйте следующие витамин (1, 000 x) складе: 1 г/Л пантотенат, никотиновая кислота 10 г/Л, инозитола 10 г/Л, 10 мг/Л биотина в дистиллированной воде. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
   3. Используйте следующие минеральные (10, 000 x) складе: кислоты борной 5 г/Л, 4 г/Л MnSO₄, 4 г/Л ZnSO₄·7H₂O, 2 г/Л FeCl₂·4H₂O, 0,4 г/Л MoO₃, 1 г/Л ки, 0,4 г/Л CuSO₄·5H₂O , 10 г/Л лимонной кислоты в дистиллированной воде. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Да жидкой среды могут быть сделаны исключения агар.
2. Автоклав среднего и охладите его до 60 ° C при перемешивании с баром перемешать со скоростью 200 об/мин.
3. Для пластин да + G418 (geneticin) добавьте раствор 1 мл/Л G418 да среднего.
   1. Используйте следующие G418 (1, 000 x) складе: 100 мг/мл G418 в дистиллированной воде. Фильтр стерилизовать, используя фильтр размер пор 0,22 мкм, аликвота 1,5 мл пробирок, и хранить при температуре-20 ° C.
4. Перемешать еще 5-10 мин и Алиготе СМИ в Петри 90 мм (1 Л средних аликвоты для примерно 40 чашек Петри. Хранить пластины при 4 ° C.

2. клонирование rpt4 + и его 5′ / 3′ необычных

1. Выполнять ПЦР праймеры p1 и p2 (рис. 1A) с помощью деления дрожжевой геномной ДНК (геномная ДНК) как шаблон в суммарный объем 50 мкл (~ 1 мкг ДНК, 20 U фермента, 1 x реакции буфера), и применение циклов реакции, описанные в таблице 2 для усиления 3,315-база пара (bp) фрагмент, состоящий из rpt4 + и его 5′ / 3′ необычных. Очищайте продукт PCR, используя комплект для очистки¹³ как указано заводом-изготовителем (рис. 1A).
2. Дайджест pBlueScript KS(-) вектор¹⁴ и усиленные фрагмент ДНК, содержащие rpt4 + с его 5′ / 3′ необычных с BamH1 и Xho1 в общем объеме 20 мкл (~ 1 мкг ДНК, 20 U фермента, 1 x буфер пищеварения) при 37 ° C в водяной бане для 16-18 h (рис. 1B).
3. Гель Очистить переваривается вектор (1,2% геля агарозы) и ДНК вставить, выполняя TAE-основе геля агарозы (100 V, 1 h), вырезание ДНК полос желаемых размеров и изоляции ДНК с гель добыча комплект¹⁵.
4. Перевязать вектор и вставка ДНК с помощью T4 ДНК лигаза, выполнив реакции перешнуровки 20 мкл, содержащих 50-100 ng вектора ДНК, ~ вывозимому Молярная избыток Вставка ДНК, 400 U T4 ДНК лигаза и 1 x лигирование буфера. Инкубируйте эту смесь на 18 ° C для 16-18 ч.
5. Превратить 100 мкл E. coli DH5α перевязаны ДНК путем применения теплового шока для 70 s при 42 ° C. Добавьте 1 mL фунта и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C для восстановления. Выполнять центрифугирования (13800 x g), выбросьте пластину супернатанта, все преобразованные E. coli клетки на тарелках LB-ампициллин (LA) и инкубировать при 37 ° C для 16 h.
6. Выбрать 4-8 колоний с зубочистками и расти на ночь при 37 ° C в 3 мл Ла-среде.
7. Изолировать плазмид с¹⁶ плазмида комплект очистки используется согласно протоколу производителя и выполнять аналитические энзима ограничения пищеварения с 5 мкл изолированных плазмид, 5 U каждого энзима ограничения (BamH1 и Xho1) и 1 x ограничение буфера. Инкубируйте реакционной смеси при 37 ° C в водяной бане для 3 h. подтверждение клонирования путем виртуализации кандидат плазмид.

3. Введение немого мутации (Xho1 ограничение сайта)

1. Дизайн пары праймеров 33-bp (p3 и p4), которые содержат желаемого мутации в противном случае дополнительные последовательности.
2. Выполнять ПЦР с высокой точностью полимеразы¹⁷ (рис. 1 c) в общем объеме 25 мкл (10 нг клонирования плазмиды, 2 мкл 10 пмоль грунтовка микс, 2 U фермента, 1 x реакции буфера) с помощью Велоспорт параметров, перечисленных в таблице 3.
3. Дайджест шаблон плазмида с Dpnя в общем объеме 20 мкл (20 U фермента, буфер 1 x пищеварения) при 37 ° C в воде ванны для 1 h.
4. Преобразование, распространять, изолировать и последовательности плазмида, содержащий немого мутации, как описано в шагах 2.5-2.7.
   Примечание: Молчаливый мутации могут быть введены с помощью клонирования метод, который позволяет для объединения нескольких фрагментов ДНК в одном реакция¹⁸.

4. случайные мутагенеза rpt4 + ошибкам ПЦР

1. Выполнить-ошибкам PCR, используя плазмида с немого мутации (сайтXho1 ) как шаблон, грунтовки p5 и p6, суммарный объем 50 мкл (количество шаблон, определенный на шаге 4.1.1, 2 мкл 10 пмоль грунтовка микс, 2,5 U фермента, 1 x реакции буфера) , и специальные полимеразы, предназначенный для создания высокой ошибка оценить¹⁹ (рис. 1 d). Выполните ПЦР, как описано в таблице 2.
   1. Используйте 4-5 мкг шаблоне плазмиды для управления частотой мутаций 1 bp/КБ (kilobase).
      Примечание: Высокой концентрации (> 500 нг/мкл) плазмида, который может быть получен с помощью мини-prep комплект²⁰, не требуется.
2. Для подтверждения продукт PCR 2670 bp (1,2% геля агарозы) используйте гель-электрофорез. Гель очистить этот продукт PCR, как описано в пункте 2.5.

5. Подготовка Fusion ПЦР фрагментов (Кан, 3′ УТР)

1. Выполнять ПЦР с помощью pFA6a-KANMX6²¹ как шаблон, грунтовки p7 и p8, и условий, перечисленных в таблице 4 для получения фрагмента маркер (Кан). Гель Очистить результирующий фрагмент 1480 bp, как описано в шаге 2,5 (Рисунок 1E).
   1. Проверьте, если остановка кодон целевых для кодирования региона прилегающих гена и мутации гена, разделенных более чем 500 bp. Эндогенные Терминатор не могут быть использованы, когда этот регион является менее 500 bp; скорее ADH -Терминатор должны использоваться вместо эндогенного Терминатор. Протокол изменений, необходимых для использования ADH -Терминатор представлены в таблице 5.
      Примечание: Эти изменения применяются только когда Терминатор АДГ , которая доступна в pFA6a-3га KANMX6 плазмиды, используется вместо эндогенного Терминатор.
2. Выполнять ПЦР с клонированной rpt4 +-содержащие вектор как шаблонов и капсюли p9 и p10 в суммарный объем 50 мкл (20 нг клонирования плазмиды, 2 мкл 10 пмоль грунтовка микс, 2 U фермента, 1 x реакции буфера), с помощью условий, представлены в таблице 6. Гель Очистить полученные 506-ВР 3′ УТР фрагмента (Рисунок 1E).

6. поколение конструкции преобразования сплавливанием ПЦР (Рисунок 1E)

1. Подготовьте 3 фрагменты (mutagenized rpt4 +, Кан и 3′ УТР) на 50 нг/мкл.
2. Выполните слияние, которое ПЦР из трех фрагментов с помощью грунтовки p11 и p12, как описано в таблице 7. (Протокол для синтеза ПЦР является модификацией оригинальный протокол²²). Очищает основной продукт PCR 4398 ВР.
   1. Использовать rpt4 +: KAN:3′ УТР фрагменты в соотношении 1:3:1 для получения оптимальных результатов.
      Примечание: Общее количество дна вставки не должна превышать 500 нг. Рекомендуемое количество rpt4 +: KAN:3′ УТР-50 нг ng:50 ng:150. Mutagenized регион составляет примерно 1,6 КБ, поэтому минимальное количество дрожжей колоний, которые будут учитывать для всех возможных комбинаций каждой базы мутировал трех других 1600 x 3 = 4800 колоний. Потому что один преобразование реакции обычно дает 400-500 колоний, необходима по крайней мере 10 реакции сплавливания построить ПЦР стоит. Эта потребность может удовлетворяться путем простого увеличения суммы реакции (то есть, количество трубок ПЦР) по десять раз.

7. Преобразование деления дрожжевой путем электропорации (Рисунок 1F)

1. Прививать дрожжей до 10 мл да средней насыщенности, инкубации для более чем 16 h.
2. Разбавить клетки оптическая плотность 600 Нм (₆₀₀OD) 0,2 в 200 мл среды да и Инкубируйте на 30 ° C с встряхивания в течение 5-6 ч, ОД₆₀₀ = 0,6 – 0,8.
3. Концентрат клетки ОД₆₀₀ = 30, обойтись в четыре 50 мл конические трубы и холод на льду за 10 мин.
4. Урожай клетки, выполняя центрифугирования в 1050 x g 3 мин при 4 ° C. Место труб и 10 электро кюветы на льду. Выполните 7.3-7,8 на льду.
5. Отменить супернатант и добавляют 15 мл 1,2 М сорбитол. Осторожно встряхните трубы для Ресуспензируйте клетки.
6. Центрифуга клетки на 1050 x g 3 мин при 4 ° C.
7. Повторите шаги 7.4 и 7.5. Выбросите супернатант. Добавить 500 мкл сорбитол 1,2 М в каждую пробирку, Ресуспензируйте клетки и собирать все ячейки в одном 15 мл конические.
8. Добавить сорбитол 1,2 М до 2,4 мл (OD₆₀₀ = 10 на 0,2 мл). Держите трубку на льду.
9. Добавить 200 мкл сорбитол приостановлено клеток (убедитесь, что они являются полностью приостановлены) EP, тубы фьюжн ПЦР построить, хорошо перемешать и передать образец электро кювета.
10. Electroporate клетки со следующими параметрами: грибки, СХС (2.00kV, 1 импульса).
11. 600 мкл сорбитол 1,2 М для каждой электро кювета для общего объема 800 мкл, а затем распространилась клетки на четырех да пластины (200 мкл/плита). Десять электро кюветы будет обойтись 40 да пластины.
12. Инкубируйте пластины на 30 ° C в течение 24 ч.
13. Выполните реплики покрытие для да + G418 и инкубировать пластины при 30 ° C в течение 3 дней.

8. Выбор дестабилизирующих гетерохроматин мутантов и проверка на ложных срабатываний

1. Для каждой пластины да + G418 выполняют реплики обшивка да-Аде (низкий Аде) и плиты PMG-Аде (No Аде). Инкубируйте реплики пластины для 1-2 дня при температуре 30 ° C, до тех пор, пока некоторые из колоний на тарелках да-Аде Показать красную окраску (рис. 1 g).
2. Сравните да-Аде и PMG-Аде пластины и выберите клетки, которые показывают розовый или белый на пластину да-Аде и также растут на пластину PMG-Аде. Не выбирайте колонии без роста на PMG-Аде, как они ложных срабатываний (например, отражающие учет Кан кассеты на сайте непромысловых других в геноме).
3. Выберите примерно 1 х 10⁵ клетки от каждой колонии и инкубировать в 10 мкл СЗЗ раствора, содержащего zymolyase 100 Т 2,5 мг/мл при 37 ° C для по крайней мере 30 минут использования 1 мкл этого решения для выполнения как отправной шаблон для колонии PCR (рис. 1 H).
   1. Сделайте СЗЗ (50 мл), смешивая 30 мл 2 M сорбитола, 4.05 мл 1 M Na₂HPO₄, 0,95 мл NaH₂PO₄ и 15 мл дистиллированной воды (окончательный рН, 7.5). Образцы (5 мл) можно дополнить zymolyase и хранятся в 500 мкл аликвоты при-20 ° C до использования.
4. Выполняйте гель-электрофорез (1,2% агарозном геле, 180V, 20 мин) для визуализации результатов + колонии PCR. Выберите реакций, которые exhibit диапазоны PCR правильного размера и дайджест 5 мкл каждого продукта реакции с Xho(4 U фермента, 1 x пищеварение буфера, Ванна воды 37 ° C, 1 h) для отсеивания ложных срабатываний (рис. 1 H).
5. Выполняйте электрофорез геля для визуализации сборники XhoI (1.2% агарозном геле, 180 V, 20 мин). Марк колоний, чьи продукты PCR разрезаются на XhoIи пропатчить их да + G418 пластин (Рисунок 1I).
6. Изолировать геномная ДНК от деления клеток дрожжей и выполнить последовательность продуктов ПЦР²³. Сравните полученные последовательности с одичал типа последовательности для определения мутации (Рисунок 1I).
7. Прямо вновь ввести mutation(s) одичал тип клеток путем преобразования их с конструкциями фьюжн, усиливается ПЦР мутантные клетки²³. Для подтверждения фенотип в недавно сделал мутантные клетки (Рисунок 1J) используйте кровянистые выделения.
   1. Фьюжн преобразование конструкции можно легко усиливается ПЦР праймеры p1 и p10 с использованием геномной ДНК мутантов как шаблон в суммарный объем 50 мкл (~ 1 мкг ДНК, 20 U фермента, 1 x реакции буфера) и применения циклов реакции, описанные в таблице 2 . Преобразование конструкции могут быть сделаны следующие шаги 7,1-7.13.

Representative Results

Discussion

Случайные мутагенеза через ошибкам ПЦР является мощным инструментом для создания разнообразных пул мутантов в данном регионе. Этот метод особенно полезен для исследований, которые стремятся оценивать функцию белка при конкретных обстоятельствах. Например мы здесь используется ошибкам ПЦР для оценки функции Субблок протеасом 19S Rpt4, в гетерохроматина. Варьируя региона мишенью ошибкам ПЦР и корректировать условия отбора, мы были способны мутировать клетки в регионе геномной интерес и экран для желаемого фенотип. Недавно подобный метод был использован для изоляции деления дрожжевой клетки укрывательство мутации в шпиндель полюс тела компонент²⁵.

Ключевым преимуществом случайных мутагенеза является, что он может применяться для неосновных и основных генов. Случайные мутагенеза важно генов может принести разнообразных мутантов, такие тонкие и/или частичного функциональных дефектов, которые позволяют жизнеспособность клеток быть устойчивым, или мутанты, функции которых затрагиваются только под конкретные условия. Примером последнего является мутант чувствительных к температуре. Такие мутанты могут быть изолированы с помощью 5 мг/Л phloxine B, который пятна умирающих клеток в красном и позволяет медленно растущих клеток следует отличать от смерти клетки²⁶.

Важнейшим шагом этого протокола является ошибкам шаг ПЦР. На этом этапе важно контролировать частоту мутаций, которые могут варьироваться в зависимости от числа циклов PCR и суммы первоначального шаблона. Мы рекомендуем что пользователь исправить количество циклов PCR и изменять первоначальное количество шаблонов, как мы обнаружили, это будет более удобно стратегию для оптимизации. Мы отмечаем, что техника ошибкам PCR был широко доступны на протяжении десятилетий. Если пользователь выбирает, они могут искать метод для выполнение ошибкам ПЦР²⁷ вручную без использования коммерчески доступных мутагенеза kit.

Как предостережение уровень ложных положительных настоящего Протокола является довольно высоким. Таким образом мутант кандидаты должны пройти серию фильмов, предназначенных чтобы отсеять ложных срабатываний. Мы обнаружили, что молчание включение сайта ограничение в целевой ген может помочь избежать необходимости предметом ложных срабатываний на относительно трудоемкий этап последовательности. Это экономически эффективным, как мутант кандидатов может состоять в сотни или даже за его пределы.

Materials

<strong>1. Media</strong>
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Yeast extract	BD Biosciences	212720
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310
Adenine sulfate	ACR	16363-0250
Uracil&nbsp;	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO<sub>4</sub>&bull;7H<sub>2</sub>O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	12095
Potassium phthalate	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO<sub>4</sub>&bull;7H<sub>2</sub>O&nbsp;	JUNSEI	83060-031
FeCl<sub>2</sub>&bull;4H<sub>2</sub>O	KANTO	CB8943686
Sodium molybdate dihydrate	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO<sub>4</sub>&bull;5H<sub>2</sub>O	YAKURI	09605
D-myo-inositol	MP biomedicals	102052
Pantothenate	YAKURI	26003
Nicotinic Acid	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>&nbsp;	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarose	Biobasic	D0012
G418, geneticin	LPS	G41805
<strong>2. Enzyme reactions</strong>
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit	Aglient	200500	For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher	F-530L	For fusion PCR
Ex Taq&nbsp;DNA Polymerase	Takara	RR001b	For general PCR
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
<strong>3. Equipment</strong>
Velveteen square, black	VWR	89033-116	For replica
Replica-plating tool	VWR	25395-380	For replica
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100&nbsp;	For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Biorad	1652086&nbsp;	For fission yeast transformation
Thermal Cycler	Bioer	BYQ6078	For fusion PCR ramp reaction&nbsp;