Эта статья описывает подробная методология для случайных мутагенеза целевого гена в деления дрожжей. В качестве примера мы нацелены на rpt4 +, которая кодирует Субблок 19S протеасомы, и экран для мутации, которые дестабилизируют гетерохроматина.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Случайные мутагенеза целевого гена обычно используется для выявления мутаций, которые дают желаемого фенотип. Из методов, которые могут быть использованы для достижения случайных мутагенеза, ошибкам ПЦР является удобной и эффективной стратегии для генерации совокупность разнообразных мутантов (т.е., мутант библиотека). Ошибкам ПЦР является методом выбора, когда исследователь стремится мутировать предопределенных региона, например кодирвоания гена оставляя других регионах геномной не влияет. После того, как мутант библиотека усиливается ошибкам ПЦР, это должны клонироваться в подходящей плазмиду. Размер библиотеки, генерируемых ошибок ПЦР ограничивается эффективность клонирования шаг. Однако в деления дрожжи, Делящиеся дрожжи, клонирования шаг можно заменить с помощью высокоэффективных Одношаговая фьюжн ПЦР для создания конструкций для преобразования. Мутанты желаемый фенотипы могут быть выбраны с помощью соответствующих журналистам. Здесь мы опишем эту стратегию в деталях, взяв в качестве примера, репортер, вставляются в прицентромерного гетерохроматина.
Введение
Форвард генетика является классическим методом, в котором исследователи стремятся естественным мутантов, которые отображают особое фенотип и генетического анализа. В обратной генетики мутации вводятся в ген интереса и изучены фенотипа. В последнем случае случайные мутагенеза целевого гена часто используется для создания пула мутантов, которые впоследствии выбраны для желаемый фенотипы, такие как чувствительность температуры или изменены ферментативную активность. Различные методы могут использоваться для достижения случайных мутагенеза, включая ошибкам ПЦР1; УФ облучения2; Химические мутагены, таких как этиловый метансул....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка носителя
- Подготовьте экстракт дрожжей с добавками (да), да без аденин (да низкий Аде), средний Pombe глутамата (PMG12) и PMG без аденин (PMG-Ade) путем смешивания компонентов, как описано в таблице 1. Да-Аде (низкий Аде) и PMG-фасадные плиты имеют все те же компоненты, но аденин опущен из последнего.
- Используйте следующие запас соли (50 x): 52,5 г/Л MgCl2·6H2O, 2 г/Л CaCl2·2H2O, 50 г/Л хлористого калия, 2 г/Л Na2,4 в дистиллированной воде. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
- Исп....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Приобретенные Rpt4 мутантов, выполнив процедуры, описанные на рис. 1 могут быть проанализированы путем оценки цвета колоний. Цвета колоний запятнаны на соответствующие пластины в уменьшении количества клеток на рисунке 2. Ade6 + репортер вставлены в регионе гетерохроматин замолчать в одичал тип и показывает красный колоний в да-фасадные плиты. Как только дестабилизировали гетерохроматин и репортер ade6 + выражае.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Случайные мутагенеза через ошибкам ПЦР является мощным инструментом для создания разнообразных пул мутантов в данном регионе. Этот метод особенно полезен для исследований, которые стремятся оценивать функцию белка при конкретных обстоятельствах. Например мы здесь используется ошибкам ПЦР для оценки функции Субблок протеасом 19S Rpt4, в гетерохроматина. Варьируя региона мишенью ошибкам ПЦР и корректировать условия отбора, мы были способны мутировать клетки в регионе геномной интерес и экран для желаемого фенотип. Недавно .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Финансовую поддержку для этого проекта была представлена базовая программа исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки и ИКТ (2016R1A2B2006354).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильный>1. Среда | |||
| глюкоза | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Дрожжевой экстракт | BD Biosciences | 212720 | |
| L-лейцин | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Сульфат аденина | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Сигма-Олдрич | U0750 | |
| L-гистидин | Сигма-Олдрич | H8125 | |
| KH2PO4 | Сигма-Олдрич | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Фталат калия | Sigma-Aldrich | P6758-500G | |
| Инозитол | Sigma-Aldrich | I7508-50G Биотин | |
| Sigma-Aldrich | B4501-100MG | ||
| Борная кислота | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4• 7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2• 4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Дигидрат молибдата натрия | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4• 5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP биомедицинские | 102052 | |
| пантотенат | YAKURI | 26003 | |
| никотиновая кислота | сигма-олдрич | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose Biobasic | D0012 | ||
| G418, генетин | LPS | G41805 | |
| <стронг>2. Ферментативные реакции | |||
| PfuUltra II Fusion HS ДНК-полимераза | Aglient | 600380 | Для сайт-направленного мутагенеза |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | Для подверженной ошибкам ПЦР |
| Phusion Высокоточная ДНК-полимераза | Thermo Fisher | F-530L | Для фьюжн ПЦР |
| Ex Taq ДНК-полимераза | Takara | RR001b | Для общей ПЦР |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Комплектация | |||
| Вельветовый квадратный, черный | VWR | 89033-116 | Для реплики |
| Инструмент для репликации | VWR | 25395-380 | Для реплики |
| Микропульсер Электропоратор | Biorad | 1652100 | Для трансформации делящихся дрожжей |
| Кюветы для электропорации, зазор 0,2 см | Biorad | 1652086 | Для трансформации делящихся дрожжей |
| Термоамплификатор | Bioer | BYQ6078 | для термоядерной ПЦР-реакции |
Ссылки
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
