Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Альтернативный подход к изучению основных событий в нейродегенеративные, используя срезы мозга крысы Ex Vivo

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57507

⸱

11 апреля 2018 г.

 ,  , 
1Neuro-Bio Ltd, Building F5, Culham Science Centre

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем метод, который может обеспечить дальнейшее понимание в начале события, лежащие в основе нейродегенеративные и на основании установленных экс vivo мозга технику, сочетая преимущества в vivo и in vitro экспериментов. Кроме того он представляет собой уникальную возможность для прямого сравнения обработанных и необработанных группы в той же анатомические плоскости.

Аннотация

Несмотря на многочисленные исследования, которые пытаются разрабатывать надежные Животные модели, которая отражает основной обрабатывает базовый нейродегенеративные очень немногие были широко приняты. Здесь, мы предлагаем новую процедуру адаптировано из известных ex vivo мозга ломтик метод, который предлагает ближе в естественных условиях-как сценарий чем в vitro препараты, для расследования раннего события, вызывая дегенерации клеток, как наблюдается при болезни Альцгеймера (AD). Этот вариант состоит из простых и легко воспроизводимые шаги, позволяющие сохранение анатомические cytoarchitecture области выбранной мозга и его местные функциональность в физиологических условиях. Различных анатомических областей можно получить от же мозга, предоставляя возможность выполнить несколько экспериментов с лечения в вопросе в сайт, доза и время зависимых манере. Потенциальные ограничения, которые могут повлиять на результаты, связанные с этой методологии относятся к сохранению ткани, т.е. поддержание ее анатомической целостности во время нарезки и инкубации шаги и толщина среза, который могут влиять на биохимические и иммуногистохимической анализ. Этот подход может применяться для различных целей, таких как изучение молекулярных механизмов, участвующих в физиологических и патологических условий, наркотиков скрининг или анализов доза ответ. Наконец этот протокол может также уменьшить количество животных, используемых в поведенческих исследований. Приложение, сообщили здесь недавно описал и испытаны в первый раз на мозг ex vivo крыса фрагменты, содержащие базальной переднего (BF), который является одним из мозгового регионов, наиболее пострадавших в AD. В частности было продемонстрировано, что администрация токсичных пептид, производный от C-конечная ацетилхолинэстеразы (АВО) может побудить AD-как профиль, запуска, Антеро задней оси BF, дифференциальной выражение белки, изменены в AD, таких как alpha7 никотиновых рецепторов (α7-nAChR), фосфорилированных Тау (p Тау) и бета амилоида (значения).

Введение

Объявление является хронической патологии характеризуется постепенным нейродегенеративных обесценения, затрагивающих различные мозга областях, таких как entorhinal коры (EC), BF, гиппокамп (HC) и обонятельные луковицы (OB)1,2,3, 4,5. На поздней стадии развития AD привести к прогрессивным когнитивными, делая это заболевание наиболее распространенной формой слабоумия, приходится приблизительно 70% всех случаев6. Несмотря на обширные попытки понять на начальных этапах, вызывая AD не является в настоящее время определенных экспериментальной индикация, выяснения их. Кроме того все больше и больше под сомнение наиболее популярная теория - «амилоида гипотеза» - так как он не обеспечивает полного профиля в объяснении AD pathobiology, ни фармацевтических целевой объект, который оказался эффективным7,8 ,9.

Альтернативная теория, которой уделяется все большее внимание свидетельствует о том, что первоначальные механизмы, происходящих во время нейродегенеративные связаны к кластеру нейрональных главным образом подвержены в AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. Этот гетерогенных сотовой концентратор, охватываются BF, среднего мозга и ствола мозга, проекты для нескольких областей, таких, как ЕК, HC и OB15,16. Несмотря на многообразие в нейрональных морфологии и синтеза нейромедиаторов это ядро клетки акций общей чертой выразить боль, которая может также иметь неферментативного функция17,18. Эта неклассических роль как Роман сигнальные молекулы опосредует потока кальция (Ca2 +) в нейроны, которые могут пройти трофических или токсичных события по отношению к Ca2 + дозы, доступность и нейрональных возраст17,18 , 19.

Во время нейродегенеративные наблюдается потеря сотовой могут быть таким образом связаны этой неферментативного функция17,18,20, который присваивается 30mer пептид (T30) расщепляется от боль-C-terminus 20. с учетом предыдущих результатов, на культуры клеток и оптических изображений препаратов21 18,, мы продемонстрировали, через новаторский подход, основанный на мозг ex vivo крыса ломтиками, содержащий BF структуры, которые T30 AD-как профиль22. Конкретно эта новая методология предлагает более физиологических сценарий чем культуры клеток, так как он поддерживает многие из характеристик неповрежденной ткани, начиная от анатомических сохранение схемы, хотя для окно времени часов. Мы применили этот протокол для изучения событий, происходящих на ранних этапах нейродегенеративные, мониторинг острой реакции после T30 приложения.

Несмотря на большое количество литературы по использованию мозга ломтики расследовать молекулярные пути подразумевается в нейрональных ущерб или нейрогенез23,24, этот протокол обеспечивает в первый раз более непосредственный и чувствительных, зачитывает по сравнению для общего пользования organotypic ломтиками. Однако как и в случае для organotypic участков мозга, эта процедура острый срез могут также быть приняты для нескольких целей, например для оценки нейропротекторной или нейротоксическое молекул, обнаружение первичных молекулярных изменений, происходящих в рамках определенного процесса, Иммуногистохимический анализ и фармакологических проб для центральной нервной системы, связанных патологий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных были выполнены согласно утвержденных протоколов.

Примечание: В этом разделе, последовательность основных этапов выполняется во время экспериментальной процедуры и предлагаемые временной интервал предоставляется (рис. 1). Кроме того пошаговое описание протокола дополняется иллюстративный группа, показаны важные действия, начиная от удаления мозга гомогенизацией тканей после инкубационного периода (рис. 2). Подробности относительно материалы и инструкции для создания аппарата и последующего этапа для анализа Всемирного банка являются ранее описанных22.

1. хирургические инструменты, Vibratome настройки и подготовки, лечение

Примечание: Выполните следующие шаги перед началом экспериментальной процедуры:

  1. Подготовка двух различных искусственных спинномозговой жидкости (aCSFs), один используется для нарезки мозга и другой для инкубации шаг как описано ранее29. Вкратце, рабочей концентрации (в ммоль) двух aCSFs предназначены для «нарезки» фаго: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1,2 кН2PO4и 10 глюкозы; 6.7 HEPES соли и 3,3 HEPES кислоты; pH: 7.1. Время для «запись» фаго: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 х2PO4и 10 глюкозы; pH: 7.1.
  2. Хорошо перемешать решения и затем положить на льду и кислородом нарезки фаго чтобы он холодная при удалении мозга и последующее вырезание. Храните при комнатной температуре (RT) и снабжения кислородом для записи фаго.
  3. Поместите инструменты под капотом диссекции для удаления обезглавливание и мозга, т.е., гильотина, хирургическое рассечение комплект (ножницы, пинцет, лезвия) и лопаткой.
  4. Настройка параметров vibratome, выбрав толшины (300 мкм в этом препарате) и частоту в 7 и скорость на 6. Вставьте в vibratome палату в соответствующие места и окружают его со льдом.
  5. Откройте клапан Карбоген (95% O2, 5% CO2) кислородом «нарезки» (ФАГО) при резании мозга. Выберите Минимальная скорость потока, вокруг 2 мл/мин.
  6. Возьмите два 15 мл пробирок подготовить условия для тестирования. Добавьте в одной тубе 10 мл только фаго «запись» (контрольная группа) и в других, 10 мл фаго «запись», обогащенный T30 в концентрации 2 мкм (обрабатываемой группы). Вихревой трубы и держать их на льду до их использования на этапе подготовки установки (раздел 3).

2. анестезия, добыча мозга и нарезки

Примечание: В этом исследовании, были использованы 9 дикого типа P14 самцов крыс Wistar. Мозг добыча и последующей нарезки представляют критической частью протокола после они должны быть быстро (в течение 10 мин) для того, чтобы предотвратить или по крайней мере замедлить процессы дегенерации ткани.

  1. Добавить 1,5 мл 100% w/w изофлюрановая на слой хлопка в камеру индукции, поместите животное внутри и закройте крышку. Подождите, пока животное находится глубоко под наркозом, подтверждающий отсутствие педали рефлекс и затем обезглавить животное с помощью гильотины.
  2. Держите голову животного в кастрюлю содержащие ледяной нарезки фаго на этапе удаления мозга (рисунок 2A -C).
  3. Надрезать кожу над черепа с хирургическое лезвие, а затем вырезать ножницами после средней линии, от задней части черепа и кпереди приступить до достижения кости выше OBs (рисунок 2A).
  4. Вытяните боков две стороны черепа с помощью пары щипцы для того, чтобы иметь доступ к мозга (рис. 2B). Вставить шпателем вентрально к мозгу, нежно выкопать его и держать его гидратированных в ледяной «нарезки» фаго примерно 5 минут (рис. 2 c).
  5. Распоряжаться мозга на фильтровальной бумаге и вырезать мозжечка с помощью лезвия (рис. 2D). Клей мозг вертикально на vibratome диск и вставить его в камере резания, заполнить его с ледяной «нарезки» фаго и кислорода (рис. 2е).
  6. Настройка интервала резки и продолжите мозга секционирование (Рисунок 2F). Соберите разделы, содержащие регионе интереса, таких как медиальной перегородки (МС), диагональная полоса Брока (DBB), и substantia innominata (Си), как описано выше22. Сверху вниз три ломтика содержат ростральной (R), средний (I) и хвостовой части (C) BF (рис. 2 g).
  7. Разделить вдоль средней линии каждой секции с небольшой ножницами, получение двух зеркальных hemislices (рис. 2 H), индивидуально в качестве управления и обработанного состояния на той же анатомические плоскости.
  8. Сохранить hemisections в зале vibratome на 5-10 мин, а затем передавать их с стеклянной пипетки в восходящей кастрюлю содержащие фаго записи. Держите на RT для примерно 30 минут для восстановления.
  9. Заполните, в то же время, три стеклянных флаконов с 3 мл записи фаго только (ранее подготовленных в шаге 1.6 для контрольной группы) и три флаконов с 3 мл фаго, обогащенный T30 (ранее подготовленных в шаге 1.6) для обрабатываемой группы.

3. Установка подготовки

  1. Передача hemisections в их соответствующих стеклянных флаконах (Рисунок 2I) для того, чтобы иметь три последовательных hemislices (включая ростральной, промежуточного и хвостового BF регион) для контрольной группы (зеленая рамка, Рисунок 2J) и их подбор партнеров для обрабатываемой группы (красная рамка, Рисунок 2J).
  2. Передача ткани мозга с двумя разными кистями, один для hemislices управления и другой для обработанных коллегами, с целью предотвращения загрязнения между условиями.
  3. Уплотнение каждого стекла флакона с соответствующими крышкой, представляя кислородом иглы (21G) (Рисунок 2J). Подключите основной трубку аппарата к источнику Карбоген (рис. 2 K). Доставить кислород hemislices на протяжении всего инкубационного периода с минимальным расходом 2 мл/мин для того, чтобы избежать любого движения ткани мозга и возможных механических повреждений во время эксперимента. Запуск 5 ч инкубации. Выполните пункты 3.1-3.3 в течение 5 мин.
    Примечание: Проверьте часто (каждые 15-20 мин) ли кислород поступает во все пробирки и что его поток не движется ткани от дна.

4. образец гомогенизации

  1. Остановить поток кислорода после инкубации и удалите все крышки из флаконов. Передача hemislices, с помощью правильной щетки в 1,5 мл пробирки, содержащие 250 мкл буфера lysis, поддержание трубы на льду (рис. 2 L). Сделать lysis буфера, смешать PBS 1 x с фосфатазы и протеазы ингибиторы коктейли как разводят в 1: 100, так и гомогенизации ткани с различными пестики для предотвращения загрязнения среди образцов. Выполните эти действия в течение 10-15 мин.
  2. Центрифуга для мозга lysate на 1000 x g 5 мин при 4 ° C. Передача супернатант в новые трубы и сохранить образцы в-80 ° C.

5. чтение концентрацию белка и Западный анализ помаркой

  1. Определить концентрацию белка каждого образца и впоследствии подготовиться Западный анализ помаркой как описано22аликвоты.
  2. Выполните статистический анализ, чтобы оценить эффекты лечения на выражении протеина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокола, представленные здесь указывает, что администрация токсичных пептид, T30, модулирует в зависимости от сайта выражение α7-nAChR, p-Тау и значения в разделах BF-содержащих (рис. 3A). Никотиновых рецепторов показывает значительное увеличение в ростральной лечение hemislice, по сравнению с его коллегой управления (срез 1, p = 0.0310) (рис. 3B), в то время как промежуточный фрагмент не свидетельствуют о каких-либо и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Основной аспект настоящего Протокола, на основе устоявшихся ex vivo мозга техника, позволяет синхронно протестировать два зеркальные hemislices, полученные из той же анатомические плоскости, мониторинг их ответ после применения конкретных условие (контроль или лечение); Это поэтому предлагает экспериментальная парадигма, как жестко контролируется как можно скорее. Возможность оценки в времени, дозы и различные neurochemicals участкам образом связанных с нейронов обесценения, как видно во время нейродегенеративны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют конкурирующих финансовых интересов. Сьюзан а. Гринфилд является основателем и президентом нейро-био Limited, частной компании, и проводит акции в компании. Emanuele Brai и Антонелла Cogoni являются сотрудниками ООО нейро-био.

Благодарности

Эта работа финансировалась нейро-био Ltd. Мы хотели бы поблагодарить д-р Джованни Ferrati и д-ром Серхио Ротондо (нейро-био) за их комментарии и советы по рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрия (NaCl)Sigma-Aldrich, ГерманияS7653Реагент для приготовления aCSF
Хлорид калия (KCl)Sigma-Aldrich, ГерманияP9333Реагент для приготовления aCSF
бикарбонат натрия (NaHCO3)Sigma-Aldrich, ГерманияS5761Реагент для приготовления aCSF
Сульфат магния гептагидрат (MgSO4 (7H2O))Sigma-Aldrich, Германия63138Реагент для приготовления акХСН
Калийфосфат одноосновной (KH2PO4)Sigma-Aldrich, ГерманияP5655Реагент для приготовления акХСН
Гепсовая сольSigma-Aldrich, ГерманияH7006Реагент для акХСН
Хепсовая кислотаSigma-Aldrich, ГерманияH3375Реагент для акХЧ
ГлюкозаSigma-Aldrich, ГерманияG7528Реагент для препарата aCSF
Дегидрат хлорида кальцияSigma-Aldrich, Германия223506Реагент для препарата aCSF
пептид T30Genosphere Biotechnologies, ФранцияИспытанный пептид на основе AChE Хирургический
набор для препарированияWorld Precision Instruments, СШАItem #: MOUSEKITШаг для удаления мозга
Хирургические лезвияSwann-Morton, ВеликобританияBS 2982Ступень удаления мозга
Фильтровальная бумагаFisher Scientific, США 11566873Подготовка мозга к нарезке
КлейПодготовка мозга к нарезке
VibratomeLeica, ГерманияVT1000 SЩетки
Обработка тканей
Кислородная канистраСекционирование и фаза инкубации
1x Фосфатный буферный раствор (PBS)Fisher Scientific, СШАBP2438-4Стадия гомогенизации
Ингибиторы фосфатазыFisher Scientific, США1284-1650Стадия гомогенизации
ингибиторы протеазыRoche complete PIC, США 4693116001Стадия гомогенизации
PestlesStarlab, UKI1415-5390Ступенчатая гомогенизация
Микроцентрифуга
Pierce 660 нм Анализ белкаThermo Scientific, США22660Концентрация белка
для нарезки

Ссылки

  1. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
  2. Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
  3. Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249(2016).
  4. Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
  5. Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
  6. Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
  7. Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
  8. De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
  9. Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
  10. Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
  11. Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
  12. Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10(2015).
  13. Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
  14. Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
  15. Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
  16. Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
  17. Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
  18. Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
  19. Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
  20. Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
  21. Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
  22. Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291(2017).
  23. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  24. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  25. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  26. Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
  27. Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
  28. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
  29. Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
  30. Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213(2017).
  31. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
  32. Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ex vivo
Альтернативный подход к изучению основных событий в нейродегенеративные, используя срезы мозга крысы Ex Vivo
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.