Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Desthiobiotin стрептавидина близость опосредованной очистки белков взаимодействующих РНК в клетки мезотелиомы

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57516

⸱

25 апреля 2018 г.

 , 
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

В этой статье

Краткое содержание

Desthiobiotin маркировка синтетических 25-нуклеотидов РНК oligo, который содержит элемент аденин-богатые люди (являются) мотив, позволяет конкретной привязки цитозольной являются связывающий белок.

Аннотация

В vitro РНК пулдаун до сих пор широко используется в первые шаги протоколов, направленных на выявление RNA-связывая протеинов, которые признают конкретных структур РНК и мотивы. В этом протоколе РНК пулдаун, коммерчески синтезированных РНК зонды помечены с измененной форме биотина, desthiobiotin, на станции 3' strand РНК, который обратимо связывается с стрептавидина и таким образом позволяет элюции белков под более физиологических условий. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Метод, описанный здесь может применяться для определения взаимодействия между известных РНК связывания белков и 25-нуклеотидов (nt) длиной РНК зонд содержащий последовательность интереса. Это полезно для завершения функциональная характеристика стабилизации или дестабилизирующих элементов, присутствующих в молекулы РНК с помощью пробирного вектор репортер.

Введение

Экспрессии генов и последний уровень продукта гена могут жестко регулируется, влияющие на стабильность мРНК и мРНК перевод курса1. Эти post-transcriptional механизмы регулирования оказывается через взаимодействие некодирующих РНК и/или RNA-связывая протеинов (ОДП) с Целевая мРНК. Обычно это 3' непереведенные регионе мРНК (3' УТР - принадлежащие некодирующих часть генома2), содержащий конкретные СНГ-регуляторных элементов (КРР), которые распознаются транс-действующих факторов, таких как Мирна или ОДП 3. наиболее изученных стран СНГ-элемент внутри 3' УТР, это аденин богатые элемент (являются) мотив, который распознается по конкретным AU-связывающих белков (AUBP) и, в свою очередь, индуцирует либо деградации мРНК/deadenylation (являются опосредованной распада) или мРНК стабилизации4.

Размер 3' УТР из calretinin мРНК (CALB2) является 573 bp длинные и содержит предполагаемый AUUUA пентамера, как предсказано, AREsite2, инструмент bioinformatic5. В соответствии с наличием разоблачало это мотив, pmirGLO вектор репортер пробирного продемонстрировал роль по стабилизации этого элемента в мРНК CALB26. Наконец, в пробирке РНК пулдаун была использована для выявления AUBP, которая стабилизирует calretinin мРНК через являются мотивом.

Поскольку все некодирующих RNAs взаимодействуют белки7, в пробирке РНК пулдаун является хорошим способом и assay первого выбора для определения РНК посредники для помощи в расшифровке молекулярных механизмов. В этом методе РНК пулдаун коммерчески синтезированных РНК зондами, которые были помечены с измененной форме биотин (desthiobiotin) в отеле terminus 3' стренги РНК, были использованы. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с граница РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Такие РНК прыгните белки являются этого eluted от магнитной бусины, запустить через гель SDS-PAGE 12%, переданы мембраны и исследован с различными антителами.

В процедуре очищения сродства стандартных стрептавидина биотин, суровых денатурации необходимые условия сорвать сильный необратимым биотин стрептавидина облигаций для элюировать связанных белков-8, который может привести к диссоциации белковых комплексов. В отличие от биотин desthiobiotin обратимо связывается с стрептавидина и конкурентоспособным перемещенных с буфферезированный раствор биотина, позволяя для нежный элюции белков и избежать изоляции естественно биотинилированным молекул9, Предполагая, что этот метод идеально подходит для изоляции родной белковых комплексов в родной условиях.

В vitro условий привязки и жесткости, которые определяются концентрации соли, восстановителей и стиральный порошок процент, должна быть близка к присутствующим в сотовой связи для того, чтобы определить значение true в естественных условиях взаимодействия. Обязательного условия выполнены здесь были ранее продемонстрированы как пригодные для идентификации HuR как AU-связывания белков10. Этот подход мог бы сэкономить время, поскольку оптимизация условий надлежащего привязки может быть длительным и сложным. Кроме того этот метод может использоваться в качестве отправной протокол для любого эксперимента РНК пулдаун и постепенно может быть оптимизирована путем изменения концентрации солей и моющих средств, изменив процент отведенного под глицерина и добавления других солей. Кроме того мы показали, что даже короткий 25-нуклеотидов РНК зонд укрывательство пентамера являются мотив могут быть использованы для демонстрации взаимодействия с конкретным AUBP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка цитозольной и ядерной белковые фракции

  1. Пластина АКК-МЕЗО-4 4 x 106 клеток в колбе культуры клеток T150, выращенных в RPMI - 1640 среднего дополнена 10% FBS, 1 x пенициллина/стрептомицина (100 x) и 2 мм L-глютамин (200 мм). Когда клетки достигают слияния 80-90% (~5-5.5 x 106 клеток), продолжите извлечение белков ядерной и цитозольной фракции.
    Примечание: Линия клетки АКК-МЕЗО-4 был получен от RIKEN Биоресурс центр11.
  2. Аспирационная среднего, мыть ячейки, добавив 15 мл ПБС, наклона пластины нежно несколько раз и аспирационная ПБС. Добавить 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубировать культуры настой при 37 ° C на 3 мин.
    Примечание: Посмотрите на клетки под микроскопом для отряда; Если по-прежнему придает крана колбу против ладони 3 раза.
  3. Добавление 7 мл среды RPMI 1640 с 10% FBS, 1 x пенициллина/стрептомицина (100 x) и 2 мм L-глютамин (200 мм), собирать клетки в 15 мл и спина вниз на 200 x g за 5 мин.
  4. Аспирационная среднего и Ресуспензируйте Пелле клеток с 1,5 мл ПБС, а затем перенесите клетки в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Спин вниз на 500 x g и 4 ° C для 5 минут удалить супернатант.
    Примечание: От этого шага выполните центрифугированием при температуре 4 ° C и держать все реагенты на льду.
  5. Ресуспензируйте клетки лепешка с ледяной 1,5 мл ПБС и спин вниз клетки на 500 x g и 4 ° C на 3 мин удалить супернатант.
    Примечание: Необходимое количество ССВ I, CER II и Нира реагенты являются 10, 0,55 и 5 томов оценкам клеток Пелле, Упакованные объем, соответственно; Следующий протокол предполагает объем 20 мкл. Мы рекомендуем подготовку только необходимое количество реагента CER я.
  6. Добавить 200 мкл Реагента ледяной цитоплазматических извлечения (CER я) дополнены 2 мкл 1 x ингибитора протеиназы, например, разбавьте 1 таблетка в 500 мкл воды для получения 100 x складе ингибитора протеазы (ЭДТА бесплатно). Это количество реагента CER я достаточно, чтобы лизировать 20 мкл ячейки Пелле Упакованные тома.
    1. Чтобы оценить объем ячейки Пелле Упакованные, Сравните трубка, содержащая ячейку гранулы с 1,5 мл трубки заполнены с 10, 20, 50 или 100 мкл ПБС.
  7. Ресуспензируйте клетки Пелле, энергично vortexing трубки для 15 s и инкубировать трубку на льду для 10 минут добавить 11 мкл Реагента II (CER II) ледяной цитоплазматических добычи на трубу, энергично Вортекс для 5 и s и инкубировать 1 мин на льду.
  8. Вихревой энергично для 5 s и центрифуги трубки на 16000 x g и 4 ° C за 5 мин передачи супернатант чистой предварительно охлажденные трубы на льду. Супернатант является цитоплазматических фракция, которая далее используется в эксперименте РНК пулдаун.
  9. Ресуспензируйте оставшиеся гранулы в 100 мкл Реагента ледяной ядерных экстракции (NER) дополнены 1 мкл ингибитора протеиназы (100 x), и энергично вихрь для 15 s. Мы рекомендуем, подготовка только необходимое количество реагента NER, дополняют ингибиторы протеазы.
  10. Проинкубируйте образцы на льду для 40 мин с случайные vortexing для 15 s (каждые 10 минут).
  11. Центрифуга трубку g 16000 x 10 мин передачи супернатант (это та доля ядерных белков) к чистой предварительно охлажденные трубы.
  12. Немедленно, измеряя концентрацию протеина, с помощью метода bicinchoninic (BCA) (см. Таблицу материалы). Для контроля за чистоту белка каждой фракции, выполняют immunoblotting (рис. 1) против α-тубулина (положительный обнаружения только в цитозольной фракции) и поли АДФ рибоза полимеразы - PARP (положительный обнаружения только в ядерных фракции). Для визуализации белка обратитесь к разделу 4.
  13. Для того, чтобы сохранить активность белков и их родного государства, готовить 25 мкл аликвоты цитозольной и ядерной экстрактов. Snap заморозить эти аликвоты, поместив их в жидком азоте для 5 s и хранить непосредственно в-80 ° C.

2. Маркировка РНК с Desthiobiotin

  1. Коммерчески синтезированных РНК зонды и очищенного ВЭЖХ. Ресуспензируйте свободной от нуклеиназы водой на 10 мкм.
    Примечание: В таблице 1перечислены последовательности зонд.
  2. Использование 50 пмоль РНК в РНК пулдаун реакции. Размораживание и держать все реагенты на льду за исключением для привязки 30%, используется для метки 3' конечной oligo РНК.
  3. Передача 5 мкл 10 мкм РНК зондов, помечены как CALB2 3' УТР (являются), CALB2 3' УТР (mtARE) и Unrelated-РНК (IRE), в 0,5 мл microcentrifuge тонкостенных труб и инкубировать в машину ПЦР на 85 ° C за 5 минут место трубы непосредственно на льду.
    Примечание: Этот шаг важен, как это способствует релаксации и доступности РНК зонда для маркировки.
  4. Для одной реакции 30 мкл, добавьте к пробке РНК содержащих следующие 10 мкл микс: 3 мкл нуклеиназы свободной воды, 3 мкл 10 x РНК лигаза реакции буфера, 1 мкл АБС битор РНКазы (40 U/мкл), 1 мкл Desthiobiotinylated Цитидин Бисфосфат (1 мм) и 2 мкл T4 РНК лигаза (20 U/мкл).
    Примечание: Для подготовки мастер смесь A 3 образцов в избытке (3.2), смешайте 9.6 мкл нуклеиназы свободной воды, 9,6 мкл 10 x РНК лигаза реакции буфера, 3.2 мкл АБС битор РНКазы (40 U/мкл), 3.2 мкл Desthiobiotinylated Цитидин Бисфосфат (1 мм) и 6.4 мкл T4 РНК лигаза (20 U/мкл).
  5. Добавьте тщательно 15 мкл привязки 30% к реакции. Используете другой Совет смешать реакции. Инкубировать реакции на ночь на 16 ° C.
  6. Следующий день, подготовьте следующее: 5 М NaCl (Фреш/нуклеиназы бесплатно), хлороформ: изоамилового спирта в 24:1 отношение (например, в реакции - 96 мкл хлороформе и 4 мкл изоамилового спирта), ледяной 100% этанола и ледяной 70% этиловом спирте.
  7. Мкл 70 нуклеиназы свободной воды в РНК маркировки труб реакции. 100 мкл хлороформ: изоамилового спирта и вихревой кратко. Спин вниз на 13 000 x g для 3 мин тщательно удалить только верхний этап и передачи новой свободной от нуклеиназы 1,5 мл трубки; не прикасайтесь к нижней фазе.
  8. 10 мкл 5 М NaCl, 1 мкл гликогена и 300 мкл ледяной 100% этанола. Поместите трубку при-20 ° C на 2 ч.
    Примечание: На данном этапе эксперимента может быть продолжено на следующий день.
  9. Центрифуга на 13000 x g и 4 ° C на 15 мин тщательно отбросить супернатант не нарушая гранулы. Добавьте 300 мкл ледяной 70% этанола и центрифуги снова на 13 000 x g и 4 ° C за 5 мин.
  10. Полностью удалить супернатант и просушите Пелле (15 мин). Ресуспензируйте гранулы в 20 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
    Примечание: Перейти с РНК выпадающих в тот же день.
  11. Инкубировать РНК на 90 ° C на 2 мин и место на льду. Место маркированы РНК на льду во время следующего шага предварительной стирки стрептавидина магнитные бусы.
    Примечание: Длительное время инкубации может привести к повреждению зонда РНК.

3. РНК белок пулдаун

  1. Предварительной стирки стрептавидина магнитные бусы и инкубации с desthiobiotin РНК
    1. Используйте 50 мкл стрептавидина магнитные шарики за 50 пмоль РНК. Однако это должны быть оптимизированы в зависимости от эксперимента.
    2. Вихревой трубе с стрептавидина магнитные шарики для 15 s и быстро удалить 200 мкл (микс Мастер; достаточно для реакций 3 + 1) в чистой 1,5 мл трубки Сейф блокировки, используя вырезать наконечники. Место трубки на магнитную подставку, так что бусины собирать на стороне трубки и ждать 1 мин удалить жидкость ресуспендирования.
    3. Мыть бисер, извлеките трубку из магнитного стенд, 400 мкл 0,1 М NaOH, раствор 0,05 М NaCl и аккуратно накапайте вверх и вниз несколько раз. Установите трубку обратно на магнитного стенд. Подождите 1 мин и собирать супернатант. Повторите этот шаг.
    4. Вымойте бусины с 200 мкл, 100 мм NaCl. Удалите супернатант.
    5. 200 мкл 20 мм трис (рН 7,5), Ресуспензируйте бусы, дозирование, поместите трубку на магнитную подставку, ждать 1 мин и удалить супернатант. Повторите шаг.
    6. Снять трубку из магнитного стенд, 200 мкл 1 x буфера записи РНК и Ресуспензируйте стрептавидина магнитные бусы, кратко vortexing. Удаление 50 мкл стрептавидина магнитные бусы и добавить в каждую пробирку помечены РНК, используя кончик отрезока пипеткой. Инкубируйте трубы для 30 мин при комнатной температуре на ролик.
  2. Связывание белка РНК
    1. Уложите трубки магнитного стенд, подождите 1 мин и удалить супернатант.
    2. Добавьте 50 мкл 20 мм трис (рН 7,5) бисер и Ресуспензируйте, закупорить. Уложите трубки магнитного стенд, подождите 1 мин и удалить супернатант. Повторите этот шаг.
    3. 100 мкл 1 x буфер связывания белка-РНК к бисеру и Ресуспензируйте, закупорить.
    4. В то же время, приготовить следующую смесь: 10 мкл 10 x буфер связывания белка-РНК, 30 мкл 50% глицерина, 50 мкг цитоплазматических белков и свободной от нуклеиназы воды до 100 мкл.
      Примечание: Подготовьте мастер смесь B 3 образцов в избытке (3.3) следующим: 33 мкл 10 x буфер связывания белка-РНК, 99 мкл 50% глицерина, 165 мкг цитоплазматических белков и свободной от нуклеиназы воды до 330 мкл. Держите трубку мастер смесь B на льду.
    5. Уложите трубки магнитного стенд, подождите 1 мин и собирать супернатант. 100 мкл мастер смесь B, Ресуспензируйте, нежно закупорить вверх и вниз и избежать создания пузыри. Инкубируйте реакции трубы для 60 мин при температуре 4 ° C на ролике.
  3. Мытье и элюции
    1. Уложите трубки магнитного стенд, собирать супернатанта, (который является поток через - FT) и передачи в новой трубки.
      Примечание: Держите этот FT на льду для последующего анализа.
    2. Пипетка 100 мкл 1 x мыть буфера на бусы, нежно ресуспензируйте, положил обратно в магнитного стенд, подождите 1 мин и удалить супернатант. Повторите этот шаг 2 раза.
    3. 40 мкл буфера для магнитной бусины, смешивать, закупорить вверх и вниз и инкубировать при 37 ° C на трубку шейкер (950 об/мин) за 30 мин.
    4. Уложите трубки магнитного стенд, подождите 1 мин и собирать eluted образца (который элюата - E). Место на льду и использовать для анализа ниже по течению.
      Примечание: На этот шаг, каждый протестированных зонд РНК состоит из потока через (FT) и образец элюата (E).

4. Полиакриламид электрофореза и западной помарки анализ

Примечание: См. таблицу 2 для рецептов для буферов, используемых в этом разделе. Выполните Вестерн блот по Лэмли метод12.

  1. Handcast гелях SDS-PAGE 12% (10-Уэллс, 1,5 мм распорка, 66 мкл). Подготовка смесь работает гель: 4 мл 30% акриламида bisacrylamide раствор, 2,4 мл Нижняя трис буфера, 3,2 мл dH2O, 9,6 мкл TEMED, 96 мкл раствора 10% Аммония пероксодисульфат (APS). Подготовка укладка гель микс: 3.25 мл dH2O, 0,5 мл 30% акриламида - bisacrylamide раствор, 1,3 мл буфера Tris верхняя, 10 мкл TEMED, 20 мкл 10% APS.
  2. 16.6 мкл 6 x Laemmli буфера (например, 14 мл трис/HCl/SDS рН 6,8 (верхняя трис-буфер), 2 g SDS, 1,86 г DTT, 6 мл глицерина и 0,012% бромфеноловый синий; температуре-20 ° C) в образце FT и 6,6 мкл 6 x Laemmli буфера в E образца. Проинкубируйте образцы для 5 мин при 95 ° C.
  3. Загрузить образцы (20 мкл FT и целом элюировать ~ 40 мкл) и запускать их на 30 мин при 60 V, продолжая 20 V на ночь.
  4. С помощью системы полусухое electroblotting, передача белков на мембраны PVDF для 80 мин 15 V.
    Примечание: PVDF мембрану должны быть активированы перед выполнением переноса белка. Проинкубируйте мембрану в 100% метанола за 1 мин, после 2 минут инкубации в ультрачистая вода.
  5. После передачи белка Проинкубируйте гель SDS-PAGE с Кумасси решение для 3 h, следуют три шага стирки с ультрачистая вода, каждый 30 мин.
  6. В конце передачи белка пусть PVDF мембрану сухой за 1 ч. возобновить мембраны, как указано в шаге 4.5. Блокировать мембраны 1 час с 5% BSA в 1 x TTBS.
  7. Проинкубируйте мембрану с первым антителом: ГУР или mesothelin, оба разводят 1: 1000 в 5% BSA в 1 x TTBS за 4 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
  8. Промойте мембрану три раза за 7 мин в 1 x TTBS и проинкубируйте с кролик борьбе мыши пероксидазы (ПХ)-конъюгированных вторичное антитело разбавленный мэм в 5% BSA, 1 x TTBS.
  9. Визуализируйте белков с помощью увеличенная хемолюминесценция и цифровой томограф.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом эксперименте был использован фрагмент длиной 25-nt calretinin 3' УТР укрывательстве являются мотив (CALB2 3' УТР (являются) 25-nt) для проверки, является ли он связывает специально для человека антиген R (ГУР) белка, известного мРНК стабилизатор. Для тестирования специфика являются элементом, 25-nt РНК зонд CALB2 3' УТР (mtARE) содержащий мутации являются мотив, который ранее был показан отменить эффект стабилизации есть мотив, был используется6. Третий РНК ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

3' необычных принадлежат некодирующих генома3, и все некодирующих РНК может взаимодействовать с белками для того чтобы приложить их функции7. Когда генома млекопитающих было установлено pervasively транскрипции и производится значительная часть длиной некодирующих RNAs16, новые свидетельства продемонстрировали, что эти длинные некодирующей RNAs функционировать в регуляции экспрессии генов, как они взаимодействуют с Хроматин Ремоделирование комплексы<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Швейцарский Национальный фонд Синергия науки Грант CRSII3 147697, Stiftung für Krebsforschung изображения и Цюрих Krebsliga.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NE-PER Набор для ядерной и цитоплазматической экстракцииThermo Fisher Scientific 78833
Таблетки ингибитора протеазы Пирса, без ЭДТАThermo Fisher ScientificA32965
Набор для анализа белка BCA ПирсаThermo Fisher Scientific23225
Набор для вытягивания магнитной РНК-белка Пирс Thermo Fisher Scientific20164В комплекте магнитные бусины и поэтому набор нужно хранить при температуре 4&�С; C
Пирс РНК 3' Набор для конечного дестиобиотинилирования Thermo Fisher Scientific20163Набор является частью "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" и должен храниться при температуре -20 °°; C в отличие от выдвижного комплекта (4 ° В).
DynaMag-2,  магнитная подставкаThermo Fisher Scientific12321D
Anti - HuR (MOUSE) моноклональное антителоThermo FisherScientific-Антителовходит в состав Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  - 1:1000 в 5% BSA 1x TTBS - кролик против мыши вторичное антитело 1:10,000 в 5% BSA 1x TTBS
Anti- α - тубулин (МЫШЬ) моноклональное антителоSanta Cruz80351:1000 в 5% BSA 1x TTBS - вторичное антитело против мыши кролика 1:10 000 в 5% BSA 1x TTBS
Anti - PARP (RABBIT) Поликлональное антителоCell Signaling95421:1000 в 5% BSA 1x TTBS - козье вторичное антитело против кролика 1:10 000 в 5% BSA 1x TTBS
Анти - мезотелин (мышиный) моноклональное антитело Rockland200-301-A87
Вторичное антитело козы против кроликаCell Signaling7074
Вторичное антитело против мышикролика Sigma-AldrichA-9044
RPMI - 1640 среднийSigma-AldrichR8758
FBS - Фильтрованная сыворотка крупного рогатого скотаPan Biotech P40-37500
Пенициллин - стрептомицин (100x)Sigma-Aldrich P4333
L-раствор глютамина (200 мМ)Sigma-Aldrich G7513
0,25% трипсин-ЭДТА (1x)Gibco от Life technologies 25200-056
Mini-PROTEAN 3-клеточныйBio-Rad1653301
Mini Protean System стеклянные пластины Bio-Rad1653308
Mini-PROTEAN Дистанционные пластины со встроенной прокладкой 1,5 ммBio-Rad1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-луночный, 1,5 мм, 66 &; LBio-RAD1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Литейные модулиBio-RAD1658050
РНКазе Раствор для обеззараживания РНКазыThermo Fisher ScientificAM9780
Rotiphorese gel 30 - водный 30% акриламид и бисакриламид стоковый раствор в соотношении 37,5:1Roth3029
20% SDS Транспортная мембрана PanReac AppliChemA3942
PVDF Perkin ElmerNEF1002Необходимо активировать путем инкубации в чистом метаноле в течение 1 мин с последующей промывкой в воде в течение 2 мин&nbл;
Полусухая передаточная ячейка Trans-Blot SD Bio-Rad1703940
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
FusionFX  Цифровой имиджерVilber-
РНК олигосинтезаMycrosynth AG, Швейцария-масштаб синтеза - 0,04 мкм; моль - ВЭЖХ очищенный
бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7030
Соляная кислота (HCl) 6 MPanReac AppliChem182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5 Thermo Fisher Scientific15567027
глицерин Thermo Fisher Scientific1790450% стерильные аликвоты для хранения при -20°С; C
Пирс Стрептавидин магнитные бусины Thermo Fisher Scientific88817Обратите внимание, что эти магнитные шарики имеют средний диаметр 1 & микро; м (диапазон от 0,5 до 1,5 &; m). Кроме того, Dynabeads-M280 Streptavidin, которые представляют собой гранулы гомогенного размера 2,8 &; m, также используются в РНК-pulldown, но имейте в виду, что это может повлиять на процесс очистки.
TEMEDSigma-AldrichT9281
Персульфат аммония Sigma-AldrichA3678
Coomassie G-250ApplichemA3480
Алюминийсульфат-(14-18)-гидрат Сигма-Олдрич368458
ортофосфорная кислота АпплименемA0637

Ссылки

  1. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  2. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
  3. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
  4. von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
  5. Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
  6. Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
  7. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
  8. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
  9. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  10. Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
  11. Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  13. Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
  14. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
  15. Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
  16. Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
  17. Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
  18. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
  19. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Desthiobiotin стрептавидина близость опосредованной очистки белков взаимодействующих РНК в клетки мезотелиомы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.