Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Инъекции Retroductal наночастиц в мышиных подчелюстной железы

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57521

⸱

3 мая 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, University of Rochester Medical Center, 3Center for Oral Biology, University of Rochester Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Доставка местных лекарств в подчелюстной желез представляет интерес в понимании слюнных желез биологии и для развития новых терапевтических средств. Мы представляем обновленную и подробную retroductal инъекции протокол, призванных повысить точность доставки и экспериментальной воспроизводимость. Представленное здесь приложение является поставка полимерных наночастиц.

Аннотация

Две общие цели терапии слюнной железы являются профилактика и лечение дисфункции ткани после либо аутоиммунных или радиационной травмы. Локально поставляя биологически активных соединений в слюнных желез, большей концентрации в тканях можно безопасно достичь против системного администрирования. Кроме того от ткани-мишени эффекты от экстра железистой накопление материала могут быть значительно сокращены. В этой связи retroductal инъекции является широко используемый метод для исследования слюнных желез биологии и патофизиологии. Администрация Retroductal факторов роста, Главные ячейки, аденовирусных векторов и малые молекулы наркотиков было показано для поддержки функции железы в месте травмы. Ранее мы показали эффективность стратегии наночастиц siRNA retroductally вводят для поддержания функции железы после облучения. Здесь, подробно высокоэффективным и воспроизводимый метод для администрирования наноматериалов в мышиных подчелюстной железы через проток Wharton (рис. 1). Мы опишем доступ к ротовой полости и наметить шаги, необходимые для cannulate Wharton протока, с дальнейших наблюдений, выступающей в качестве проверки качества на протяжении всей процедуры.

Введение

Слюнные железы дисфункция имеет много этиологии, включая Шёгрен синдром, аутоиммунных опосредованной потери функциональных секреторной ткани, и индуцированного излучения гипосаливация (Рог), общей sequella лучевой терапии рака головы и шеи1. Потеря функции слюнных вследствие либо условие предрасполагает лица устные и системные инфекции, кариес, пищеварения и глотанием дисфункция, нарушение речи и депрессия1,2,3. В результате качество жизни значительно страдает, с мероприятиями, ограничиваясь временное облегчение симптомов, а не лечения4. Расследовать Роман терапии в естественных условиях, она представляет интерес для администрирования биоактивных соединений непосредственно на слюнные железы.

Retroductal инъекции является ценным методом доставить биологически активных соединений непосредственно в слюнных желез и проверить эффективность в болезни, травмы, или под нормальной ткани гомеостаза. Три основных слюнных желез являются околоушной (PG), подчелюстной (SMG) и сублингвально (SLG), все из которых пустым в полости через выделительную воздуховодов. Анатомия мышиных SMG разрешает прямой доступ через катетеризации Wharton протока, расположенный в полу рот под язык5. После катетеризации, сольватированного препараты можно применять непосредственно SMG. После родов retroductal, экстра железистой диффузии ограничивается окружающие ткани капсулу, которая регулирует обмен материала с окружающими структуры6. SMG и ее протоков аналогичным образом структурированы в организме человека и регулярно осуществляется во время SMG хирургии и sialoendoscopy7. В организме человека и мышей PG также доступен через Stensen в воздуховод в слизистой8.

В мышиных моделях Рог SMG retroductal инъекции был использован для доставки терапии, включая факторы роста, Главные ячейки, аденовирусных векторов, цитокинов и Антиоксидантная соединений модулировать клеточный ответ на травмы, и уменьшить полученный ткани ущерб5,9,10,11,12,13,14,,1516. Наиболее заметным клинический успех retroductal инъекции является администрация аденовирусных вектора прямого выражения воды канала (Аквапорин 1; AQP1) у больных после радиации для головы и шеи рак17.

Ранее мы разработали и показана эффективность retroductally вводят полимерные наночастиц siRNA системы защиты слюнной железы от Рог-11,-18,-19,-20. Как расширение нашей прошлой работы здесь, мы демонстрируем, что наш протокол для retroductal SMG инъекций с использованием дневно обозначенные наночастиц (NP), способный погрузки и доставки иначе слаборастворимых лекарств21,22, 23.

Мы синтезированных NP из сополимера диблок состоит из поли (alt Стиролмалеиновый anhydride)-b-poly(styrene) (КСМК) путем полимеризации реверсивные добавлением цепи фрагментации (РАФТ), как описано ранее,21. Через обмен растворителей эти полимеры спонтанно самостоятельно собрать в структуры NP мицеллы с гидрофобным интерьера и гидрофильные наружных21. NPs помечены Техас-красный Флюорофор разрешить проверку NP доставки в желез без ущерба для животного. Живут животных изображений и SMG иммуногистохимия показано на 1 час и 1 день после инъекции.

Это обновление и воспроизводимые катетеризации протокол должен позволить другим для достижения retroductal инъекции. Мы ожидаем, что эта изысканная техника станет критическим в vivo исследований и лечебных развития24,25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры в естественных условиях , изложенных ниже были утверждены Комитетом университета по ресурсам животных в Университете Рочестер, Рочестер, Нью-Йорк.

1. Подготовка

  1. С помощью трубы 32G внутричерепных катетер с вставкой проволоки, резать трубы сформировать срезанный конец, примерно в 45° к оси длиной 3 см. Убедитесь, что провод по крайней мере 1 см длиннее, чем трубки.
  2. Загрузите 50 мкл раствора КСМК наночастиц (рис. 1), или другого инъекционного материала, в шприц Гамильтон. Чтобы уменьшить вероятность баротравмы во время инъекции, присоединить трубки катетера, стилет, удалены, шприц и высылать мертвого объема.
  3. Осмотрите инъекционного раствора, чтобы убедиться, что наночастицы является полностью сольватированного для предотвращения протоковой непроходимость после администрации.
  4. Готовят раствор атропина в 0,1 мг/мл.
    Примечание: Потому что атропин светочувствительных и ухудшается со временем, это решение следует день инъекции и защищать от света до тех пор, пока Управление.

2. доступ и визуализации протоковой точка входа

  1. Взвешивание мышей C57/BL6, используя аналитический баланс.
  2. С помощью 0,5 мл шприц с иглой сметы x ½", анестезировать мышей с внутрибрюшинно вводили стерильным физиологическим раствором Ксилазина кетамина и 10 мг/кг 100 мг/кг. Перейти к следующему шагу, когда мышь, больше не реагирует на раздражители, которое обычно происходит в течение 5-10 мин после инъекции.
    Примечание: Эта процедура также может быть выполнена под изофлюрановая, но потребует пользовательских носовой конус, что позволяет доступ к ротовой полости.
  3. Чтобы предотвратить сухость во время процедуры, смазать глаза и поместите курсор мыши в лежачем положении на пользовательских сцене.
    Примечание: Для поддержания надлежащих условий для интраоральных процедуры, должны быть вылечен или стерилизовать перед каждым использованием инструменты.
  4. Откройте ротовой полости, обеспечение верхнечелюстной резцов на металлические балки и использовать резинкой, чтобы применить к снижению напряженности за нижней челюсти резцов (рисунок 2A).
  5. Выровняйте мышь под микроскопом рассечения, таким образом, что база челюсть визуализируется.
  6. Чтобы расширить рот, используйте обычай, изогнутых стальных втягивающего подать напряжение на двусторонней основе к слизистой.
  7. Чтобы визуализировать подчелюстной сосочков, понять и осторожно поднимите язык со дна полости рта с помощью тупого щипцами.
    Примечание: Сосочков будет отображаться как два бледно выступа под язык (рис. 2B).
  8. Для облегчения визуализации и дальнейшие манипуляции в полости рта, место хлопок между языком и слизистой.

3. протоковой катетеризации и размещение строки

  1. С помощью тонкой, изогнутый пинцет, понять трубки катетера с вставкой провода. Для оптимального ручного управления при катетеризации Выровняйте трубы с кривизной щипцы (рис. 3A).
  2. С использованием рассечения микроскопа, переместите щипцы и проволока в поле зрения.
    Примечание: Проволока должна торчащий из труб.
  3. Осторожно приложите давление в базу одного подчелюстной сосочка, используя провод вставкой производить небольшие, поверхностный, слизистых оболочек прокол (диаметром 0,076 мм) которая будет способствовать позднее запись трубки катетера (диаметром 0,25 мм). Если сопротивление, разрежьте свежий скошенный советы на трубы и проволока врезные рассечения острыми ножницами.
  4. После вступления снять стилет и с использованием рассечения микроскопа, подтверждают наличие слюны на сайте проколам. Избегайте насильственной или внезапного движения стилет, которые могут вызвать кровотечение или протоковой целостности (снятие или вставки).
  5. Убрать стилет внутри трубки (рис. 3B).
  6. Чтобы гарантировать, что трубки впрыска впишется в Wharton протока открытия, вставьте трубки, содержащие стилет как жесткой руководство в ранее сделанные пункция (рис. 2 C).
    Примечание: Если не выполняется быстро, местный отек может воспрепятствовать повторной вставки.
  7. Для предотвращения обратного давления от длительного протоковой обструкции, снять трубку. Проверьте, чтобы убедиться, что отверстие, видимые при микроскопии, можно увидеть в подчелюстной сосочка. Если видимые кровотечении, удалите стилет и повторить от шага 3.2 на сопротивляясь подчелюстной сосочков.
  8. Без перемещения мыши, администрировать внутрибрюшинной инъекции раствора атропина 1 мг/кг, для уменьшения слюноотделения во время процедуры. Подождите 5-10 мин.
  9. Возьмите конец трубки шприц и вставьте в отверстия с использованием рассечения микроскопа (рис. 3 c). Если сопротивление, разрежьте свежий срезанный конец трубы и повторная.
  10. После трубки в месте в подчелюстной сосочка, медленно заранее 3-5 мм в воздуховоде. Выпуск труб из щипцов.
  11. Чтобы улучшить уплотнение между труб и подчелюстной сосочка, насухо интерфейс нежно промокательной марлей за 1 мин.
  12. Проверьте, чтобы подтвердить, что позиция труб не сместился во время сушки.

4. инъекции

  1. Инъекционные материалы со скоростью 10 мкл/мин проверить, чтобы подтвердить, что указатель мыши остается седативных и не проявляет признаки бедствия (Рисунок 2D).
    Примечание: Инъекции 15-50 мкл, хорошо переносится. Введения больших объемах может привести к баротравмы.
  2. После инъекции поддерживайте давление шприц для 5 мин для улучшения удержания материала в Wharton протока и SMG (рис. 4). Осмотрите подчелюстной сосочка периодически для того, чтобы обеспечить, что трубы не выйти из отверстия протока.
  3. С помощью тонкой щипцы, понять и мягко снять трубку от подчелюстной сосочков.
    Примечание: Это нормально, чтобы наблюдать некоторые жидкости выхода из сосочки.
  4. Удаление втягивающего устройства и хлопок из ротовой полости перед перемещением мыши от стадии.
    Примечание: Животное не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Кроме того убедитесь, что мышь не размещается с других мышей, до тех пор, пока полностью выздоровел.

5. Проверка и анализ

Примечание: в vivo Imaging системы (ИВИС) может использоваться для оценки удержания дневно обозначенные наночастиц после инъекции (как показано на рисунке 1 час и 24 ч после инъекции на рис. 5).

  1. Чтобы лучше визуализировать флуоресцентного сигнала в пределах SMG через кожу, удалите вентральной меха, обволакивающие СМГС либо бритье или с помощью химической депиляции.
    Примечание: После эвтаназии, SMG ткани также могут быть собраны, фиксированной (ночевка в параформальдегида 4%) и витражи, с помощью иммуногистохимия для подтверждения сохранения дневно обозначенные NP один день после инъекции (рис. 6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Retroductal инъекция может использоваться для администрирования сети для мышиных SMG (рис. 1). Здесь мы поставляем 50 мкг КСМК NPs, помечены красной Техас Флюорофор.

Правильное размещение мыши позволяет легким доступом и визуализации слово рта (рисунок 2A-B). Подчелюстные сосочков определяются как два мясистые выступа под язык. После катетеризации (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Retroductal инъекций имеет решающее значение для локализованных лекарств в слюнные железы. Эта техника имеет применения в скрининг терапевтических агентов для условий, включая Шегрена и Рог9,10,28. Прямая лекарств в SMG через retroductal инъекция обеспечивает ключевое преимущество над системного администрирования в свой потенциал для уменьшения пробить эффектов, в том числе иммунной активации11. Возможнос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Исследования в этой публикации было поддержано Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследований (NIDCR) и национального института рака (NCI) национальных институтов здравоохранения под награду номер R56 DE025098, UG3 DE027695 и F30 CA206296. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. Эта работа была также поддержана NSF DMR 1206219 и получила инновации в устной Уход награды (2016).

Мы хотели бы поблагодарить за помощь в выполнении экспериментов ИВИС Джейн Gavrity. Мы хотели бы поблагодарить Карен Bentley за ее вклад и помощь в выполнении EM. Мы хотели бы поблагодарить за его помощь в ИХС Weng Пей-Lun. Мы хотели бы поблагодарить Мэтью Ingalls за его помощь в подготовке рис. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Элейн Smolock и Эмили Ву для критических чтении этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пилокарпина гидрохлоридSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Весенние ножницыFine Science Tools91500-9Пружинные ножницы для трахеостомы
Стерильный солевой раствор MedlineRDI30296Hфизраствор
Dumont #7 ЩипцыFine Science Tools11274-20Изогнутые щипцы
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-10Прямые щипцы
стандартного шаблона ЩипцыFine Science Tools11000-12Тупые щипцы
Тонкие ножницы - карбид вольфрамаFine Science Tools14568-09Ножницы для рассечения
Микрогематокрит Гепаринизированные капиллярные трубкиFisher Scientific22362566капиллярные трубки
Смазка глазная мазьRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat поликлональный анти-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Антитело
DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Статистическое программное обеспечение
Аппликатор с ватным наконечникомMedlineMDS202000Аппликатор для глазной мази
0,5cc Инсулиновый шприц, 29G x 1/2"BD7629Шприц для внутрибрюшинного введения

Ссылки

  1. Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management. International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).
  2. Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies. Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).
  3. Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life. Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).
  4. Vissink, A., et al. Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).
  5. Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).
  6. Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).
  7. Beahm, D. D., et al. Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature. International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).
  8. Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands. Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).
  9. Zheng, C., et al. Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands. Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).
  10. Okazaki, Y., et al. Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor. Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).
  13. Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).
  14. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).
  15. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  16. Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation. Cancer Research. , (2016).
  17. Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).
  18. Arany, S., et al. Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).
  19. Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1. Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).
  20. Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System. ACS Nano. , (2017).
  21. Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells. Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).
  22. Wang, Y., et al. Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing. ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).
  23. Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).
  24. Kuriki, Y., et al. Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct. Journal of Visualized Experiments. (51), e3074(2011).
  25. Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
  26. Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing. Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).
  27. Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts. Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).
  28. Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. IL17: potential therapeutic target in Sjogren's syndrome using adenovirus-mediated gene transfer. Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo
Инъекции Retroductal наночастиц в мышиных подчелюстной железы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.