Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиных слюнных функциональной оценки через после стимуляции пилокарпин фракционированный излучения

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57522

⸱

4 мая 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Otolaryngology, University of Rochester Medical Center, 3Center for Oral Biology, University of Rochester Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем детальный подход к выполнению сбора слюны, включая мышиных трахеостомические и изоляции трех основных слюнных желез.

Аннотация

Гипосаливация обычно наблюдается в аутоиммунные реакции Шёгрен синдром или следующие травмы излучения в больших слюнных желез. В этих случаях остаются вопросы относительно патогенеза заболевания и эффективных мероприятий. Оптимизированный метод, который позволяет функциональной оценки слюнных желез имеет неоценимое значение для изучения биологии экзокринной железы, дисфункции и терапии. Здесь мы представляем шаг за шагом подход к выполнению пилокарпин стимулирует секрецию слюны, включая трахеостомические и рассечение трех основных мышиных слюнных желез. Мы также подробно соответствующие мышиных анатомия головы и шеи, доступны во время этих методов. Этот подход является масштабируемой, позволяя для нескольких мышей, чтобы быть обработаны одновременно, повышая эффективность работы потока. Мы стремимся улучшить воспроизводимость этих методов, каждый из которых имеет дополнительные приложения в пределах области. Помимо сбора слюны мы обсуждаем метрики для количественной оценки и нормализации функционального потенциала этих тканей. Репрезентативных данных включены от подчелюстной желез с функцией депрессии слюнной железы 2 недель после фракционированный излучения (4 дозы 6.85 гр).

Введение

Нарушения слюнной железы включают синдромы dysregulated или нарушением секреции приводит к перепроизводству (sialorrhea) или недопроизводства (ксеростомия и гипосаливация) слюны1. В обоих случаях существует заинтересованность в улучшении нашего понимания слюнных желез биологии к конечной цели терапевтического развития2.

Слюнные железы являются весьма радиочувствительным органов и часто повреждены во время радиотерапии рака головы и шеи, приводит к постоянной сухость во рту (ксеростомия)3,4. В отличие от других радиочувствительным тканей однако, текучесть слюнных желез является относительно низким, и механизм секреторной потери является плохо понимали5,6. В этой обстановке уникальный травмы, ткани регенерации и радиационной безопасности стратегии требуют слюнных функциональной оценки. Экспериментально мышиных слюны коллекции является особенно ценным инструментом в оценке железы ответ к радиации и терапевтических агентов.

Здесь мы представляем метод для выполнения и количественного определения секреции стимулировали слюны, с помощью пилокарпин, мощным мускариновых агонист7. Пилокарпин стимулирует вегетативную нервную систему, чтобы побудить железы секреции8,9. Надлежащим образом выполнить этот тест, трахеостомические требуется обеспечить, что мышь поддерживает патент сократимость во всей процедуре и уменьшить риск удушья и аспирации от пула выделениями в полости10.

Это терминал процедура, кульминацией удаления трех основных слюнных желез: околоушной (PG), подчелюстной (SMG) и сублингвально (SLG). Для функциональных исследований записываются и часто используются для нормализации слюны измерения11,12,13железы весов. Эти данные особенно важна в радиационных исследований, которой атрофию желез является ожидаемый результат14,15

Изменчивость в литературе в отношении как стимулируется секреция слюны производится и сообщил16. Например пилокарпин дозы в литературе диапазона по меньшей мере трех порядков17,18,19,20,21,22,23. Здесь мы представляем оптимизированные высокие дозы пилокарпин протокола с целью улучшения воспроизводимость результатов выполнения метода, а также предоставление модульной платформы методов (трахеостомические, сбора слюны и железы рассечение), которые могут быть адаптированы, как требуется.

Помимо протокола демонстрации мы включить представителя функциональные данные слюны потока на 2 недели, после фракционированный излучения (4 дозы 6.85 Gy) в регионе SMG.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры в естественных условиях , изложенных ниже были утверждены Комитетом университета по ресурсам животных в Университете Рочестер Рочестер. SYS

1. Подготовка

  1. Используя аналитический баланс, вес 20 мг пилокарпин. Растворяют в 2 мл стерильного физиологического раствора в пробки microcentrifuge.
    Примечание: Потому что пилокарпин светочувствительных и теряет активность с течением времени, это решение должна быть подготовлена день инъекции и защищены от света до тех пор, пока Управление.
  2. С помощью аналитического баланса, взвесить и определить все коллекции трубок и стеклянные капилляры. Количество стеклянных капилляров и коллекции труб должен соответствовать количество мышей.

2. tracheostomy

  1. Взвешивание мышей C57/BL6, используя аналитический баланс.
  2. С помощью 0,5 мл шприц с иглой сметы x ½", анестезировать мышей с внутрибрюшинно вводили стерильным физиологическим раствором Ксилазина кетамина и 10 мг/кг 100 мг/кг. Перейти к следующему шагу, когда мышь, больше не реагирует на раздражители (т.е. отсутствие педали вывода рефлекс), которое обычно происходит в течение 5-10 мин после инъекции.
  3. После распыления смазки на хлопок наконечником аппликатором аккуратно применяются к глаза и поместите курсор мыши в лежачем положении на сцене. Наркотизированных животное должно храниться на теплой поверхности.
    Примечание: Все шаги выполняются при комнатной температуре.
  4. Закрепите носа, конечностей и хвост на сцену с помощью Хирургическое ленты.
  5. Чистота и мокрой шеи с очистки спирта.
    Примечание: Это поможет предотвратить проникновение последующих разрезов меха.
  6. Повышение кожи шеи вентральной срединной линии с щипцами, Сделайте небольшой, поверхностный надрез рассечения ножницами. Руководство ножницы в отверстие и медленно открыть лезвия подкожно, чтобы отделить ткани самолеты.
  7. Сохраняя поднял кожу, тщательно вырежьте на 1 см ниже устья.
  8. Сделайте два боковых разрезов на нижней и Улучшенный аспекты первого пропила. Аккуратно с помощью щипцов, отражают прочь кожу, чтобы включить доступ к структурам головы и шеи.
  9. С использованием рассечения Микроскоп при увеличении 8 X, визуализировать подчелюстной желез (срединная: рис. 1).
  10. С помощью тонкой щипцы, осторожно поднимите желез подвергать четыре мышцы infrahyoid (ремень), обволакивающие трахеи. Избегайте срывать или нарушая окружающих сосудистую или выделительной воздуховодов.
  11. Если сбор слюны из более чем одной мыши, повторите шаги 2.1-2.10 с каждой мыши перед продолжением.
    Примечание: Эта процедура может безопасно выполняться на до 5 мышей одновременно.
  12. С небольшой рассечения ножницами удалите медиальной части ремень мышц во время пребывания как можно ближе к средней линии, как это возможно. Вырежьте только по мере необходимости визуализировать трахеи и держать мышцы ремень в сторону во время процедуры. Избегайте, уменьшение поперечного сечения любой поблизости судов, потому что если истощение объем вторичного значительные кровоизлияния, пилокарпин не будет эффективным на побуждение секрецию.
  13. Отражать ремешок мышцы от трахеи.
  14. Визуализируйте гортани, трахеи и щитовидной железы. Убедитесь, что трахеи подальше от вышележащих тканей.
  15. Сделать горизонтальный разрез в трахею уступает/задняя щитовидной железы, с помощью малых рассечения ножницы. Убедитесь, что дыхательные пути патентов и ясно жидкости.

3. слюна коллекция

  1. Удалите ленту возле рта и угол рассечение этап вниз (45°, краниально) для оказания помощи с потоком слюны.
  2. С помощью 0,5 мл шприц с иглой сметы x ½", выполняют внутрибрюшинного введения 10 мкл/g тела вес пилокарпин для общей дозы 100 мг/кг.
  3. Запустите таймер. Если дозирования несколько мышей, сократить сроки, перемещая быстро и имея помощник одновременно внедрить остальные мышей.
  4. С помощью стандартных щипцы, откройте рот для доступа капиллярной трубки.
  5. После того, как шарик слюны наблюдается в рот, место проксимальный конец капиллярной трубки в жидкость, с дистального конца, помещены в собирая трубки расположены ниже рассечения этап (обе трубы предварительно весил).
    Примечание: В самок мышей C57/BL6 6-10 недель возраста, брутто слюноотделение происходит в течение 2 мин пилокарпин инъекции.
  6. Если слюны в рот, но не пропуская через трубку, повторите предыдущий шаг. Убедитесь, что трубка не помещается непосредственно против слизистой поверхности, которая может препятствовать входе.
  7. Собирайте слюны для в общей сложности 12 мин после пилокарпин стимуляции. Убедитесь, что Стома остается ясным.
    Примечание: Увеличение дыхательный объем и секреции (слюнных, мочи, Кала) являются нормальными в это время.
  8. Если мышей снизило слюны функции (например., из-за травмы или вмешательства), передавать коллекции трубки с помощью Р200 микропипеткой оставшиеся жидкости от устья. Если сбор от нескольких мышей, убедитесь, что советы меняются.
  9. Запишите вес собранных слюны плюс трубы 12 мин после инъекции пилокарпин.

4. железы рассечение

  1. Усыпить мышей с CO2 эвтаназии (как описано в руководстве AVMA для эвтаназии животных: издание 2013) следуют торакотомии, заботясь, чтобы сохранить структуры головы и шеи. По этой причине Избегайте вывиха шейки матки как метод эвтаназии.
  2. Поместите указатель мыши в лежачем положении на сцене. Изменить положение желез на исходном узле над трахеи (рис. 1).
  3. Под микроскопом рассечения под 8 крат, визуализировать крупных желез: PG, SMG и SLG. Чтобы отличить желез во время вскрытия, определите, что PG диффузный, лежа сбоку SMG и SLG.
    Примечание: Если рассекает PG, это следует сделать сначала потому, что это наименее определены и скорее всего, быть разорван.
  4. Возьмите хвост PG пинцетом, потянув его от базовых структур и осторожно применять напряжение перед режущая головка PG с рассечения ножницы.
  5. Нарушением капсулы вокруг СМГС, с помощью щипцов. Аккуратно отделить SMG влево и вправо.
  6. Бесплатный спинной части SMG от придерживался nonglandular ткани, с помощью щипцов.
  7. Удалите SMG от шеи, Рисование воздуховода Wharton тугой пинцетом и резка воздуховодов с рассечения ножницы.
  8. Аккуратно отделите SLG от SMG, используя пинцет.
    Примечание: SLG находится в superolateral аспекте SMG.
  9. С помощью аналитического баланса, запись SMG весов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При выполнении высокие дозы пилокарпин стимуляции сбора слюны, это важно для поддержания дыхательных путей во избежание аспирации или удушья от выделений в ротовой полости. Схематическое изображение трахеостомические предоставляется (рис. 1). После разреза трахеи Стома должна оставаться четкой ткани и жидкости.

Для повышения капиллярность во время сбора слюны, мышей должны быть расположены с их голо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем многоступенчатое метод для оценки функции слюнных желез, которые могут быть применены для изучения травмы железы и терапии. Наша процедура включает трахеостомические, сбора слюны и железы рассечение, каждая из которых имеет экспериментальных приложений, которые могут поддерживать комплексное исследование слюнных желез биологии. Например мышиных трахеостомические был использован для управления общим дыхательных путей во время процедур, препятствующих ротовой полости.

Надлежащего...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Исследования в этой публикации было поддержано Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследований (NIDCR) и национального института рака (NCI) национальных институтов здравоохранения под награду номер R56 DE025098, UG3 DE027695 и F30 CA206296. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. Эта работа была также поддержана NSF DMR 1206219 и получила инновации в устной Уход награды (2016).

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Eri Маруямы и Эндрю Холломон за их помощь в сборе слюны. Мы хотели бы поблагодарить Пей-Lun Weng за его помощь в железе рассечение. Мы хотели бы поблагодарить Мэтью Ingalls за его помощь в подготовке рис. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Элейн Smolock и Эмили Ву для критических чтении этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пилокарпина гидрохлоридSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Весенние ножницыFine Science Tools91500-9Пружинные ножницы для трахеостомы
Стерильный солевой раствор MedlineRDI30296Hфизраствор
Dumont #7 ЩипцыFine Science Tools11274-20Изогнутые щипцы
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-10Прямые щипцы
стандартного шаблона ЩипцыFine Science Tools11000-12Тупые щипцы
Тонкие ножницы - карбид вольфрамаFine Science Tools14568-09Ножницы для рассечения
Микрогематокрит Гепаринизированные капиллярные трубкиFisher Scientific22362566капиллярные трубки
Смазка глазная мазьRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat поликлональный анти-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Антитело
DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Статистическое программное обеспечение
Аппликатор с ватным наконечникомMedlineMDS202000Аппликатор для глазной мази
0,5cc Инсулиновый шприц, 29G x 1/2"BD7629Шприц для внутрибрюшинного введения

Ссылки

  1. Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
  2. Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
  3. Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  4. Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
  5. Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
  6. Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both? Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
  7. Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
  10. Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
  13. Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
  14. Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
  15. Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
  16. Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
  17. Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
  18. Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
  19. Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
  20. Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
  21. Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
  22. Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516(2007).
  23. Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
  24. Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
  25. Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
  26. Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
  27. Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65(2010).
  28. Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
  29. Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
  30. Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
  31. Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063(2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Слюнные железы мышисекреция слюныпроцедура трахеостомиидиссекция железфункция слюнных железподнижнечелюстная железасбор слюныанатомия головы и шеи
Мышиных слюнных функциональной оценки через после стимуляции пилокарпин фракционированный излучения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.