Method Article

Модель в наркотизированных конкретного возбудителя бесплатные куры для изучения вирулентности Clostridium Perfringens перевязаны кишечной петли

DOI:

10.3791/57523

⸱

October 11th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Université de Montréal, 2University of Bristol

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол к хирургическим путем создания «кишечной петли перевязаны» в курица тонкий кишечник. Эта процедура позволяет для сравнения нескольких штаммов Clostridium perfringens вирулентности в situ в одном узле. Этот метод значительно уменьшается количество кур, обычно необходимых для подобных экспериментов в естественных условиях .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтерит Некротический был изучен в КУР, с использованием различных моделей инфекции в естественных условиях . Большинство из них использовать сочетание предрасполагающих факторов, таких как кокцидиоза и диеты, с кормления или администрации через канал, с помощью Clostridium perfringens. В этих моделях сравнение нескольких штаммов C. perfringens вирулентности исследований требуется большое количество хостов для получения значимых результатов. Смертность в ходе исследования может быть высокой зависимости от экспериментальной модели, поэтому повышение этических соображений относительно животных в научных исследованиях. Разработка новых моделей инфекции, требующие меньше животных для изучения патогенеза, пока предоставление статистически существенных и допустимых результатов, имеет важное значение в плане сокращения использования животных в научных исследованиях. Кишечные перевязаны цикла модели были использованы для изучения клостридий инфекции в различных видов, таких как мышей, кроликов и телят. После хирургических процедур для создания сегментов перевязаны цикла штаммы C. perfringens вводят непосредственно в петли, чтобы установить тесный контакт между бактериями и слизистую кишечника. По завершении процедуры после нескольких часов берутся образцы Люминал содержания и тонкой кишки. Несколько штаммов бактерий могут быть привиты в каждое животное, что сокращает количество необходимых предметов в экспериментах. Кроме того процедуры проводятся под общим наркозом для уменьшения боли животных. В КУР эта модель будет более подходящим, чем пероральный для сравнения патогенности штамм C. perfringens , поскольку требуется меньшее количество животных, не предрасполагающие факторы требуются навести болезни и боль контролируется анальгетики . Кишечные петли перевязаны модель плохо описан в кур и стандартизации имеет важное значение для его оптимального использования. Эта рукопись обеспечивает все необходимые шаги для создания многочисленных кишечных петель перевязаны в кур и приносит информацию о критических точек для получения достоверных результатов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование животных моделей для изучения инфекционных заболеваний, затрагивающих людей и животных является главным инструментом в оценке Факторы вирулентности, регулирующие патогенеза конкретные условия также в отношении разработки стратегий для предотвращения или лечения заболеваний1. Несмотря на многочисленные преимущества использования животных моделей для изучения различных заболеваний возникают этические соображения относительно этой практики. Исследователи должны свести к минимуму использование животных во время получения существенных и допустимые результаты. Для обеспечения учета вопросов благосостояния в таких исследованиях была разработана концепция 3 Rs принципов (Replace, уменьшить и уточнить). В исследованиях энтерит Некротический курица в естественных условиях курица модели используются для изучения этиологии, профилактики и лечения данного состояния2,3,4,5. Патогенные штаммы C. perfringens проведение конкретных вирулентности факторы, такие как NetB токсин6, находятся в ведении вызывают некротические энтерит в КУР7. Принцип замены, таким образом, трудно достичь в таком случае, поскольку эти факторы вирулентности могут быть не так критично в других видов животных. Большинство моделей для энтерит Некротический в КУР использовать комбинацию факторов риска, таких как кокцидиоза и изменили диету, чтобы побудить некротические энтерит, следуют затравки культуры бульон, содержащий большое количество C. perfringens2. Эти модели будут вызывать заболевания в большое количество кур, и смертности может иметь важное значение в таких испытаний8, таким образом вызывает обеспокоенность по поводу сокращения и уточнения принципов в исследований на животных.

Кишечные петли перевязаны модели являются желательной альтернативой для изучения болезней, вызванных кишечных патогенов отношении принцип сокращения и уточнения. В этих моделях кишечные сегментов, под названием «петли» создаются путем размещения лигатуры вдоль желудочно-кишечного тракта для формирования независимой и герметичных отсеков, где патогены могут быть введены только9 или с другими молекулами, например вакцин-кандидатов 10 , 11. патогенов интереса находятся в тесном контакте с клетками кишечника и после нескольких часов время инфекции, кишечные образцы могут быть восстановлены для дальнейшего анализа. Это позволяет использовать несколько лечения и контрольных групп в то же самое животное. Статистический анализ может выполняться с моделями неоднократные меры, которые увеличивает силу дискриминации между группами и уменьшает количество необходимых кур, по сравнению с пероральная затравка испытания. Кроме того хирургических процедур и последующего заражения раз выполняются под непрерывной общей анестезии и обезболивание, таким образом к минимуму животных боль. Замкнутая перешнуровок являются идеальным шаблон для сокращения числа узлов и создания более гуманной системы исследований на животных.

Кишечные петли перевязаны модели хорошо описаны в различных видов, таких как телят, кроликов и мышей2,9, но плохо описано в КУР7. Для оптимального использования этой хирургической модели правильную технику и выполнения необходимы для создания перевязаны кишечной петли, чтобы избежать повреждения кишечника целостности. Цель этой рукописи должен описать метод шаг за шагом в создании нескольких кишечных петель в модели курица. Этот метод ограничен хирурга мастерство и опыт, как точные процедуры имеют важное значение для успеха проекта.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с использование живого животного были утверждены Комитетом по этическим факультет ветеринарной медицины, Университет Монреаля (CÉUA, «Комите d» этики де использование des Animaux»).

1. соображения до операции

  1. Выбор конкретного возбудителя бесплатно 10 недель (SPF) Ливорно кур для хирургии.
    Примечание: Их вес должен быть между 1.0 и 1.2 кг.
  2. Снять канал 12 ч до процедуры для очистки желудочно-кишечного тракта.
  3. До операции место Куры под общим наркозом после протокол проверены анестезиолога. Premedicate каждый цыпленок 15 мин до операции с внутримышечной инъекции (IM) мидазолама 1 мг/кг и Буторфанол 4 мг/кг. Повторяю, каждые 4 ч, инъекции Буторфанол 4 мг/кг IM или когда изменения характера дыхания и частоты увеличивается во время анестезии. Для общей анестезии во время всех процедур, управление изофлюрановая в концентрации между 1,5 и 2,5% с трахею трубки.
    Примечание: Как они будут значительно улучшить глубины анестезии, уменьшить количество обезболивающих средств, необходимых во время всех процедур, а также включить исследователей для контроля уровня боли рекомендуется использовать премедикации для успокоения и анальгезии.
  4. Контролировать анестезии путем записи температуры тела, частоты пульса и электрокардиограммы (ЭКГ), дыхательных частоту и ритм, насыщение кислородом, истек углекислый (CO2) и неврологических рефлексов.
    Примечание: Человек должен быть назначен для мониторинга этих параметров на протяжении всех процедур.
  5. Следуйте принципам стерильности течение хирургических процедур. Убедитесь, что хирург и помощник хирурга платье с стерильных платья, перчатки, маски и защитные очки согласно институциональных предоперационной протоколы. Убедитесь, что хирург скрабы руки хлоргексидин глюконат пропитанные стерильные щеткой до локтя с упором на ногти и каждый палец поверхности.
  6. Стерилизуйте хирургические инструменты с стерилизатор.

2. Хирургическое сайта подготовка

  1. Во-первых вручную удалите перья из живота с нежной тяги.
  2. Скраб для хирургической сайта хлоргексидин глюконат стиральный порошок пропитанные стерильные щеткой. Аккуратно скраб кожи из центра наружу для общее время контакта 5 мин без возвращаясь к центру.
  3. Выполните 3 альтернативных проходы на хирургическое сайте с раствором хлоргексидина глюконата и изопропиловый спирт с использованием стерильных сетки.
    Примечание: Проход необходимо начинать с середины хирургической сайта на границы, чтобы избежать загрязнения из районов, не вылечить хирургическим сайт.
  4. Место стерильные хирургические драпировка на курицу.

3. Добыча тонкий кишечник из брюшной полости

  1. Надрезать хирургические драпировка с помощью ножниц выставить только хирургическое участок кожи.
  2. Надрезать кожу, выполняя '' L'' формы низкой-средней линии разреза с лезвием скальпеля #3.
    1. Запустите первый разрез 1 см к грудине каудально и заканчивается 1 см черепа в клоаку.
    2. Выполните второй надрез, перпендикулярно первый разрез. Начнем с хвостового конца первого разреза и продолжить 5 см к левой стороне живота, следуя линии таза.
      Примечание: Это открытие создаст лоскут, который позволит упростить извлечение кишечника.
  3. Хирургии ножницами вырежьте брюшины и брюшных мышц с тем же шаблоном формы '' L'' открыть брюшной полости.
    Примечание: Это будет подвергать воздушные мешки. Кишечника расположены под эти структуры. Воздушные мешки должны быть увлажненный с сетки, насыщенных с стерильным физиологическим 0,85% чтобы избежать высыхания и возможного разрыва во всей процедуре.
  4. Вставка, СНУК Шпай крюк в брюшной полости, следуя левой брюшной стенки и работать путь вокруг живота воздушные мешки.
  5. Аккуратно неубранной кишечника и разложить их на операционном поле.
    Примечание: Держать кишечник, увлажняется, часто поливая стерильный физиологический 0,9% на протяжении всей процедуры. Кроме того сеток, увлажненный с стерильного физиологического раствора могут быть размещены на кишечник, чтобы избежать высыхания.
  6. Grab кишечника с помощью сухой стерильной марлей и аккуратно выньте из тонкого кишечника путем ручной тяги подвергать тощей кишки.
    Примечание: Брыжеечных сосудов являются хрупкими и чрезмерная напряженность может разрыва их, которые могут привести к кишечной ишемического поражения и существенно подорвать результаты процедуры.

4. Изготовление кишечной петли

  1. Создание цикла № 1.
    1. Место просто лигатура полиглактин мультифиламентные синтетические рассасывающиеся материалом в проксимальном тощей кишки, избегая лигатура крупных брыжеечных сосудов.
    2. Место дистальной лигатура 2 см от проксимальных лигатур.
      Примечание: Простой лигатуры, сделанные с мультифиламентные шовного материала расположены вдоль желудочно-кишечного тракта для создания герметичных сегментов. Схема (рис. 1) описывает расположение всех лигатуры. Циклы состоят из проксимальных и дистальных лигатур, разделенных на 2 см.
  2. Создание interloop № 1.
    1. Место простой лигатура 0,5 см aborally к дистальной лигатура цикла №1.
      Примечание: Между последовательных циклов, есть interloops 1 см, т.е. сегменты, делая физическое разделение между петлями. Скорее всего уменьшить возможный риск перекрестного заражения от одного цикла к другому, простой лигатура находится посередине interloop (0,5 см от проксимальных и дистальных лигатура 2 смежных циклов). Это уменьшает риск возможной утечка загрязняющих веществ из цикла достичь лигатура прилегающих цикла. Эти сегменты не являются обязательными, но уменьшит риск перекрестного загрязнения.
  3. Создание последующих циклов и interloops.
    1. Повторите шаги 4.1 и 4.2, чтобы получить количество желаемых петель.
      Примечание: В этом эксперименте, 9 петель и 8 interloops были созданы. Общая протяженность составила 26 см. Количество петель могут корректироваться в зависимости от исследования.

5. инъекции штаммов Clostridium perfringens в петли

  1. Придать стерильный шприц и игла 26 G возбудителя в петлю № 1. Аккуратно вставьте иглу на стороне antimesenteric кишечника под углом 45°.
    Примечание: В этом эксперименте, 0,2 мл мозга сердце инфузии (BHI) содержащий 1 x 10-6 кое (колонии формируя единиц) C. perfringens в фазе роста среднего журнала было впрыснуто в каждом цикле. 5 различных штаммов вводили в 5 различных петель и оставшиеся петли 4 вводили с отрицательным элемент управления, содержащий никаких бактерий (стерильные BHI), чередуя патогенов и стерильные BHI петли.
  2. Повторите шаг 5.1 придать все петли.
  3. Аккуратно замените кишечного тракта в спинной области брюшной полости, под воздушные мешки.

6. Закрытие брюшной полости

  1. Шовный материал брюшины и мышц живота.
    1. Шовные брюшины и брюшные мышцы вдоль малого таза (сделанные в шагу 3.3) с простой непрерывный шов выкройку полиглактин мультифиламентные синтетические рассасывающиеся материала.
    2. Шовные брюшины и мышцы живота от грудины в клоаку (в действии 3.3. с простой непрерывный шов выкройку полиглактин мультифиламентные синтетические рассасывающиеся материала.
  2. Шовный материал кожи.
    1. С помощью полиглактин мультифиламентные синтетического материала и шаблон простой непрерывный шов, закройте разрез кожи вдоль малого таза, в пункте 3.2.
    2. Используя тот же материал мультифиламентные лигатур и шаблон простой непрерывный шов, закройте разрез кожи от грудины на шаге 3.2 клоаку.

7. заключение

  1. После хирургических процедур Держите курица под общим наркозом с надлежащее использование анальгетиков для сведения к минимуму животных боль во время инфекции. Далее, анестезиологического мониторинга для обеспечения адекватной анестезии уровня.
  2. После желаемого инфекции время гуманно усыпить курица, шейки матки дислокации под общим наркозом.
    Примечание: Для выполнения этих процедур, необходимое время побудить микроскопических повреждений с патогенные штаммы C. perfringens был 7 h.
  3. С лезвием скальпеля #3 вырезать 0,5 см раздел петля длиной 1 см и поместите его в формалина 10% для фиксации ночи и далее гистопатологические анализа.
  4. С же лезвие скальпеля вырезать оставшиеся петли секции и поместите его в стерильных microcentrifuge трубки для изоляции штаммов C. perfringens далее бактериологическое анализа каждого цикла для их генетических характеристик.
  5. Повторите шаги 7.2 и 7.3 для всех циклов, изменив лезвие скальпеля между каждый цикл.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема 9 петель кишечника и 8 interloops показано на рисунке 1. В этой модели в общей сложности 9 петель и 8 interloops создаются с простой лигатуры. Цикл состоит из проксимальных и дистальных лигатуры, расположенных на 2 см, измеренное от проксимальных лигатур. Две смежные циклы разделяются interloop 1 см. Для уменьшения возможного риска перекрестного загрязнения между петлями утечки от лигатуры, interloop лигатура помещается на полпути от дистальной лигатур ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В многочисленных видов для изучения взаимодействия хост возбудителя и патогенезе заболеваний, вызванных различных кишечных патогенов, таких как Clostridium perfringens, Clostridium несговорчивый и были описаны модели кишечной петли Salmonella enterica7,9,13,14,15. Он также был использован для анализа слизистой иммунной реакции

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана в птицы исследований (M. Boulianne) Председатель факультета ветеринарной медицины Университет Монреаля. DRS. Boulianne и родитель разработали модель. DRS. Boulianne и родитель выполненных операций. Д-р ожоги помощь в разработке протокола анестезии. Д-р родитель редактировать видео и написал рукопись. DRS Бернс, Дероше и Boulianne редактировать рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EZ-Scrub 747Becton Dickinson and Company4% хлоргексидина глюконат моющее средство пропитанная стерильная щетка. Каталожный номер недоступен. Веб-адрес: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Изопропиловый спирт 70% USP 4 лКоммерческий изопропиловый спиртP016IP70Веб-адрес: http://www.comalc.com/products/
ChlorexidineSigma-Aldrich282227-1GРаствор хлоргексидина глюконата, необходимо разбавить до 4%. Веб-адрес: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Хирургическая простыня маленькая (27 дюймов x 24 дюйма) с 3 x 6 дюймов ФенестрацияВетеринарные специальные продукты32724Веб-адрес: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Лезвия скальпеля #3Swann-Morton301Веб-адрес: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Стерильный физиологический раствор NaCl 0.9%Sigma-AldrichS8776-100MLВеб-адрес: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0EthiconD9003Полиглактин мультифиламентный рассасывающийся шовный материал. Веб-адрес: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Шприц 1 мл с иглой 26GBecton Dickinson and Company329652Веб-адрес: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart InfusionSigma-Aldrich1104930500Веб-адрес: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tubeSigma-AldrichT9661-500EAМикроцентрифужная трубка. Веб-адрес: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Раствор формалина, буферизированный нейтральный, 10%Sigma-AldrichHT501128-4LRatio ткани: формалин 1:10 для адекватной фиксации. Веб-адрес: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens штаммыUniversité de Montré al, Chaire en recherche avicoleN/AСпецифично для каждой лаборатории, доступно по запросу автору-корреспонденту

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26(2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52(2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101(2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608(2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5(2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal Ligated LoopClostridium PerfringensChicken Necrotic EnteritisSurgical ProcedureAnesthesia MonitoringBacterial InjectionHistopathological AnalysisVirulence Strain ComparisonSpecific Pathogen FreeIntestinal Mucosa Contact

Related Articles