Интегрировать изображений проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование для оценки измененных Endocytic CD1d торговля

Summary

Imaging проточной цитометрии предоставляет идеальный подход для выявления морфологических и функциональных изменений клеток на индивидуальном и популяционной уровнях. Нарушается функция endocytic для презентации антигена липидов в подвергшихся воздействию загрязнителей дендритных клетках человека была продемонстрирована с профилирования комбинированных транскриптомики экспрессии генов и морфологических демонстрации оборота белка.

Abstract

Популяционной анализа морфологических и функциональных изменений endocytic белков сложной из-за спроса захвата изображения на одну ячейку анализа уровня и статистические изображений на популяционной уровне. Для преодоления этой трудности, мы использовали визуализации проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование (РНК seq) для определения измененных субцеллюлярные локализации Кластер дифференцировки 1d белка (CD1d) связанные с нарушением endocytic ген выражение в человека дендритные клетки (DCs), которые были подвержены общей липофильных воздушных загрязнителей бензо [а] пирена. Colocalization CD1d и endocytic маркер Lamp1 белков из тысячи клеток изображения, снятые с imaging проточной цитометрии было проанализировано, используя идеи и ImageJ-Фиджи программы. Многочисленные сотовой изображения с совместно окрашенных CD1d и Lamp1 белки были визуализирована после стробирования на CD1d⁺Lamp1⁺ РС с помощью идей. Расширение CD1d и Lamp1 colocalization на Бат экспозиции далее была продемонстрирована с помощью показатели scatterplots, протестированы с Мандер в коэффициенты для совместного локализованных интенсивности и нанесены на основе доли совместно локализованных участков с помощью ImageJ-Фиджи. Наши данные обеспечивают выгодно инструментальная и bioinformatic подход для измерения colocalization белка на как одного, так и популяционной сотовой уровнях, поддерживая зрением функциональный результат транскриптомики изменения в подвергшихся воздействию загрязнителей человека РСУ.

Introduction

Презентация антигена, как правило, включает внутриклеточных белков людьми, который часто исследовано с помощью морфологических характеристик и фенотипические профилирование антиген представляющих клеток в^1,2,3 . Чтобы интегрировать преимущества изображений и методов фенотипа, мы описываем анализа платформа отображения информации на одну ячейку и численности населения продемонстрировать измененный белок colocalization дендритных клеток человека (DCs). В презентации антигена пептидный комплекс гистосовместимости (MHC) сорта молекул привязать короткие пептиды (8-10 остатков) в э....

Protocol

Человека протоколов в этом исследовании были утверждены институциональных Наблюдательный Совет Университета Цинциннати и все методы были исполнены в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил. Образцы крови здоровых доноров были получены из центра крови Hoxworth в медицинском центре Университета Цинциннати.

1. транскриптомики профилирование воздействию загрязнителей человека моноцитарных DCs

1. Общая добыча РНК БАП облученных DCs
   1. Дифференцировать человека DCs, используя цитокинами ГМ-КСФ и Ил-4 и разоблачить DCs бат за 4 дня¹³.
   2. Сортировать БАП облученных DCs, с помощью про....

Results

Липофильные загрязнителей БАП изменяет endocytic гена кластеров в DCs моноцитарных человека DCs. человека от каждого донора (n = 3) были инкубировали с Бат и сортируются для обычных РСУ, которые использовались для РНК добыча и транскриптомики анализа как описано далее . После нормализации экспрессии генов измененных генов между группами БАП подвержены и не подвержены были сгруппированы согласно функциональной корреляции дифференциально выраженной генов. Мы ввода списка измененных генов To.......

Discussion

Функциональные подтверждения пути измененный ген является сложной задачей, из-за широко влияние генов выражения с участием нескольких путей и трудности интеграции индивидуальных и популяционной клеточной деятельности. Мы использовали визуализации проточной цитометрии специально тест CD1d торговлей endocytic отсеков. Imaging проточной цитометрии интегрирует популяционной измерение клеток и индивидуальные демонстрации внутриклеточных colocalization несколько белков. Конфокальная микроскопия ранее предоставил высокое разреш.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Транскриптомика	Illumina	HiSeq 2500 v4	Система Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	Визуализационная проточная цитометрия
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fisher		Total RNA
Extraction Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		Total RNA QC analysis
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	Thermo ПЦР Фишера		, ферментная реакция
NEBНext модуль магнитной изоляции поли(A) мРНК	Биолаборатория		Новой Англии Очистка РНК PolyA
Автоматизированная система SMARTer Apollo	Takara		PolyA Очистка РНК
NEBNext Ultra RNA Library Набор для	New England Biolab
Agencourt AMPure XP магнитные бусины	Beckman Coulter		Очистка ДНК
2100 Биоанализатор	Agilent		Library QC, анализ распределения по размерам
Agilent High Sensitive DNA Kit	Agilent		Library QC, анализ распределения по размерам
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)	Quantification Thermo Fisher		Library
NEBNext Library Quantification
cBot	Illumina Генерация кластера
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS	Illumina		Library Поколение кластера
HiSeq 1000	Illumina		Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 циклов)	Illumina		Sequencing
Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Фикоэритрин/Цианин 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Бриллиантовый фиолетовый 421	Bio Legend	L161
PE-анти-мышь IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)