Method Article

Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол для визуализации мотонейрона проекции и аксон арборизация в трансгенной эмбриона мыши Hb9::GFP . После иммуноокрашивания для двигательных нейронов мы использовали свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения эмбрионов для дальнейшего количественного анализа. Этот протокол применяется к другим процессам навигации нейрон в центральной нервной системе.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мотонейронов спинного мозга (MNs) расширить их аксоны общаться с их innervating цели, тем самым контроль движения и сложные задачи в позвоночных. Таким образом важно выявить молекулярные механизмы как Мотор аксоны перейдите к arborize и иннервируют их периферические миорелаксанты цели во время разработки и дегенерации. Хотя трансгенных линий мыши Hb9::GFP долго служил для визуализации траекторий двигателя аксона во время эмбрионального развития, подробные описания полного спектра терминала арборизация аксона остаются неполными ввиду сложности шаблон и ограничения текущей оптической микроскопии. Здесь мы описываем улучшение протокол, который сочетает в себе свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) и анализ надежной изображений и количественно и качественно визуализировать развивающихся мотор аксоны. Эта система может быть легко принял пересечь генетических мутантов или MN болезни модели с Hb9::GFP линиями, раскрывая новые молекулярные механизмы, которые приводят к дефектам в мотор аксона навигации и арборизация.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MNs позвоночника являются частью центральной нервной системы, но иннервируют периферийных мышцы для контроля движения. В развивающихся спинного мозга MN прародителями (ПНЛ) устанавливаются согласно сигналы, исходящие от хорда и смежные сегменты. Все продифференцировано пост митотическая MNs затем создаются из ПНЛ, в конечном счете порождает ряд подтипов MN вдоль оси rostrocaudal спинного1,2. Позвоночника MNs топографически и анатомически хорошо организованы. Расположение их морфологические коррелирует с позиции их соответствующих целевых в периферии3. По достижении их целей мышц, аксоны получать сотовой и экзогенных нейротрофических факторов, которые побудить их расширения и филиал в мышцы. Иннервация и ветвления дефекты могут способствовать несоздания нервно развязок (NMJ). Например, глиальные нейротрофического факторы (GDNF)-индуцированной Pea3 является необходимым условием для арборизация аксона в кожный maximus (см) и мышцы, широчайшая мышца спины (LD)4,5. Кроме того рестораны нокаут мыши эмбрионов показывают дефектных арборизация диафрагмального нервов в диафрагмы, вызывая дыхательной недостаточности и смертности сразу же после рождения6,7. Таким образом этот последний шаг MN созревания (то есть, аксональное проекции и ветвление) имеет решающее значение для обеспечения связи между нейронами и клеток-мишеней.

Чтобы просмотреть шаблоны арборизация, исследователи обычно проводят конфокальная томография или легкие микроскопии флуоресцирования двух Фотон секционного или целое гора образцов8,9,10. Оба эти методы микроскопии генерировать приемлемое разрешение и глубину проникновения. Световой микроскопии флуоресцирования двух Фотон предполагает возбуждения флуорофоров одновременное поглощение двух нижнего энергии фотонов11. Поскольку два Фотон возбуждения использует ближнего инфракрасного излучения, снижение возбуждения частоты способствует уменьшение рассеяния и лучшего проникновения ткани до 1 мм в ткани, таким образом позволяя изображений с большей глубиной. Конфокальная микроскопия удаляет фильтры из фокус сигналов и только собирает свет в пределах фокальной плоскости12. С этим подходом изображения образцов из разных фокальной плоскости могут быть объединены для получения трехмерных (3D) изображения через функцию Z-стека. Тем не менее интенсивность сигнала снижается, как большинство свет блокируется и высокой численного отверстия закрывают глубина резкости. Что еще более важно обе методики способствуют тяжелые фотоповреждения и Фототоксичность поскольку весь образец получает свечение, даже тогда, когда только один самолет отображаемого в данный момент.

Чтобы обойти эти недостатки, LSFM стал благоприятствования альтернативы, с преимуществами, быстро, эффективно свет и меньше фототоксических13,14. Кроме того LSFM позволяет нескольких изображений. Этот подход особенно подходит для визуализации мотор аксонов и их диспергирования терминалы, как они распространились в трехмерном пространстве. LSFM превосходит другие два варианта, поскольку образцы устанавливаются на сцене, которая позволяет вращение вокруг вертикальной оси и движения вдоль x, y и z оси. Эта установка позволяет не только минимально заблокированных вид образца, но и выбор желательной освещение пути, недостаток двух фотонов и конфокальная микроскопия, оба из которых требуют монтажа образцов на слайде плоских. Таким образом LSFM является наиболее подходящим инструментом для 3D визуализации арборизация аксона и количественного определения двигательного нерва терминалов в эмбрионов мыши.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все живые животные хранились в конкретного возбудителя бесплатно (SPF) животных фонда, утвержденных и контролируется IACUC Синика.

1. Фиксация

  1. Собирать эмбрионов эмбриональных день 12,5 (E12.5) затем обезглавить и потрошение их.
  2. Исправьте эмбрионы индивидуально в 24-ну пластины с 1 мл/хорошо свежеприготовленные параформальдегида 4% в 1 x фосфатный буфер (PBS) на ночь. Инкубируйте на 4 ° C на шейкер.
  3. Вымойте фиксированной эмбрионов по крайней мере 3 x, каждый на 5-10 мин, с 1 мл раствора 1 x PBS и инкубировать на ночь при 4 ° C на шейкер для удаления остаточных параформальдегида.

2. всего гора иммуноокрашивания

  1. Разрушения каждого эмбриона в 1 мл 0,5% PBS-Тритон-X-100 (PBST) на ночь при 4 ° C на шейкер.
  2. Блокировать каждого образца с 1 мл 10%, ФБС, подготовленном в однократном ПБС на ночь при 4 ° C на шейкер.
  3. Инкубировать эмбриона с 1 мл раствора первичного антитела анти GFP (1:1, 000 разрежения в 10% FBS) при 4 ° C для 72 ч с постоянной тряски активизировать сигнал GFP двигательных нервов.
  4. После основное антитело инкубации, мыть с 1 мл 0,5% PBST в течение 1-2 дней при температуре 4 ° C на шейкер, изменив 0,5% PBST по крайней мере три раза.
  5. Применять 1 мл вторичные антитела (1:1, 000 разрежения в 10% FBS) и инкубировать на ночь в темноте при температуре 4 ° C постоянном встряхивании.
  6. Вымойте 3 x с 1 мл 0,5% PBST при 4 ° C на шейкер в течение 2-3 дней. Храните пробы в однократном ПБС на 4 ° C до дня изображений.
    Примечание: Эмбрионы могут расчленены на меньшие сегменты перед удалением, в зависимости от того, который будет отражаться частью эмбрионов. Передние конечности сохранились в этот экспериментальный подход (рис. 1A).
  7. Инкубируйте эмбриона в коммерческой очистки реагента с показателем преломления 1,49 НД в 1,5 мл трубку, защищенном от света при комнатной температуре на ночь, для визуализации эмбриона прозрачным для изображений.
    Примечание: Объем реагента очистки это приблизительно пять раз объема выборки.

3. LSFM (2-3 ч)

  1. Пример настройки
    1. Настройка 5 X / 0.1 оптике освещенности и 5 X / 0,16 обнаружения оптика. Соберите держатель образца и образца капиллярной (1,5 мм внутренний диаметр, зеленый) и поместите их в Микроскоп.
      Примечание: Обратитесь к руководство по эксплуатации микроскоп для детальной настройки процедур.
    2. Смонтируйте эмбриона следующим образом:
      1. Подготовьте наконечник пипетки P200, убирания в верхней части, так что он подходит диаметр капилляра и удалить заостренную часть (~ 3 мм) для образца приложения.
      2. Расплава притупляются конце кончика пипетки, с помощью малого пламени.
      3. Погасить пламя и быстро прикрепить эмбриона вертикально на конце расплавленного.
      4. Установите верхнюю часть кончика пипетки с образцом капилляров.
    3. Разрешить камеру буфера сбалансировать с эмбриона за 1 мин очистить от мусора или пузырьков.
    4. Использование изображений программное обеспечение, выберите найти капилляров на вкладке Поиск и настройка x, y, z оси для позиционирования образца капиллярной.
    5. Выберите Поиск образца и увеличить до 0,6 X сосредоточиться на эмбрион. Вращайте эмбриона, чтобы обеспечить, что длинная ось фотосъемка конечности выравнивает с пути света двух источников света (Рисунок 1B).
  2. Получение изображения
    1. На вкладке приобретения определить пути света параметры, такие как обнаружение целей, лазерная блокирующего фильтра, splitter луча, камеры и лазеры.
      Примечание: GFP канал используется в этом эксперименте (длина волны возбуждения: 488 нм; фильтр выбросов: BP 505 до 545 Нм, splitter луча: SPS LP 560).
    2. Установите флажок для сокращения тени сканирования опоры.
    3. Определите параметры приобретения: битовая глубина, 16 бит; масштаб, 0,36-0,7 X; односторонняя освещения (слева/справа) или двойной стороне освещения.
    4. Нажмите непрерывный и установите интенсивности лазера, выдержка, мощность лазера и свет лист позицию приобретать более четкие изображения.
      Примечание: Мощность лазера хранится как низкий, как можно свести к минимуму фотоповреждения.
    5. Нажмите кнопку остановить для захвата изображений в конце.
  3. Многомерные приобретение
    1. Определите z стека, перемещая позицию Z для первого и последнего изображения. Выберите оптимальный для задания номер слайса.
    2. Нажмите кнопку Начать эксперимент , чтобы приобрести выбранный z стека.
    3. Когда это делается, сохраните изображение в формате .czi.
  4. Обработка изображений (опционально)
    1. Продолжите с двойной боковой fusion под Lightsheet обработки канал если применяется двойной стороне освещения. MultiView обработки необходим, если мульти взгляды приобретают объединить изображения с нескольких точек зрения.
    2. Создание 2D изображения, используя данные из высокой интенсивности пикселей вдоль оси проекции под Максимальной интенсивности проекции канал.
    3. Группе копию канала выберите подмножество для выбора подмножества изображения из исходного набора.

4. Количественная оценка арборизация аксона (30 минут для каждого индивидуального нерва)

  1. Откройте файл изображения в анализ программного обеспечения обработки изображений (по умолчанию изображение, содержащее данные XYZ открыт в режиме Surpass и как представление 3D-визуализации).
  2. Настройка изображения цвета, яркости и контрастность с помощью окна Отображения регулировки (Edit | Показать настройку экрана) для выявления нитей, основанные на местных интенсивности контраст.
  3. Нажмите на иконку Добавить новую нитей и выберите алгоритм Autopath (не петля) в раскрывающемся меню.
  4. Выберите регион интерес (в данном случае, сегментации аксон интерес). Нажмите кнопку следующий после завершения.
  5. Определите точки начала и семян, назначив крупнейший и самый тонкий диаметр измерения, которые могут быть измерены с помощью режима срез .
  6. Назначьте точку отсчета на краю региона интерес. Для достижения ручного добавления или удаления отправной точки, сначала изменить режим указателя (Navigate | Выберите) и затем Shift + щелкните правой кнопкой мыши на интересующие вас вопросы.
  7. Выберите ручной пороговые значения для семян точек обеспечить, что все видимые арборизация помечен. Изменить режим указателя (Navigate | Выберите) и затем Shift + щелчок левой кнопкой в точках интереса вручную добавлять или удалять Семена точек.
    Примечание: Важно, чтобы вручную удалить фоновые шумы и сигналы из соседних нервов.
  8. Установите флажок удалить семена точек вокруг отправной точки.
  9. Проверьте, Удалить отключения сегментов разрешить исключение пунктов, которые слишком далеко и что может представлять фоновый шум. Указывает Максимальную длину разрыв на следующем шаге определить верхний предел для исключения.
  10. Отрегулируйте порог для вычитание фона, который использует фильтр Гаусса для оценки интенсивности фон каждого voxel.
  11. Автоматическое порога для диаметра дендритов, с использованием алгоритма приблизительное сечение .
  12. Пропустите шаги расчета позвоночника.
  13. Закончить процесс и выбрать нужный стиль и цвет.
  14. Снимите флажок тома в Свойства , чтобы просмотреть только реконструированный аксоны.
  15. На вкладке Статистика выберите Detailed. Использование накаливания нет Dendrite терминал точек для количественного определения двигательного нерва терминалов как индикатор мотор аксона арборизация.
    Примечание: Статистические заметки могут быть добавлены при необходимости.
  16. Экспортируйте образ реконструированный axon в формате .tif.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM предоставляет подробные 3D визуализация MN траектории и аксон арборизация в мыши эмбрионов. Под ярким полем тканей появляются полностью прозрачным после погружения в коммерческой очистки реагента. Нет усадки или припухлость образца было замечено после хранения в очистке реагента до изображений до одной недели. Под каналом флуоресценции моторные нейроны помечены transgenically выраженной GFP (фильм 1). В некоторых экземпляра сведения о структуре аксон оказываются под ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько шагов в протоколе могут подвергаться изменениям при определенных обстоятельствах. Например длительность фиксации зависит от возраста эмбрионов, колеблется от 2 h 1 или более дней, используя свежеприготовленные параформальдегида. Так как фиксация осуществляется до вся гора иммуноокрашивания, антитела, которые чувствительны к белка сшивки, метанол может использоваться как альтернативный фиксирующие агент. Для высокое соотношение сигнал шум после окрашивания, необходимо оптимизировать моющего средства концентрации...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM экспериментов и анализ данных проводились в части с помощью передовых оптических микроскопов службу отдела инструмент в Синика и при содействии г-жи Шу-Чэнь Шэн. Мы благодарим г-жа Сью-пинг ли от Imaging основного объекта IMB для значительной технической помощи с анализа изображений Imaris. IMB научных Английский редактирования основных рассмотрел рукопись. Эта работа финансируется Academia хвощевой карьеры развитию премии (CDA-107-L05), наиболее (104-2311-B-001-030-MY3) и национальных правозащитных учреждений (НПУ-EX106-10315NC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9::GFPThe Jackson labortory005029Соберите эмбрионы эмбрионального дня 12,5 (E12,5)
4% параформальдегида (PFA)На 200 мл: Добавьте 20 мл 10X PBS, 8 г PFA в ddH2O. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH (10N). Фильтр простерилизовать и хранить при температуре -20 °C.
Фосфатный буфер солевой раствор 10X (PBS 10X)На 1л: добавьте 80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na2HPO4, 2,4 г KH2PO4 и долейте ddH2O. Автоклав и хранить в компании RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
Фетальная сыворотка крупного рогатогоскота ThermoFisher26140079
овцы поликлональная анти-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 ослик против овецInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 очищающий реактивSunJin LabRC149001
1,5мл микро трубкаSarstedt72.690.001
24 лунки пластинаThermoFisher142475
5 SA Пинцетideal-tek3480641
Ирис Ножницы стриагт острый/острыйЭскулапBC110R
Микрохирургия Скальпели, одноразовыйЭскулапBA365
Препарирующий микроскопNikonSMZ800
ШейкерTKSRS-01
Lightsheet Z.1 микроскопCarl Zeiss Микроскопия
Imaris 8.4.0 программное обеспечение для анализа изображенийBitplane, Цюрих, Швейцария
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP мыши)Лаборатория Джексона005029

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
  4. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
  6. Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
  7. Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
  8. Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
  9. Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
  10. Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  12. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
  13. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
  14. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  15. Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
  16. De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
  17. Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685(2017).
  18. Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
  19. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
  20. Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor Axon NavigationLight Sheet MicroscopyAxon ArborizationMouse EmbryosHb9 GFP MiceImage Analysis SoftwareFilament QuantificationSample ClearingAntibody IncubationZ Stack Acquisition

Related Articles