Запись и модуляция активности эпилептиформный ломтиками грызунов мозга в сочетании с микроэлектродные массивы

Краткое содержание

Мы показывают, как выполнять запись и электрическая модуляция активности 4-aminopyridine индуцированной эпилептиформный грызунов мозга ломтиками, используя микроэлектродные массивы. Пользовательские записи камеры поддерживает ткани жизнеспособность на протяжении длительной экспериментальных сессиях. Живут электрода сопоставления и подбор стимулирующий пар выполняются с помощью графического пользовательского интерфейса.

Аннотация

Височная эпилепсия (TLE) является наиболее распространенных частичной комплекс эпилептического синдрома и наименее реагировать на лекарства. Глубокая стимуляция мозга (DBS) является перспективным подходом, когда медикаментозное лечение не или нейрохирургии не рекомендуется. Ломтики острый мозга в сочетании с микроэлектродные массивы (МЭС) представляют собой ценный инструмент для изучения их модуляции и нейронные сети взаимодействия по электрической стимуляции. По сравнению с обычными внеклеточного записи методов они обеспечивают дополнительные преимущества большее количество наблюдательных пунктов и известный межэлектродный расстояния, которые позволяют изучать пути распространения и скорость электрофизиологических сигналы. Однако оксигенации тканей может быть сильно ослабленным во время МПС записи, требующих высокой перфузии ставка, которая достигается за счет снижение соотношения сигнал шум и выше колебания в экспериментальной температуры. Электрическая стимуляция далее подчеркивает ткани мозга, что делает его трудно добиваться длительной записи/стимуляции эпох. Кроме того электрические модуляции активности мозга фрагмента необходимо целевых конкретных структур/пути в пределах срез мозга, требуя, что электрод сопоставление быть легко и быстро исполнена во время эксперимента. Здесь, мы показывают, как выполнить запись и электрическая модуляция 4-aminopyridine (4AP)-индуцированной эпилептиформный активности грызунов мозга ломтиками, с помощью плоской МЭС. Мы показывают, что ткани мозга, полученных от мышей превосходит ткани мозга крысы и таким образом лучше подходит для экспериментов МПС. Этот протокол гарантирует, что создание и поддержание стабильной эпилептиформный шаблона, которая точно воспроизводит электрофизиологических особенностей наблюдается с обычными поле потенциальных запись, сохраняется в течение нескольких часов и выдержит устойчивый Электрическая стимуляция для длительной эпохи. Жизнеспособность тканей на протяжении всего эксперимента достигается благодаря применению малообъемной настраиваемую запись камеры, что позволяет для ламинарного потока и быстрое решение обмена даже на низких (1 мл/мин) перфузии. Быстрый МПС сопоставление для мониторинга в реальном времени и выбор стимулирующих электродов производится графический пользовательский интерфейс (GUI).

Введение

Эпилепсия является угрожающей жизни прогрессивным расстройство вызывает неконтролируемая активность мозга¹; оно носит среди высокого бремени болезней и значительное социальное клеймо^2,3. TLE является наиболее частым синдромом (40%) и наиболее часто (~ 30%) устойчивы к анти-эпилептических препараты⁴. Хотя хирургической аблации эпилептогенных ткани может улучшить состояние больного, это не осуществимо у всех больных и не может гарантировать полностью захват свободной жизни⁵. Модуляции эпилептические лимбической сетей, электрических DBS является перспективным подходом, когда медикаментозное лечение или нейрохирургии не подходят.

Грызунов мозга фрагменты являются ценным инструментом для изучения как нейрональных сетей функции в здоровье и болезни⁶ методами в vitro электрофизиологии, как они сохранить, по крайней мере в части, оригинальной архитектурой и подключения мозга регион(ы) интерес (ROI). В частности горизонтальной комбинированных гиппокамп entorhinal коры (гиппокамп EC) фрагменты составляют основные нейрональных сетей, занимающихся TLE и регулярно поэтому работают в vitro TLE исследований⁷.

Захват как деятельность может быть остро индуцированных в срезах мозга изменения ионного состава искусственного спинномозговой жидкости (ФАГО), такие как снижение магния при одновременном повышении калия^8,9,10, или с помощью фармакологических манипуляции, как блокировка ингибиторная активность ГАМК (см.¹¹ для проведения всеобъемлющего обзора). Однако эти модели основаны на несбалансированные изменения возбуждения и торможения; Таким образом они не позволяют изучать взаимодействия и согласованных вклад возбуждающих и тормозной сетей для ictogenesis. Непрерывное перфузии мозга фрагментов с 4AP судорожного наркотиков повышает возбуждающих и тормозящий синапсах, таким образом позволяя учиться острый ictogenesis при сохранении синаптической активности в целом¹².

МЭС разрешить запись электрической активности, порожденных нейрональных сетей от большего числа наблюдательных пунктов по сравнению с потенциальным обычных внеклеточного поля записи, где пространственные ограничения ограничивают количество электродов, которые могут быть размещение на поверхности среза головного мозга. Кроме того МПС чипы предлагают дополнительное преимущество известных межэлектродный расстояния, что очень полезно для распространения трассировки и оценить путешествия скорость записанных сигналов. Хотя первоначально задуманный для записи от искусственного нейронов^13,14, МЭС теперь также используются для характеристики электрофизиологических особенности острого мозга фрагментов, полученных от грызунов люди¹⁵ и¹⁶. Таким образом в контексте исследований эпилепсии, МПС представляют собой ценный инструмент для точного определения нейрональных сетей взаимодействия в ядро ictogenesis^16,17,18.

Однако МПС записи по своей сути носит технические проблемы в получении или сохранении стабильной эпилептиформный шаблон всей экспериментальной протоколы долго (несколько часов). Во-первых оксигенации тканей может не быть адекватным в большой и круглый погруженной тип записи камеры^19,20 типичный коммерчески доступных МЭС, в то время как плохое отношение сигнал шум и нестабильность температуры могут повлиять на качество записи, когда скорость высокая перфузии (6-10 мл/мин) используется для улучшения поступление кислорода в мозг фрагмент (см., например, технические заметки на отопление и перфузии оборудование²¹). Во-вторых, рецидивирующий сбросов, показывая высокочастотные компоненты, такие как эпилептиформный сбросов, вряд ли наблюдаются при использовании погруженной тип записи камер¹⁹; Это особенно касается когда картина острого эпилептиформный химически индуцированных и включает в себя ephaptic механизмов, как это случается для 4AP модель²² (см.¹¹ за всесторонний обзор). Чтобы преодолеть эти ограничения, исследователями были предложены несколько стратегий. Например увеличение^19,скорость перфузии²⁰ при одновременном снижении толшины мозга (≤300 мкм) и площадь^17,18 являются важнейшими факторами для достижения адекватной кислорода в ткани. Кроме того улучшение мозга ломтик жизнеспособность также может осуществляться с помощью перфорированных МЭС (pMEAs), которые позволяют perfusing мозговой ткани с обеих сторон¹⁸.

В то время как описанные подходы значительно улучшились возможности МПС записи из кусочков мозга, они не были проверены против длительное (несколько часов) записи и электрической стимуляции сессий, представляющих значительную стресса для ткани мозга. Длительной записи сессий может потребоваться для изучения эволюции во время конкретных особенностей эпилептиформный шаблонов, которые не удастся разоблачить краткосрочными измерениями. В контексте исследования DBS длительное экспериментальных протоколов может потребоваться оценить и сравнить эффекты нескольких стимуляции парадигмы в том же срез мозга.

Когда только спонтанной электрической активности необходимо регистрироваться, картирование электродов в отношении ROI обычно делается a posteriori, т.е., в ходе анализа данных; Вместо этого исследование вызванных ответов или электрических neuromodulation парадигм требует, стимуляции передаваться конкретным ROI(s), диктует необходимость быстро и легко жить электрода сопоставления во время эксперимента.

Здесь мы иллюстрируем простой экспериментальный протокол, который позволяет для индукция и поддержание стабильного 4AP-индуцированной эпилептиформный шаблона в взрослого мозга грызунов ломтиками. Наблюдаемые действия точно воспроизводит электрофизиологические характеристики этой модели как характеризуется с помощью обычных внеклеточного электрофизиологии методов. Он сохраняется в течение нескольких часов и выдержит постоянной электростимуляции для повторных длительной эпохи. Камеры, используемые для поддержания и инкубации срезов мозга могут быть легко собраны с использованием стандартных лабораторных принадлежностей (рис. 1а), тогда как настраиваемую запись камеры, позволяющие оптимальное решение обменного курса и ламинарного потока (рис. 1B) быть получены из коммерческих источников или с использованием 3D технологии печати по доступной цене. Быстрое отображение ROI(s) для мониторинга в реальном времени и выбор стимулирующих электродов стало возможным благодаря пользовательских удобный GUI, названный mapMEA, свободно доступны по запросу.

Рисунок 1: Custom оборудование, используемое для этого протокол. (A) проведение камеры для восстановления, предварительно потепления и предварительной инкубации в 4AP собраны с использованием стакан и чашку Петри. Петри блюдо должно быть меньше в диаметре, чем выключатель и удерживается на месте с помощью поршень шприца. В нижней части Петри блюдо заменяется нейлоновая сетка (от мягкого чулки) склеивают Цианакрилатный на ободе Петри. Кислород поступает через изогнутых спинальной иглы (22 G), вставлены между стенами Петри и стакан. Пузырьки должны выходящих из стороны стакан и никогда не достичь нейлоновая сетка, чтобы избежать перемещения срез мозга. В верхней части чашку Петри может использоваться как крышкой чтобы избежать испарения фаго и поддерживать насыщение кислородом. (B) пользовательские записи камеры. в: водохранилище входе для размещения канюля Отопление и электрод сравнения. из: водохранилище розетки для размещения всасывающей иглы. REC: запись камеры. (C) стекла Пастер пипетку, свернувшись, огонь полировка, используются для обработки ткани и отрегулируйте его положение внутри записи камеры. (D) пользовательский фрагмент удержание якорь. (E) окончательная сборка запись камеры смонтированы на чип МПС. Срез мозга лежит на дне, удерживается на месте якорь. Красная стрелка указывает PTFE Шланги, охватывающих Отопление канюля, а красный круг электрод сравнения, насыщенный гранулы KCl затопленными фаго в впускного коллектора. Синяя стрелка указывает всасывающей иглы в выходе водохранилище. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены министерством здравоохранения (авторизация n. 860/2015-PR) Италии в соответствии с директивой ЕС 2010/63/EC на животных.

1. Подготовка Ассамблеи МПС/Custom камеры

Примечание: Начало 2 дня до эксперимента. Используйте МПС без кольца (см. Таблицу материалов).

1. Очистить МПС (длительность: 35-40 мин.).
   1. Ферментативной чистых порошка Растворите в теплой дистиллированной воды. Чистить теплым моющего раствора на поверхность МПС, а затем замочите МПС в теплой, чистящий раствор для по крайней мере 3 h.
   2. МПС с дистиллированной водой, тщательно сполосните и высушите его с помощью безворсовой без нуля ткани.
2. Соберите МПС с камерой запись (продолжительность: 10 min + ночевка).
   1. Равномерно эластомерный герметик на нижней поверхности записи камеры. Убедитесь, что есть никаких пузырей.
   2. Монтировать камеры запись на МПС с помощью пинцета и применить нежное давление. Если есть любые пузыри, слегка переместите камеру в круг при применении мягкое давление пальцами, пока все пузырьки исчезли. Нанесите герметик слой весь путь вокруг внешней границы записи камеры.
      Примечание: критических! Не накрывайте МПС контакты с герметиком.
   3. Место Ассамблеи МПС/камеры внутри 15 см Петри. Место 5 мл Петри или 10 мл стакан наполнен дистиллированной водой недалеко от МПС. Обложка все, чтобы поддерживать влажную среду. Пусть лекарство при комнатной температуре на ночь.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
3. Слой МПС сделать гидрофильные (продолжительность: 5-10 мин + ночевка).
   1. Поместите МПС в 15 см Петри. Налейте 50 мкл поли D-лизина на области записи МПС. Закройте чашку Петри, запечатать его с пленки для запайки и хранить на ночь при 4 ° C.
   2. Промойте МПС, тщательно с использованием дистиллированной воды и хранить МПС на 4 ° C в дистиллированной воде.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Покрытые МЭС могут храниться и повторно использоваться для нескольких экспериментов. Регулярно очистка и повторное покрытие МПС помогает удалить мусор, ткани и улучшить соотношение сигнал шум.

2. подготовка запасов решений

Примечание: Начало 1 день до эксперимента (продолжительность: ~ 2 h). Складе решения помогают ускорить эксперимент на экспериментальный день. Они могут быть подготовлены заранее и сохраняются. Приведена Таблица 1 концентрация фактор и композиции. Обратитесь к таблице 2 для состава окончательного решения.

1. Растворите химических веществ в дистиллированной воде при комнатной температуре. Фильтр акций решения с бутылкой фильтра (диаметр фильтра: 0.22 мкм).
2. Хранить при 4 ° C (см. таблицу 1 Рекомендуемые максимальный срок хранения).
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

3. Подготовка агар

Примечание: Начало 1 день до эксперимента (продолжительность: ~ 1 ч).

1. Залить 250 мл дистиллированной воды в стакан 500 мл и начать помешивая на 350 об/мин. Добавьте 5 g агар и подождать до тех пор, пока он полностью не растворится.
2. Нагрейте раствор на 250-300 ° C. Пусть вода испарится до тех пор, пока решение является ~ 200 мл приносить 2,5% w/v агар решение.
   Примечание: Температура должна быть достаточно высокой, чтобы выпарить без кипящей воды.
3. Залейте раствор Агар на 200 мл пластиковые квадратные коробки ~1.5 см высотой стены и дайте ему остыть при комнатной температуре до тех пор, пока она становится твердой.
4. Обложка коробки и хранить при 4 ° C. Агар блок хорошо в течение нескольких недель.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

4. Подготовка плоскости замороженные

Примечание: Начало 1 день до эксперимента.

1. Заполните чашу с плоским дном из нержавеющей стали с дистиллированной водой до 0,5 - 1 см ниже края.
2. Хранить при температуре от-20 ° C на ночь.

5. Подготовка нейропротекторной резки фаго

Примечание: Начало 1 день до эксперимента или в тот же день эксперимента (см. таблицу 1 и Таблица 2) (продолжительность: 30 мин).

1. Залить 200 мл дистиллированной воды в стакан 500 мл и начать помешивая, используя магнитную мешалку на 350 об/мин.
2. Добавьте 50 мл бульона B и 50 мл бульона C (см. таблицу 1).
3. Добавьте 3 мм пировиноградная кислота, сахароза 208 мм, 10 мм D-глюкозы и 1 мм L-Аскорбиновая кислота.
   Примечание: Фактический объем пировиноградной кислоты зависит от плотности и чистоте и могут изменяться с пакетом. Всегда, рассчитайте необходимый объем, при открытии новой партии.
4. Обложка с пленки для запайки и пусть движение за 30 мин.
5. Передавать объемные флакон 500 мл решение, добавьте дистиллированной воды, чтобы заполнить колбу.
6. Уплотнение объемный колбу с пленки для запайки и осторожно перевернуть 3 - 5 раз, до тех пор, пока решение равномерно ясно.
7. Перенесите резки фаго в стеклянной бутылке с крышкой.
8. Хранить резки фаго-80 ° C для 20-30 мин или на 4 ° C на ночь для охлаждения до 4 ° C.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь если на ночь охлаждения является предпочтительным. В противном случае время, необходимое для охлаждения режущих фаго могут быть использованы для продолжения шаг 6.

6. Подготовка холдинга фаго

Примечание: Подготовьте свежие решения в день эксперимента (продолжительность: 5-10 мин). Холдинг, фаго будет использоваться для полоскания срезы мозга от резки фаго во время нарезки процедуры (см. шаг 8.16) и длительного хранения срез мозга и предварительно потепления. Для полоскания срезы мозга, 100 мл холдинга фаго является достаточным. Проведение и предварительно потепления камеры, используемые в настоящем Протоколе на заказ и содержать объем 300 мл и 100 мл, соответственно (см. рис. 1A). С этой настройкой, 500 мл холдинга фаго является достаточным. Камер, получены из коммерческих источников, могут содержать различные тома, в котором случае общая сумма холдинга фаго должен быть подготовлен должны быть скорректированы соответствующим образом.

1. Залейте 200 мл дистиллированной воды в колбу объемные 500 мл.
2. Добавьте 50 мл бульона A, 50 мл бульона B, 6,5 мл бульона М и 1 мм L-Аскорбиновая кислота. Аккуратно агитируйте, с использованием вращающихся движений до тех пор, пока полностью не растворится L-Аскорбиновая кислота.
3. Добавьте дистиллированную воду, чтобы достичь окончательного объема, печать объемный колбу с пленки для запайки и осторожно перевернуть 3 - 5 раз, до тех пор, пока решение равномерно ясно. Обратитесь к таблице 2 для проведения фаго композиции.

7. Подготовка экспериментальной скамейки

Примечание: Это требует 15 мин, плюс 30 минут, чтобы получить устойчивый температура теплой ванны.

1. Запись скамьи
   1. Запустите теплую ванну, установите его до 32 ° C и покрыть ее для поддержания ее температуры.
      Примечание: Теплая ванна, используемые в настоящем Протоколе может быть на заказ с использованием жесткий пластиковый ящик и аквариум термостат предустановленных на требуемую температуру. Устойчивый желаемого температура может быть достигнута в ~ 30 мин, начиная от комнатной температуры. Поскольку заранее потепления и формирования палат сидеть в нижней части окна пластиковые, уровень воды должен быть просто достаточно, чтобы покрыть термостат для того чтобы держать камер от плавающих.
   2. Соберите холдинга и предварительно потепления камер (см. рис. 1а) и залить Холдинг фаго в них. Холдинг камеры при комнатной температуре и помещение предварительно потепления камеры внутри теплую ванну. Начало восходящей решения с 95% O₂/5% CO₂ газовой смеси и удалите любые захваченные пузыри Перевернутый пипетка Пастера. Храните покрыты.
2. Нарезка скамейке и vibratome
   1. Приклейте небольшой агар блок на центре предметных стёкол, используя Цианакрилатный клей.
   2. Положите 250 мл стакан в ведёрке со льдом и вылить резки фаго в него.
   3. Возьмите два 100 мл мензурки и залить 50 мл холдинга фаго в каждой. Оставьте мензурки при комнатной температуре. Это промывки мензурки.
   4. Начало восходящей решения с 95% O₂/5% CO₂ газовой смеси.
   5. Смонтировать панели буфера на vibratome и окружают его с дробленым льдом. Залейте некоторых этанола на дробленый лед для помощи в поддержании низких температур во время нарезки процедуры. После заливки этанола добавьте еще льда при необходимости.
      Примечание: Температура 2 ° C является оптимальным.
   6. Место барботер внутри панели буфера, а затем собрать и смонтировать лезвие блок vibratome.
      Примечание: Убедитесь, что лезвие монтируется под углом Распродажа ~ 10°.
   7. Положите дробленый лед в 500 мл стакан 2/3 объема и заполнения с дистиллированной водой.
   8. Взять чашу замороженные из морозильника, разместить его вверх вниз на нарезки скамейке и покрыть ее с бумажным полотенцем и диск фильтр-бумаги.
3. Анестезия скамьи
   1. Место небольшой миске в лоток, льдом и вылить резки фаго в нем. Начало восходящей с 95% O₂/5% CO₂ газовой смеси.

8. мозг срез подготовка и техническое обслуживание

Примечание: Этот протокол использует взрослого (4 - 6 недель старый) CD1 мышей-самцов, но другие штаммы (например, c57/bl6^17,18) может быть использован. Мы также позже сравнить экспериментальной вывода, полученные с помощью срезы мозга мыши с этим принесли мозга фрагментов, полученных от крысах Sprague-Dawley того же возраста. Следующие действия ссылаются к подготовке частично отключены мозга ломтиками в которых CA3-driven быстро межприступная как деятельность сдерживается в гиппокампе надлежащего и не может распространить парагиппокампальной коре, как описано в²³. Гиппокамп коры отключение является предпосылкой продолжать исследования электрических модуляции в использовании подготовки срез мозга гиппокамп EC. Vibratome используется относится к модели, перечисленные в Таблице материалов. Другие модели может потребоваться различные процедуры.

1. Анестезировать грызунов с помощью изофлюрановая 5% в Карбоген газовой смеси, доставлены в камеру индукции анестезии в 2 Л/мин.
2. Глубокие анестезию (нет рефлексов в ответ на ноги и лапы пинча), экстракт мозга в течение 1 мин, после стандартных процедур как в²³. Поместите мозга в небольшой миске, содержащие уравновешенной ледяной резки фаго и пусть холод в течение 90-120 с.
   Примечание: Не позволяйте мозг охлаждения слишком долго, иначе она может замерзнуть.
3. Наливайте ледяной резки фаго в буфер лоток. Спред резки фаго на фильтровальной бумаге размещены на замороженных чаши. Место мозг на фильтровальную бумагу и изолировать блока ткани требуется мозга, удалив мозжечка и вырезания прямой фронтальной полюса.
4. С помощью изогнутых шпателем клей спинной стороне мозга на диск образец отрезока фронтальной стороной агар блока и затылочной полюсом vibratome лезвие с. Используйте тонкий слой Цианакрилатный клей. Место предметных стёкол в панели буфера сразу и закрепите его.
5. Отрегулируйте секущей диапазон, чтобы переместить лезвие vibratome весь путь через ткани до блока агар. Отрегулируйте высоту диск образца для достижения уровня лезвие с блоком ткани мозга.
6. Отбросить разделов ткани до тех пор, пока гиппокампа отчетливо виден (обычно ~ 900 мкм). Затем установите толшины 400 мкм и нарезки сохранить разделах ткани. Для каждого раздела мозга Сплит двух полушарий и обрезать ненужные ткани, чтобы получить два кусочка мозга. Как буфер лоток усиливается во время последующих разделов, заполните лоток ложементом буфера с ледяной дистиллированной водой (см. шаг 7.2.7).
7. Используйте Перевернутый пипетка Пастера мягко передавать срезы мозга в первой промывки стакан, пустые пипетка Пастера и передать второй промывки стакан срезы мозга. Затем передачи срезы мозга в холдинг камеру и пусть они восстановить для по крайней мере 60 мин.
   Примечание: Это обычно можно получить срезы мозга 6-8 общего. Протокол может быть приостановлена здесь.

9. Подготовка фаго, содержащих 4-AP (4AP-фаго)

Примечание: Это требует 10 мин для подготовки, плюс 20 минут потепления. Осторожно! 4-AP судорожного наркотиков и токсичен. Ручка с перчатками и избежать разлив.

1. Залейте 200 мл дистиллированной воды в колбу объемные 500 мл.
2. Добавьте 50 мл бульона A, 50 мл бульона B, 5 мл бульона М и 1 мм L-Аскорбиновая кислота. Аккуратно агитируйте, с использованием вращающихся движений до тех пор, пока полностью не растворится L-Аскорбиновая кислота.
3. 500 мкл 4AP запасов.
4. Добавьте дистиллированную воду, чтобы достичь окончательного объема, печать объемный колбу с пленки для запайки и осторожно инвертировать его 3 - 5 раз, до тех пор, пока решение равномерно ясно.
5. Соберите 4AP инкубирования камеры (см. рис. 1A) и налить ~ 80 мл 4AP-фаго в него. Обложка палата, передача его в теплую ванну и начать пузырьков с 95% O₂/5% CO₂ газовой смеси. Удалите все захваченные пузыри Перевернутый пипетка Пастера. Храните покрыты.
6. Подождите, пока температура 4AP-фаго-30-32 ° C (~ 20 мин).
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь если срезы мозга еще не оправилась.

10. предварительно потепление и инкубации срезов в 4AP (продолжительность: 90 мин.)

1. Проверьте, что предварительно потепления фаго и 4AP-фаго температура 30-32 ° C.
2. Используйте Перевернутый стеклянной пипетки Пастера для передачи 1 ломтик мозга в предварительно потепления камеру и пусть остальные ткани для 25-30 мин. Затем перенести срез мозга в 4AP-фаго инкубирования камеру и дайте ему отдохнуть в течение 60 мин.

11. Подготовка Set-up МПС

Примечание: Начало 15 мин до начала записи.

1. Перенос оставшихся объем 4AP-фаго в 500 мл колбу Эрленмейера.
2. Место колбу Эрленмейера на полке над усилитель МПС и использовать трубы, чтобы позволить решения постоянно кормить 60 мл шприц. Отрегулируйте высоту колбу Эрленмейера и шприц разрешить самотечных скоростью 1 мл/мин.
   Примечание: Правильный высота зависит от трубы внутреннего диаметра (ID). Для трубок 5/32 дюймов ID, 30 см, являются достаточными.
3. Начало восходящей 4AP-фаго в колбу Эрленмейера и шприц с 95% O₂/5% CO₂ газовой смеси.
4. Пусть 4AP-фаго поток через НКТ перфузии в стакан до там это не воздух внутри; затем остановите поток раствора.
5. Подключите нагревательный элемент на базе МПС к термостату. Место сухой МПС чип внутри усилителя МПС и зафиксируйте усилитель-голова. Пластиковая пипетка Пастера используйте для передачи 4AP-фаго на входе и внешний резервуар записи камеры.
6. Обеспечить Отопление канюля с магнитным держателем и поместите его кончик запись камеры впускное отверстие; Прикрепите магнитный держатель для магнитной полосы на голове усилитель МПС; подключение трубки перфузии канюля; Подключите канюли в термостат.
   Примечание: Отопление канюля должны быть охвачены скошенный политетрафторэтилена (ПТФЭ) труб до записи камеры впускное отверстие и свести к минимуму шум из-за металлического материала канюли. Когда адекватно входе водохранилище заполняется с 4AP-фаго, капли, падающие с перфузии системы не должны быть видимыми.
7. Место всасывающей иглы внутри резервуара и убедитесь, что есть отрицательное давление, погружаясь всасывающей иглы в фаго; Проверьте наличие постоянного низкочастотного шума всасывания.
   Примечание: Всасывающей иглы должны помещаться позволило 4AP фаго потока просто на поверхности мозга срез. Вакуумная линия или вакуумный насос малошумящих может использоваться.
8. Установите регулятор потока позволяют скорость потока 1 мл/мин и начать perfusing.
   Примечание: Самотечных перфузии устраняет шум, который может быть вызвана перистальтических насосов; Если перистальтические насосы являются предпочтительными, низким уровнем шума модели являются обязательными.
9. После 4AP-фаго течет через канюлю, включите термостат. Установите Отопление канюля 37 ° C и МПС базу до 32 ° C до достижения температуры 32-34 ° C внутри записи камеры.
   Примечание: осторожно! Никогда не тепла канюля без решения, он или она может быть поврежден необратимо. Установите температуру канюля, выше, чем температура записи (т.е., 32-34 ° C) для учета для смещения внутренней температуры между заданным значением и фактическое значение на кончике канюля Отопление и внутри записи камеры. Скорости потока, температуры окружающей среды и объем записи камеры все влияние температуры раствора записи. Параметры, полученные на шаге 11,9 оптимизированы для описанных протокол и оборудования. Всегда проверяйте температуру фактической записи с помощью термопары и при необходимости измените настройки. Не разогревайте МПС база выше 34 ° C, чтобы избежать перегрева срез мозга.
10. Место электрода внешней ссылки в запись камеры входе водохранилище.
    Примечание: Хотя МЭС фишки оснащены внутренней ссылки электрода, это рассматривается Палатой пользовательские записи. Таким образом необходимо использовать электрод внешней ссылки. Насыщенный гранулы хлористого калия является наиболее практичным, так как это готовый к использованию без необходимости для хлорирования.

12. МПС живут картирование

1. Как только уровень 4AP-фаго и записи температуры стабилизируются как желаемое, поворот перфузии и всасывания запорные краны в положение выкл, чтобы временно остановите их.
   1. Быстро передавать один срез мозга в отсек МПС записи с помощью Перевернутый стеклянной пипетки Пастера. Скорректировать свою позицию на области записи МПС как необходимой помощью пожар полированные свернувшись Пастер пипетки (рис. 1 c) или компактных мягкой щеточкой. Место прижимной Анкер (рис. 1 d) на срез мозга. Перезагрузите перфузии и всасывания, повернув их запорные краны обратно в положение.
      Примечание: критических! Срез должен быть переведены, и перфузии возобновляется в течение 60 s или ткани может умереть. Якорь удержание фрагмента должны храниться в 4AP-фаго чтобы предотвратить перемещение при размещении якорь на срез мозга из-за различий в поверхностного натяжения срез мозга. Якорь для защиты мозга срез на МПС может быть на заказ с использованием нержавеющей проволоки и нейлона потока (рис. 1 d) или получены из коммерческих источников. 1E рисунок показывает окончательный экспериментальной установки с МПС чип подключен к усилитель головы: кусочек мозг отдыхает на чипе МПС в зале записи удерживается на пользовательской привязки. Электрод сравнения (красный кружок) и PTFE Шланги, охватывающих Отопление канюля (красная стрелка) расположены в впускного коллектора, тогда как всасывающей иглы (синяя стрелка) позиционируется в выходе водохранилище.
2. Сделайте снимок на срез мозга с помощью камеры, установленной на сцене инвертированным микроскопом.
3. Запустите сценарий mapMEA на компьютер программное обеспечение для запуска GUI для сопоставления электродов.
   Примечание: Заказное программное обеспечение позволяет пользователю выбрать электродов, которые соответствуют конкретные структуры мозга фрагмента. Этот шаг имеет решающее значение для активировать правильный путь и пресекать деятельность, приступ с помощью электрической стимуляции.

Рис 2: GUI для жить MEA электрода картирования. (A) схематическое представление фрагмента комбинированных гиппокамп EC, позиционируется на МПС. По умолчанию структуры, используемые для этого протокола являются корню ammonis 3 (CA3), enthorinal коры (EC), perirhinal коры (ПК) и subiculum (суб). Электрод сравнения схематизируются как маркер треугольник. Электроды, окруженных в пунктирные линии представляют координаты XY для выпрямления изображений. Захват экрана (B) графического интерфейса во время живой сопоставления МПС. Блок-схема в левой части записи указывает шаг за шагом процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. Нажмите кнопку Обзор , чтобы загрузить изображение на срез мозга. Убедитесь, что электрод сравнения отображается в верхней строке левой половины МПС (рисунок 2A, Марк треугольник). Нажмите кнопку Активировать указателя , затем выберите верхней и нижней электродов в строке слева массива в ознаменование XY координаты для выпрямления изображений и сопоставления электрода.
5. Выберите из раскрывающегося меню тип фрагмента горизонтальных. Отметьте флажок по умолчанию структуры .
   Примечание: Это возможно для настройки структуры, выбрав кнопку Ввод новых структур . Структуры по умолчанию для горизонтальной мозга ломтик изображены на рисунке 2A.
6. Использование нумерованных кнопок ниже фотография срез мозга, выберите электродов, соответствующий ROI и нажмите соответствующую кнопку на панели структуры, чтобы назначить их (рис. 2B); Повторите этот шаг для каждого ROI.
7. Нажмите кнопку сохранить : программное обеспечение генерирует результат папку с именем #EXP_LabelledElectrodes содержит таблицы отчетности отдельных электродов и трансформирования.

13. запись и электрическая модуляция активности эпилептиформный

1. Разрешить срез мозга для стабилизации внутри камеры запись 5-10 мин до начала записи.
2. Включите стимул подразделение по крайней мере 10 минут до стимуляции протокол, чтобы самокалибровки и стабилизации. Запустите программное обеспечение управления стимул и убедитесь, что стимулятор и МПС усилитель правильно подключены как указано зеленый светодиод в главной панели программного обеспечения управления стимул. Пожалуйста, обратитесь к руководствам конкретных инструментов и программного обеспечения для получения дополнительной информации, см. Таблицу материалов.
3. Настройка стимуляции в Биполярный конфигурации. Выберите электрода пар при контакте с слоя пирамидальных клеток СА1/проксимальный subiculum (Организация "СР^24,25") среди сопоставленных с сценарий mapMEA (см. раздел 12). Используйте провод для подключения одной из выбранных электродов отрицательных штепсельной вилки стимулятор и другой электрод для положительных вилка один и тот же канал стимулятор. Используйте другой провод для подключения местах стимулятор на землю усилителя.
4. Запустите программное обеспечение для записи. Для получения данных, нажмите кнопку играть в главной панели записи программного обеспечения. Запись по крайней мере 4 приступ разрядов.
   Примечание: Частота дискретизации 2 кГц позволяет приобретать потенциалов поля с справедливой резолюции при минимизации использования места на жестком диске. 5-мин записи файла занимает ~ 80 МБ. Могут потребоваться более высокие частоты выборки, например, для записи стимул артефактов или многоквартирных деятельности. Соблюдать только потенциалов поля, используйте живой фильтр НЧ-300 Гц с обрезают многоквартирных деятельности.
5. Определения интенсивности стимула.
   1. В программном обеспечении управления стимул используйте главной панели для разработки квадратный двухфазный положительный отрицательный текущей длительности импульса 100 МКС/фазы.
      Примечание: осторожно! Постоянного тока стимуляции требует сбалансированного заряда импульса, чтобы избежать повреждения оборудования.
   2. Теста быстрого ввода/вывода (ввода/вывода) для выявления лучших интенсивности стимула. Доставить импульса стимуляции, разработанный на шаге 13.5.1 0,2 Гц или ниже добавления интервала между импульса 5 s или больше в соответствующей форме программного обеспечения управления стимул. В закладке амплитуда импульса введите амплитуда первоначального импульса 100 мкА/фазы и увеличить на 50-100 мкА шаги на каждом суде до стимуляции могут надежно вызывают события межприступная как в коре парагиппокампальной (Проверка сигналов визуализированное программное обеспечение для записи).
6. Электрическая модуляция лимбической ictogenesis
7. Программа блок стимул для доставки протокола стимуляции интереса. Используйте амплитуды стимулов, выявленные в ходе тестирования операций ввода-вывода.
   Примечание: Отказов, вызванных ответов должно быть ≤20%.
8. После стимуляции останавливается, проверьте сеть восстановление до состояния предварительное стимулом, записи по крайней мере 4 приступ сбросов (как в шаге 13.4).

Результаты

Вселенский МЭС с 6 x 10 макета и интервал электрода 500 мкм являются идеальным записывающее устройство для экспериментальный протокол, описанных здесь, поскольку области их записи охватывает протяжении срез мозга во всей его полноте (рис. 3A, см. также¹⁷). Хотя перфорированные МЭС (pMEAs) было бы предпочтительнее улучшения оксигенации тканей, их области записи слишком мал (~ 2 мм в диаметре). Это не позволяет одновременное визуализации электрические сигналы, генерируемые гиппокампа и парагиппокампальной коре (данные не показаны; см.¹⁸).

Наблюдаемые 4AP-индуцированной эпилептиформный шаблон (рис. 3A) точно воспроизводит то, что обычно наблюдается в этой модели в пробирке , с использованием обычных поле потенциальных запись и состоит из трех видов деятельности^{7, 26}: приступ как события (я) (рисунок 3B, стрелок) являются надежные долгосрочные (> 20 s, диапазон: 20-60 s) события, напоминающие электрографические функции захвата активности с тонизирующим и клонические компонентов (рис. 3 c); они создаются в коре парагиппокампальной каждые 3-5 мин и повторно ввести гиппокампа формирования через зубчатой извилины (Рисунок 3D, стрелки); (ii) медленно межприступная подобных сбросов (рис. 3Б, EC трассировки, черная полоса; расширенный в рисунке 3E) короткие (< 1 s) населения события, созданные между противоречивых событий повсеместно в рамках подготовки срез мозга гиппокамп EC и происходит медленными темпами (диапазон 10-30 сек); (iii) быстромежприступная подобных сбросов (рисунок 3B, CA3 трассировки, черная полоса; расширен в рисунке 3E) являются периодические краткие (< 1 s) населения события, генерируемые CA3 subfield гиппокампа; когда сохраняются Шаффер коллатералей, быстро CA3-управляемый межприступная события распространяются вдоль гиппокампа цикла и оказывают анти ictogenic эффект²⁴ (данные не показаны); чтобы предотвратить приступ деятельность очистки, для целей протокола описаны CA3 вывода нарушается (см. рисунок 3B, E). Необходимо отметить, что быстро CA3-управляемый межприступная деятельности, записанные с помощью МЭС происходит более медленными темпами (~ 0,4 Гц) чем то, что наблюдается с использованием обычных месторождений, записи с помощью пипетки стеклянные (~ 1 Гц, диапазон: 0.5 - 2.0 Гц, данные не показаны).

Успешный исход электрических neuromodulation ломтиками грызунов мозг зависит от активации²⁷ конкретных нейронов пути вместе с внутренней связности среди регионов, входящих в подготовку²⁴. Мы протестировали фрагментов, полученных от взрослых самцах Sprague-Dawley и CD1 мышей и мы нашли что мышь вместо того, чтобы срезы мозга крысы предлагают лучший компромисс между размер, толщину и встроенные подключения. Во-первых, благодаря их меньшего размера, они соответствуют области небольшой записи коммерчески доступных МЭС лучше (рис. 4A, слева: Крыса, справа: мышь); Во-вторых, они являются более устойчивыми к неблагоприятное условие, присущи МПС записи (см. Введение): Хотя приступ подобных сбросов порожденных этими двумя ткани (рис. 4B) же срок действия ()4 c рисунок слева), скорость их появления значительно короче в срезах мозга мыши (n = 10 ломтиков видов; 2-хвост непарных t теста, p < 0,001; Рисунок 4 c справа). Последний позволяет ускорение экспериментальных протоколов, что позволяет тестировать большее количество срезов мозга во время один экспериментальный день: для этого набора представительных результатов, мы могли проверить такое же количество срезов мозга от двух видов (Крыса: n = 58; мышь: n = 52), но количество мышей (n = 18) было вдвое меньше, чем количество крыс (n = 42).

Кроме того срезы мозга мыши представляются с плотной соединения и поэтому более вероятно, чтобы лучше реагировать на устойчивый электрического neuromodulation (рис. 4 d). Таким образом в этом в vitro модели ictogenesis, жизнеспособность для электростимуляции, направленных на сдерживание приступ активность значительно больше для мыши чем для ткани мозга крысы. Этот аспект также отражается на значительно более высокий коэффициент успеха стимуляции эксперименты, проведенные с помощью мыши против срезы мозга крысы, даже когда проводит несколько протоколы постоянной стимуляции ()Рисунок 4E). В самом деле ткани мозга мыши, по-видимому, лучше противостоять постоянной электростимуляции предложенное выше выживаемость сроки испытания экспериментальной-4 ч (Рисунок 4F). Таким образом меньший размер вместе с лучшей сохранности встроенные подключения делает срезы мозга мыши наилучшим кандидатом для выполнения МПС, запись направлены на изучение гиппокампа парагиппокампальной сети взаимодействия и оценить электрические neuromodulation протоколы, которые имеют отношение к TLE.

Периодические ходить в subiculum СА1 известен для управления лимбической ictogenesis в 4AP-лечение гиппокамп EC ломтик подготовка^24,25,27, с 1 Гц, как наиболее эффективные частоты²⁷. Таким образом это также полезно как позитивный элемент управления для оценки эффективности и действенности политики других neuromodulation (см., например,²⁵). Как упоминалось выше, электрические импульсы, непосредственно через МПС (то есть, без необходимости внешнего стимулирования электрода) может вызвать реакции населения в грызунов мозговой ткани (см. также пункт²⁸). Достаточные сохранении нейронной сети в пределах срез мозга, точное позиционирование срез мозга на МПС и правильный выбор стимулирующий пар электродов позволяют проводит электрические neuromodulation эксперименты, эффективно управлять ictogenesis. Как показано на рисунке 5А, его можно воспроизвести канонические 1 Гц периодические электрокардиостимуляции протокол с использованием плоских МЭС, как запись, так и стимулирования устройство, с дополнительным преимуществом, что эффект электрической стимуляции могут быть визуализированы на протяжении мозг ткани секции с более высоким номером одинаково размеченные наблюдательных пунктов по сравнению с потенциальных запись обычных полей. Рисунок 5B показывает количественная оценка результатов, полученных для n = 9 срезы мозга, указанием значительное сокращение общего захвата время (всего приступ деятельности продолжительность/наблюдения время²⁵) во время стимуляции (один способ ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0.01, пост Специальный тест Фишера ЛСД, защищенные). Результаты согласуются с литературой для внешних стимулирующие электроды^24,25.

Для вычисления всего, захватив время, время наблюдения зависит от интервала между противоречивых событий, и он также определяет минимальную длительность стимуляции протокола необходимо уверенно оценить эффекты neuromodulation. Мы находим, что записи по крайней мере 4 приступ сбросов (и таким образом по крайней мере 3 интервалы между противоречивых событий) это хороший компромисс между собранных образцов и требуется время. В состоянии элемента управления (то есть, без стимуляции) время наблюдения является разрыв между наступления первого измеренного приступ события и прекращение последнего. Во время neuromodulation время наблюдения равняется продолжительности протокол стимул, так как цель оценки заключается в количественном определении явления, происходящие на протяжении всего времени, что возмущения вводится в систему. Вычисления и сравнения общего захвата время вместо продолжительность и интервал противоречивых событий является наиболее подходящим параметром избежать тип II ошибку. В самом деле наряду с полным подавление приступ активности, это также возможно, что только один приступ событие генерируется во время электрической стимуляции отличие от нескольких событий наблюдается в состоянии элемента управления. В этом случае в то время как измерительный интервал между событиями не возможен, измерения во время как Оценщик эффективности стимуляции не представляют собой фактический результат neuromodulation (т.е., снижение иктальный активности).

В целом представленные здесь результаты указывают, что мыши мозга ломтики в сочетании с МЭС, являются ценными инструментами для исследований эпилепсии и выполнять надежный neuromodulation исследования, имеющие отношение к продвижению поля БД для лечения эпилепсии. Кроме того протокол, описанные здесь повышает жизнеспособность срез мозга и позволяет реализации экспериментальных сессий на несколько часов (рис. 6), в которых может потребоваться, например, для того чтобы сравнить эффекты различных электростимуляции парадигмы.

Рисунок 3 : Типичный 4AP-индуцированной эпилептиформный шаблон визуализированы с плоских измерительных (A) мыши мозга срез, расположены на плоских МПС 6 x 10 (расстояние между электродами: 500 мкм) и обзор бок о бок 4AP-индуцированной эпилептиформный шаблона визуализации с записью МПС. Каждый квадрат в сетке вмещает действия, записанные в соответствующем месте в пределах срез мозга. Линий относятся к строкам электрода для большей ясности. Номер записи электрода идентифицируется синим цветом в левом верхнем углу каждого квадрата. Серый, пересекли квадратных представляет электрод сравнения. (B) представитель трассировки сегменты структур ЕС и CA3 визуализирована в масштабе времени быстрее. Стрелки указывают противоречивых событий. В трассировке EC это можно оценить возникновение медленного межприступная сбросов (черный бар), тогда как CA3 subfield генерирует типичный устойчивого fastinterictal шаблон (черная полоса). (C) расширены записи приступ разряда, показаны типичные тонизирующий клонические шаблон. (D) быстро шкала визуализации предварительного-ictal-к во перехода соответствующего EC (красный) и CA3 (черный) трассировки сегментов отмечен красной бар (b). Стрелка указывает начало приступ разряда. Накладывается следы подчеркнуть, что приступ событие происходит в ЕС и впоследствии распространяет в подполе CA3. (E) расширенное представление межприступная периодов, отмечен черные полосы в (B) подчеркивает отсутствие корреляции между медленным и fastinterictal модели, генерируемые EC (красный) и CA3 (черный), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Срезы мозга мыши предлагают выше экспериментальный выход чем срезы мозга крысы. (A) мозг фрагмент из крыса (слева) и мыши (справа) соответствует возрастов. Срез мозга крысы гораздо больше, чем области записи МПС и его электрической активности не могут быть визуализированы в полном объеме. (B) прямого визуального сравнения повторяющихся приступ, порождаемый мыши и крысы enthorinal коры (EC). (C) Срезы мозга крыс и мышей генерировать приступ сбросы аналогичных продолжительностью, но интервал между этими событиями является почти в 2 раза в крыса мозговой ткани. * p < 0,05. Предложение (.D), по сравнению с крысами, мышами, 2 раза выше доходность срезы мозга жизнеспособным для электростимуляции экспериментов, направленных на борьбу с ictogenesis. Электрическая стимуляция subiculum может вызвать реакции населения в коре парагиппокампальной в только 20 58 крыса (34%) мозга ломтиками, 33 52 (63%), в отличие от мыши мозга фрагментов (Чи²: 9.22; p = 0,002). p < 0,05. (E) среди жизнеспособных ломтиков, процент успеха в контроля активности во 2 раза с мыши против срезы мозга крысы (мышь: 20 33 срезы мозга, 60%: крыса: 6 20 мозга ломтики, 30%; Чи²: 4.67; p = 0,03). p < 0,05. Мыши (F), срезы мозга может выдерживать неоднократные длительной эпохи постоянной электростимуляции (серо затененных областей). После вывода стимул, ткани мозга мыши экспонатов полного восстановления эпилептиформный шаблона, тогда как жизнеспособность тканей мозга крысы падает резко в 3 ч. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Представитель эксперимент электрических модуляции ictogenesis с помощью срезы мозга в сочетании с измерительных (A) записи 4AP-индуцированной приступ деятельности в ЕС и ПК во время контроля состояния (без стимуляции), периодически ходить (ПП) 1 Гц (стимул артефакт усекается) и во время восстановления после вывода стимул. (B) количественная оценка влияния PP на 1 Гц на общей, захватив время. p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Представитель длительной записи 4AP-индуцированной приступ деятельности. Trace (A) сегментов записанных 8 ч после нарезки процедуры мозга и следующие 2 h приложения 4AP. (B) Расширенная трассировка сегменты, соответствующие штучной приступ сбросов определенных букв , bи c панели () показывают последовательность созданных приступ деятельности на протяжении всего длительного наблюдения время вдова. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Складе A	Химическая	Молекулярная масса	Концентрация (мм)
	NaCl	58,44	1150
Растворитель: вода дистиллированная	ДКК	74.55	20
Концентрат: 10 x	KH2PO4	136.1	12.5
Температура хранения: 4 ° C	CaCl2* 2 H2O	147.02	20
Максимальный срок хранения: 1 wk	D-глюкоза	180.2	250
Примечание: фильтр с помощью фильтра мембрана 50 мм
Фондовая B	Химическая	Молекулярная масса	Концентрация (мм)
	NaHCO3	84.01	260
Растворитель: вода дистиллированная
Концентрат: 10 x
Температура хранения: 4 ° C
Максимальный срок хранения: 1 wk
Примечание: фильтр с помощью фильтра мембрана 50 мм
Фондовая C	Химическая	Молекулярная масса	Концентрация (мм)
	ДКК	74.55	20
Растворитель: вода дистиллированная	KH2PO4	136.1	12.5
Концентрат: 10 x	MgCl2* 6 H2O	203.3	50
Температура хранения: 4 ° C	MgSO4* 6 H2O	246.47	20
Максимальный срок хранения: 2 wks	CaCl2* 2 H2O	147.02	5
Примечание: фильтр с помощью фильтра мембрана 50 мм
Фондовая М	Химическая	Молекулярная масса	Концентрация (мм)
	MgSO4* 6 H2O	246.47	100
Растворитель: вода дистиллированная
Концентрат: 100 x
Температура хранения: 4 ° C
Максимальный срок хранения: 4 wks
4AP фондовая	Химическая	Молекулярная масса	Концентрация (мм)
	4-aminopyridine	94.11	250
Растворитель: вода дистиллированная
Концентрат: 1000 x
Температура хранения: 4 ° C
Максимальный срок хранения: 2 wks
Примечание: vortex для 2-3 мин или stirr за 30-60 мин
Примечание: осторожно! 4-AP-токсичных и cinvulsant. Использовать перчатки и избежать распространения или разлив.

Таблица 1: Фондовая решения.

ХОЛДИНГ ФАГО			ЗАПИСЬ ФАГО			РЕЗКИ ФАГО
Химическая	C [мм]		Химическая	C [мм]		Химическая	C [мм]
NaCl	115		NaCl	115		Сахароза	208
ДКК	2		ДКК	2		ДКК	2
KH2PO4	1.25		KH2PO4	1.25		KH2PO4	1.25
MgSO4	1.3		MgSO4	1		2 MgCl	5
CaCl2	2		CaCl2	2		MgSO4	2
D-глюкоза	25		D-глюкоза	25		CaCl2	0.5
NaHCO3	26		NaHCO3	26		D-глюкоза	10
L-Аскорбиновая кислота	1		L-Аскорбиновая кислота	1		NaHCO3	26
						L-Аскорбиновая кислота	1
pH	7.4		pH	7.4		Пировиноградная кислота	3
Осмотического давления	300 мОсм/кг		Осмотического давления	300 мОсм/кг
						pH	7.4
						Осмотического давления	300 мОсм/кг

Таблица 2: Состав решения.

Устранение неполадок
ВЫПУСК			КОНТРМЕРЫ
Приступ сбросов выглядят «chunked»			Уменьшить скорость перфузии и/или снизить объем фаго выше срез мозга, регулируя положение всасывающей иглы.
Не иктальный деятельность			(1) убедитесь, что быстро межприступная события, вызываемые CA3 не распространяют к коре. Используйте небольшие скальпель лезвия (например, n.10) или иглы разорвать Шаффер коллатералей, если нужно будет, но будьте осторожны, чтобы не отрезать нитки капроновые якорь удержание срез. Стерео - или прямо микроскопом лучше подходят, тогда как инвертированным микроскопом очень усложняет эту задачу.
			(2) проверить жизнеспособность срез: сильный электрической стимуляции может спровоцировать приступ деятельность? Ждать до приблизительно 2 ч 4AP приложения, а затем изменить срез мозга, если приступ активности не происходит.
Мозг фрагмент перемещается при размещении прижимной анкер			(1) осторожно удалите фрагмент якорь и переместите срез мозга.
			(2) убедитесь, что фрагмент якорь равномерно влажной 4AP-фаго.
			(3) удалите 4AP-фаго из записи камеры в пользу адгезии срез мозга для МПС.
			(4) переместите фрагмент удержание якорь.
Срез мозга плавает на чипе МПС после перевода			(1) осторожно удалить избыток фаго с пипетка Пастера.
			(2) МПС чип может потребоваться повторно покрытием.
Электростимуляция не вызывают сети ответы			Увеличение интенсивности стимула, изменить электродных пар.
Электрическая стимуляция может вызывать реакции населения в проксимальных, но не дистальной корковых областях			Этот вопрос является ikely из-за плохой связи или слишком низкий стимул интенсивности. Электрической стимуляции могут быть неэффективными или эффективными в некоторых корковых областях только. Рекомендуется изменить срез мозга.
Сигнал шумный			(1) проверьте электрод сравнения: порой шумной базовых может быть вызвано неполной заливки впускного коллектора таким образом, чтобы электроды ссылка делает не полностью вглубь фаго.
			(2) Проверьте общее заземление оборудования.
			Отрегулируйте положение всасывающей иглы (3) таким образом, чтобы услышать звук всасывания постоянной, мягкие. Земля всасывающей иглы.
			(4) Очистите внешние контакты МПС с этанолом, используя ватный тампон.
			(5) МПС чип может быть поврежден: изменить МПС чип и проверить соотношение сигнал шум и артефакты.

Таблица 3: Устранение неполадок.

Обсуждение

МЭС являются бесценным инструментом для исследования нейрофизиологии и достигли зрелости в последние годы благодаря десятилетий разведки и разработки. По сравнению с обычными поле потенциальных запись, МЭС предлагают большое преимущество большее число наблюдательных пунктов и известных межэлектродный расстояния, которые имеют решающее значение для точно определить нейронной сети взаимодействия.

Техника записи МПС также может использоваться в сочетании с другими подходами электрофизиологии, такие как патч зажим запись¹⁵, расследовать связи между одного нейрона и нейрональных сетевой активности. Кроме того возможность визуализации поля потенциалов и многоквартирных деятельности одновременно может предоставить ценные проницательности в корреляции между деятельностью малых нейрональных ансамблях и коллективных нейрональных сетей. В сочетании с напряжения чувствительных красители, кальция изображений и Оптогенетика²⁹ позволяет выведение нейрофизиологии явлений с использованием многогранных подходов. В дополнение к фармакологические исследования, возможность выполнения записи и стимуляции с той же системой делает техника записи МПС очень мощный и универсальный: например, это возможно для изучения явления синаптической пластичности в ядро памяти формирования³⁰, используя протоколы neuromodulation, представленные здесь, которые имеют отношение к DBS для лечения эпилепсии и широкий спектр расстройств мозга. Последние доказательство, что техника записи МПС успешно применяться к мозг человека эпилептических ткани¹⁶ демонстрирует свою неоценимую полезность исследований эпилепсии, как понять основные механизмы, лежащие в основе этой разрушительной болезни и корректировать DBS алгоритмы для улучшения его.

Однако, МЭС силу преследования электрофизиологии экспериментов в условиях «ограничить» для мозга фрагментов, из-за требования о подводной записи камеры и необходимость дать мозга slice отдых на твердом субстрате где микро электроды были интегрированы. Таким образом мозговой ткани не могут получить адекватные кислородом, который в свою очередь может повлиять на качество записи.

Протокол, описанные здесь позволяет надежно регистрировать и изучать ictogenesis грызунов лимбической сетей, в сочетании с МПС, с использованием модели острого в пробирке 4AP и добиваться длительной эпохи электрической стимуляции, которые предоставляют соответствующую информацию для оценки DBS политики.

Предыдущие исследования электрических neuromodulation эпилептические лимбической сетей, основанных на использовании обычных области потенциальных записи использовали срезы мозга мыши или крысы с аналогичные результаты^24,25; Однако использование ткани мозга крысы оказалось более сложным, разумно из-за слабых подключения по сравнению с ткани мозга, полученных от мышей⁷. Что касается МЭС технику срезы мозга мыши лучше подходят в силу их меньшего размера. Кроме того учитывая уровень возникновения приступ подобных сбросов в мыши против ткани мозга крыс, это возможно для тестирования значительно больше срезы мозга один экспериментальный день, который в свою очередь делает сбор данных быстрее и эффективнее, и может уменьшить количество животных, используемых.

Значение в отношении существующих методов:

Приступ сбросов, записанные с помощью пользовательских палата описанные здесь, по-видимому, аналогичные продолжительность и скорость вхождения для тех, кто замечен с использованием обычных МПС кольцо камеры и тот же тип МПС (Вселенский микро электроды, см. ¹⁷). Однако необходимо подчеркнуть, что мозг толшины должны быть значительно сокращены при использовании обычных круглых запись камеры вместе с низкой перфузии курс (1 мл/мин), которые могут препятствовать успешной реализации neuromodulation экспериментов из-за плохой связи.

В настоящем Протоколе низким объемом настраиваемую запись камеры Вдохновленный патч зажим запись камеры дизайн обеспечивает стабильные и надежные ламинарного потока, который имеет решающее значение для успешного осуществления МПС записей; Она также позволяет, увеличения толшины мозга до 400 мкм для достижения справедливой компромисс между жизнеспособность тканей и внутренние соединения. Это действительно признается что ламинарный поток записи решения внутри камеры крайне желательно для электрофизиологии срез мозга, так как он не зависит от температуры, кислорода, и рН градиенты, которые наблюдаются в циркуляре потока раунд записи палат^19,20,31 (например, поставляемые с коммерчески доступных МПС). Такие градиенты внедрение экспериментальной предвзятости и также наносят ущерб срез мозга. Запись камеры относительно небольшого объема (~1.5 мл) наряду с^16,высокой перфузии в курс (5-6 мл/мин)³¹ позволяют для надлежащего обмена перфузии среды (≥3 раз / мин). Пользовательские камеры могут быть легко получены из коммерческих источников по доступной цене или произведены собственными силами с использованием технологии 3D печати. Другие исследования сообщили МПС записи из 400 µm толщиной человеческий мозг фрагменты¹⁶ с помощью обычных МПС кольцо камеры, при этом объем фаго по 1 мл и соблюдения высоких перфузии ставка (5-6 мл/мин) с помощью Перистальтический насос малошумящих. Однако авторы использовали различные модели ictogenesis, то есть, низкий мг^{2 +}, который, вероятно, менее влиянием чем модель 4AP ephaptic механизмов с участием значительное увеличение внеклеточной концентрации K^{+ 11 , 22}. Мы обнаружили, что высокая перфузии ставка не является желательным в 4AP модели, возможно из-за быстрого промывают накопленной внеклеточного K⁺, которое может необходимо значительно увеличить в записи фаго¹⁶. В самом деле противоречивых событий появились более «фрагментированное» когда ASCF перфузии скорость была увеличена до 2-3 мл/мин и срез мозга был погружен толстым слоем фаго, тогда как полномасштабный сбросов, экспонируется надежные тонизирующий клонические компоненты могут быть восстановлены по возвращении в более низкий уровень перфузии (1 мл/мин) и тоньше фаго слой право на уровне поверхности ткани (данные не показаны). Пользовательские записи камеры, указанных в настоящем Протоколе позволяет обмениваться перфузии среды 3 - 5 раз / мин со скоростью потока 1 мл/мин. Таким образом общая кислорода в мозг ломтики сильно улучшается даже при относительно низких перфузии цены, гарантируя стабильный записи температуры и высокое соотношение сигнал шум по-прежнему. Самое главное это позволяет сохранить внеклеточной концентрации K⁺ физиологическое значение.

Не требует каких-либо значительных изменений фаго ионного состава, например снижение мг^{2 +} или увеличения K⁺и предлагает уникальное преимущество сохранении возбуждающих и тормозящий передач модель 4AP ictogenesis ¹², аспект, который является весьма актуальным в исследованиях эпилепсии свете решающую роль глутаматергические и сетей ГАМК в эпилептиформный синхронизации (см. ⁷). 4AP-фаго, используемые в настоящем Протоколе содержится физиологическая концентрация K⁺ (3,25 мм) и немного ниже мг^{2 +} концентрацию, чем проведение Фаго (1 мм по сравнению с 1,3 мм). Эта концентрация по-прежнему подпадает сообщил физиологические показатели мг^{2 +} концентрация в спинномозговой жидкости грызун и используется во многих лабораториях (см. например^,17-¹⁸). Цель описанных протокола мы нашли, что это небольшое снижение предпочтителен для помощи в силу 4AP.

В предыдущей работе 4AP был применен к срез мозга когда он уже был установлен внутри записи камеры^17,18. Если экспериментатор должен соблюдать время задержки между 4AP и наступлением эпилептиформный модели, мы находим, что этот подход довольно много времени и не подходит для длительной записи и стимуляции сессий описано в настоящем Протоколе. Предварительной инкубации срезов мозга в 4AP на 32 ° C позволяет щадящие много экспериментальных время, так как срезы мозга могут быть предварительно обработанные в серии проводя эксперимент с использованием других разделах ткани.

Длительной жизнеспособности срезы мозга может быть полезным для анализа сетевых возможностей в долгосрочной перспективе. Кроме того их повышение сопротивляемости повторяющихся электрической стимуляции имеет большое преимущество, если экспериментатор хочет сравнить несколько протоколы стимуляции, которые должны выполняться в том же срез мозга для статистической надежности. В наших руках при тестировании 3 Протоколы стимуляции, каждый предшествует этап контроля и следуют этап восстановления, эксперимент может длиться 3-5 ч. В этом контексте живой МПС сопоставление имеет решающее значение для того, чтобы активировать правильный путь и подавить, вместо того, чтобы пользу ictogenesis посредством электрической стимуляции. Наш дружественный графический интерфейс представляет собой быстрый, простой и гибкий инструмент для сопоставления электроды различных мозговых структур. Противоречит коммерческого программного обеспечения это возможность добавлять пользовательские макеты МПС даже с основными навыками программирования. Изображения могут быть приобретены в светлые области; Таким образом подходит любой камеры общего назначения, которая имеет хорошее разрешение и помещается на микроскопе. Инвертированным микроскопом необходимо визуализировать микроэлектродов позицию по отношению к ломтик мозга, так как они будут скрыты под ткани при использовании прямо микроскопом. Однако стерео Микроскоп рекомендуется помимо Перевернутый типа если экспериментатор должен выполнять нож порезы сорвать конкретных нейронов пути.

Наконец еще одно преимущество предлагаемого подхода является дешево и сравнительно легко Ассамблеи большинство из необходимых инструментов, как настраиваемую запись камеры и камеры Холдинг, теплую ванну и срез якорь, а также ненужного использования дорогостоящих Перистальтический насос малошумящих.

Ограничения метода:

МПС записи не позволяет визуализировать очень медленных волн, т.е., DC смещается в сигнале. Такие базовые отклонения могут помочь асимптотическая измерение длительности приступ разряда и, самое главное, они являются основополагающими для изучения корковых распространения депрессии (явление, которое относится к внезапной неожиданной смерти в эпилепсии³² и совместно между эпилепсии и мигрени³³).

Что касается электрических neuromodulation протокол, описанные здесь позволяет выполнять несколько сессий стимуляции не затрагивая жизнеспособность срез мозга. Мы могли успешно выполнять до 3 стимуляции сессий 20-45 мин, похож на то, что сообщалось в предыдущих работ²⁵. Хотя вероятно срезы мозга может выдерживать большее число сессий стимуляции или дольше, протоколы стимуляции, мы не тестировали срезы мозга в этом отношении. Мы рекомендуем, ограничивая количество протоколы стимуляции 3 и избегать длительного (≥60 мин) стимуляции сессий, которые могут значительно усиливают ткани мозга, в таких условиях предел, до отсутствия восстановления после вывода стимул.

Важнейшие шаги в рамках протокола:

Некоторые критические факторы могут препятствовать успешного преследования записи и модуляция активности эпилептиформный в срезах мозга в сочетании с МПС. Кроме видов грызунов, используемых и качество срезы мозга, уровень перфузии во время записи и динамика потока Фаго (т.е., ламинарные против циркуляр) в пределах записи камеры, мы обнаружили, что в условиях восстановления и наиболее важные шаги являются долгосрочное поддержание срезы мозга, а также режим 4AP приложения.

При использовании погружных холдинг камеры важно сохранить срезы мозга при комнатной температуре для сохранения активности сети ткани мозга и пользу индукции приступ подобных сбросов приложением 4AP. В наших руках восстановления и обслуживания в 32 ° C ухудшилось ткани мозга в течение 3-4 h нарезки.

Инкубации мозга ломтики в 4AP-фаго при комнатной температуре и запись на 32 ° C, однако, не желательно. Мы нашли много трудностей в соблюдении надежные периодические приступ сбросов в этом состоянии. Действительно чтобы ослабить или даже предотвратить 4AP-индуцированной ictogenesis оба в пробирке³⁴ и в естественных условиях³⁵поступили низких температурах в диапазоне 20 – 24 ° C. Таким образом 4AP температуры инкубации и записи должны находиться в пределах 30-34 ° C и должна соответствовать. Чтобы избежать ткани мозга под слишком много стресса из-за одновременного индукции возбудимостью, 4AP и внезапного воздействия срезы мозга от комнатной температуры для теплой (32 ° C) 4AP-фаго, она имеет основополагающее значение для выполнения промежуточных предварительно потепление шаг и пусть срезы мозга приучать в проведении фаго на 32 ° C в течение 20-30 мин, пропустить этот шаг может повлиять на ictogenesis индукции, 4AP.

Другой аспект, который необходимо отметить это важное значение D-глюкозы в фаго после нарезки. 25 mM концентрации сохраняет фрагменты мозг лучше, чем концентрация 10 мм, используется во многих лабораториях и он также улучшает скорость возникновения приступ деятельности, которая в 2 раза быстрее (таким образом, что делает его легче проводить целый ряд экспериментальных протоколы в нескольких срезах мозга каждый день).

Наконец некоторые важные мелкие детали во время нарезки процедуры необходимо упомянуть. Во-первых, не позволяют нетронутыми мозга и срезы мозга заморозить в холодной резки фаго. Охлаждения мозга для < 2 мин является достаточным с учетом небольшого размера мозга мыши. Разделах ткани следует передать непосредственно из буфера лотка промывки емкости при комнатной температуре. Ополаскивание резки фаго очень важно, иначе концентрация высоким сахарозы сделает мозга, ломтики придерживаться нейлоновая сетка холдинг камеры. Чтобы эффективно промыть ткань, важно свести к минимуму содержание фаго резки в рамках передачи пипетку с тем, чтобы не загрязнить Холдинг фаго чрезмерно. 2-ступенчатый полоскания помогает в минимизации загрязнения. После завершения нарезки процедуры разделах ткани следует передать непосредственно от промывки мензурки холдинг камеры, где Мягкая нейлоновая сетка приостановлено на полпути в проведении фаго позволяет оксигенации ткани с обеих сторон. Тот же принцип должен применяться на всех стадиях после нарезки процедуры: срезы мозга никогда не должен сидеть на нижней части стакан, они не должны быть в контакте с стороны холдинга камер, и они никогда не должны быть в контакте друг с другом ни перекрываются.

Модификации и устранения неполадок:

ФАГО композиции могут быть изменены согласно потребностям экспериментатора. Например наркотики могут быть добавлены для того чтобы рассечь вклад конкретных нейротрансмиттеров или ионных каналов для обеспечения эффективности электрических neuromodulation. Кроме того пировиноградной и аскорбиновой кислоты (см. таблицу 2) могут быть опущены, хотя мы находим, что они оказывают мощное нейропротекторной роль. Мы в таблице 3 доклада наиболее распространенные проблемы, которые могут быть обнаружены в этот протокол и как бороться с ними.

Выводы:

МПС запись несомненно бесценный техника для решения взаимодействия нейрональных сетей в здоровье и болезни. В дополнение к фармакологические исследования это также можно оценить электрические neuromodulation протоколы, которые имеют отношение к DBS, эпилепсии и других неврологических расстройств. В этом протоколе мы показали, что это можно воспроизвести типичный периодические стимуляции эксперименты с аналогичные результаты с полученными с обычными внеклеточного поле потенциальных запись и внешних стимулирующие электроды. Увеличение доступности коммерческих удобного оборудования и передовых программных инструментов сделать техника записи МПС также подходит для экспериментов замкнутого цикла стимуляции, предоставить ad hoc стимуляции тканей мозга, а также Изучите вклад механизмов обратной связи для ответов нейронной сети.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Поли-D-лизин	Sigma-Adrich	P7886	необходим для покрытия MEA
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	Chemical
KCl	Sigma-Adrich	P9541	Chemical
KH2PO4	Sigma-Adrich	795488	Chemical
CaCl2*2 H2O	Sigma-Adrich	C3306	Химический
D-глюкоза	Сигма-Адрих	RDD016	Химический
NaHCO<суб>3	Сигма-Адрих	S5761	Химический
MgCl<суб>2*6 H<суб>2О	Сигма-Адрих	M2670	Химический
MgSO<суб>4*6 H<суб>2О	Сигма-Адрих	M5921	Химический
Сахароза	Сигма-Адрих	RDD023	Химическая
пировиноградная кислота, 98%	Sigma-Adrich	107360	Химический
4-аминопиридин	Sigma-Adrich	A78403	Противосудорожный препарат
STG-2004	Многоканальная система	STG4004-1,6 мА	4-канальный генератор стимулов с напряжением (± 8 В) и выходной ток (± 1,6 мА
)MEA1060	Многоканальная система	Н/Д	MEA усилитель
планарный MEA	Многоканальная система	60MEA500/30iR-Ti без кольца	Должно быть без кольца для использования пользовательской записывающей камеры
McRack	Многоканальная система	Программное обеспечение для записи
			STG4004 управление
TC02	Многоканальная система	TC02	2-канальный термостат
PH01	Многоканальная система	PH01	Нагревательная перфузионная канюля
MPH	Многоканальная система	MPH	Магнитный держатель для PH01 и аспирационной иглы
Elastostil E43	Wacker	E43	Эластомерный герметик, используемый для крепления кастомной записывающей камеры на MEA
Custom Chamber	Crisel Instrument	SKE-камера	MEA Custom записывающая камера
Ag/AgCl электрод, гранула, 1,0 мм	Crisel Instrument	64-1309	Электрод сравнения для кастомной записывающей камеры
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	Ферментативный очиститель
MATLAB	The Mathworks		Среда программирования для электродемаппинга
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	Vibratome
	Warner Instruments	64-1309	Ag-AgCl Электродная гранула 1,0 мм (E205). Электрод сравнения.