Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Аденоассоциированный вирус опосредованной доставку ТРИФОСФАТЫ сердечной гена, редактирования в мышей

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57560

⸱

2 августа 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program, Ohio State University Wexner Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предоставляем подробный протокол для проведения в естественных условиях сердечной гена редактирования мышей с использованием рекомбинантного вируса Adeno-Associated (rAAV)-опосредованной доставки ТРИФОСФАТЫ. Этот протокол предлагает многообещающие терапевтические стратегии для лечения дистрофических кардиомиопатия в мышечной дистрофии Дюшенна и может использоваться для создания сердца конкретных нокаут в послеродовой мышей.

Аннотация

Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие, рецидивирующий повторить (ТРИФОСФАТЫ) системы в значительной степени способствовало генома в культивируемых клеток и организмов из различных видов техники. ТРИФОСФАТЫ технология была также изучена как Роман терапии для целого ряда заболеваний человека. Доказательства в концепция данные являются весьма обнадеживающими, как свидетельствуют последние исследования, демонстрирующие осуществимость и эффективность генов на основе редактирования терапевтический подход для мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) с помощью мышиных модели. В частности внутривенные и внутрибрюшинного введения rh.74 серотип рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) (rAAVrh.74) позволила сердца эффективности стафилококк ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (SaCas9) и два Руководство РНК (gRNA) для удаления геномной региона с мутант кодон в экзона 23 гена Dmd мыши. Этот же подход может также использоваться для Нокаут гена интереса и изучить их функции сердца в послеродовой мышей, когда gRNA предназначен для кодирования региона гена. В этом протоколе мы подробно показать, как инженер-rAAVrh.74 ТРИФОСФАТЫ вектор и как добиться высокоэффективных сердца доставки в новорожденных мышей.

Введение

Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие палиндром повторить (ТРИФОСФАТЫ) технология представляет самые последние улучшения в геном инженерии и изменил существующую практику генетики в клетки и организмы. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования использует один руководство РНК (gRNA) направить связанные ТРИФОСФАТЫ эндонуклеазы например ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) и Cpf1 геномной ДНК цель, которая дополняет в последовательности protospacer кодируемых gRNA с конкретных protospacer прилегающие мотив (PAM)1,2. Диспетчер PAM варьируется в зависимости от бактериальных вида Cas9 или Cpf1 гена. Наиболее часто используемым Cas9 Нуклеаза, производный от Streptococcus pyogenes (SpCas9) признает PAM последовательность NGG, найденной в геномной ДНК, на стренги непромысловых прямо вниз по течению от последовательности целевого объекта. На конечном сайте Cas9 и Cpf1 белки генерировать двухручьевой перерыв (DSB), который затем отремонтировать через встроенные клеточных ДНК ремонт механизмов, включая не гомологичных конец присоединения (NHEJ) и ориентированные на гомологии ремонт (HDR) пути3, 4. В отсутствие шаблона для гомологичная рекомбинация ДНК DSB главным образом отремонтированы по ошибкам NHEJ пути, что может привести к вставки или удаления (indels) нуклеотидов, вызывая мутации фреймшифт если ОУС были созданы в кодирование региона гена5,6. Таким образом система ТРИФОСФАТЫ широко использовался для инженер функция потерь мутации в различных клеточных моделях и весь организмов, для того, чтобы исследовать функции гена. Кроме того каталитически неактивных Cas9 и Cpf1 были разработаны для транскрипционно и эпигеномно модулировать выражение целевых генов7,8.

Совсем недавно, SpCas9 и SaCas9 (производное от золотистого стафилококка) были упакованы в векторы рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) для коррекции послеродовой гена в животной модели заболеваний человека, в частности, Дюшенна мышечная дистрофия (ДМД)9,10,11,12,13,14,15. ДМД это роковой Х-хромосомой рецессивных заболеваний вызванных мутациями в гене DMD , который кодирует белок делеций16,17, затрагивающих примерно один в 3500 мужчин рождений по данным обследования новорожденных18 , 19. Он характеризуется прогрессивная мышечная слабость и тратить. ДМД пациентов обычно теряют способность ходить между 10 и 12 лет и умирают дыхательной или сердечной недостаточности в возрасте 20-30 лет20. В частности, развивается кардиомиопатия > 90% пациентов DMD и является ведущей причиной смерти в ДМД пациентов21,22. Хотя Deflazacort (противовоспалительным наркотиков) и Eteplirsen (экзона, пропуская медицины для пропуска экзона 51) недавно были одобрены для ДМД продовольствия и медикаментов (FDA)23,24, ни один из этих методов лечения Исправьте генетический дефект на уровне геномной ДНК. Mdx мышь, которая носит Точечная мутация в экзона 23 делеций гена, широко используется как модель DMD25. Кроме того ранее мы показали, что функциональные делеций выражение был восстановлен в кадр удаления геномной ДНК, охватывающих экзонов, 21, 22 и 23 в скелетных мышцах мышей многомерных выражений с помощью внутримышечной Ad-SpCas9/gRNA доставки9 и в сердечной мышцы mdx/utrophin+ / мышей с помощью внутривенного и внутрибрюшной rAAVrh.74-SaCas9/gRNA доставки26.

В этом протоколе мы подробно каждый шаг в послеродовой сердечной гена редактирования для восстановления делеций в многомерных выражений/utrophin+ / мышей с использованием rAAVrh.74-SaCas9/gRNA векторов, от проектирования gRNA делеций анализа в разделах мышцы сердца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животные, используемые в настоящем протоколе были сохранены в Огайо государственного университета лабораторных животных ресурсов в соответствии с руководящими принципами использования животных. Все исследования на животных были санкционированы институциональный уход животных, использования и Комитет по обзору из университета штата Огайо.

1. дизайн и клонирование оформления в ТРИФОСФАТЫ вектор

  1. Выберите 2 оформления ориентации делеций Интрон 20 и Интрон 23 (i20 и i23) для SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT и i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (Пэм последовательность подчеркнул и курсивом).
    Примечание: Целевые сайты для i20 и i23 являются около 23 килограмм пары (kbp) прочь. Сорвать кодирования ген, два оформления ориентации общего экзонов с Пэм NNGRRT последовательность для SaCas9 (желательно NNGAAT, NNGGGT и NNGAGT) и рекомендуемое расстояние в пределах 20 kbp.
  2. Используйте следующие параметры ПЦР для отжига gRNA oligos (100 мкмоль/Л) в 1 x отжига буфера (5 x отжига буферный запас содержит 0,5 моль/Л K-ацетат, 150 ммоль/Л HEPES-Кох, 10 ммоль/Л мг ацетат, pH7.4): 95 ° C 10 мин, 90 циклов 95 до 59 ° c с 0,4 ° C уменьшение в цикл для 20 s, 90 циклов 59-32 ° c с уменьшением 0,3 ° C за цикл для 20 s, 20 циклов 32 до 26 ° C с уменьшением 0,3 ° C за цикл для 20 s.
  3. Перевязать отожженная gRNA oligos в pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA с использованием BsaI и T4 ДНК лигаза в одном реакция (1 мкл 50 нг/мкл pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 мкл отожженная oligos, 1,5 10 x мкл T4 ДНК лигаза буфера, 0.5 мкл T4 ДНК лигаза 1 мкл BsaI, 10 мкл ddH2O ), с следующее условие реакции в PCR циклователь: 5 циклов [37 ° C 5 мин и 16 ° C 10 мин]; 37 ° C 20 мин; 80 ° C 5 мин.
  4. Трансформировать продукт перешнуровки 15 мкл в 30 мкл сведущие клетки, плиты клетки в агар пластины с 100 мкг/мл Ампициллин и культуры при 37 ° C в течение 24 ч.
  5. Возьмите 5-10 колоний и культуры в LB среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллин при 37 ° C, 250 об/мин в шейкер-инкубатор для 3-4 ч.
  6. Экран колоний методом ПЦР: 10 мкл 2 x мастер смесь ПЦР, 8 мкл ddH2O, 1 мкл культуры е. Coli, 1 мкл грунт 10 мкмоль/Л U6-вперед, 1 мкл i20 или i23 gRNA обратный грунтовка. Велоспорт параметры ПЦР: 95 ° C 5 мин, 35 циклов 95 ° C 30 s, s 61 ° C 30, 72 ° C 30 s.
  7. Подготовьте 5 мл культуры позитивного клонов путем добавления 4 мл свежего LB средних containing100 мкг/мл Ампициллин и культуры на ночь при 37 ° C, 250 об/мин.
  8. Очистить плазмидной ДНК, используя комплект для извлечения соответствующей плазмида, и проверить плазмида Сэнгером секвенирования грунтом U6-вперед.
  9. Культура клетки C2C12 в среде DMEM, дополненная 10% FBS и 1% перо-стрептококк до достижения confluency ~ 70% для тестирования редактирования эффективность плазмид ген.
  10. Electroporate в общей сложности 5 мкг SaCas9/gRNA плазмида смесь в молярное соотношение 1:1 в 1 x 10-6 C2C12 клетки согласно протоколу производителя.
  11. После 48 ч после трансфекции урожай C2C12 клеток и экстракта геномной ДНК.
  12. Использование 100 нг геномной ДНК как шаблон для выполнения реакции PCR для мыши делеций локуса: вперед грунтовка 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 мкл 10 мкмоль/Л), обратный грунтовка 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 мкл 10 мкмоль/Л), 10 мкл 2 x зеленый ПЦР Мастер микс, 7 мкл ddH2O, 1 мкл геномной ДНК ( 100 нг). Использование ПЦР Велоспорт условия как 95 ° C 5 мин, 35 циклов [95 ° C 30 s, s 61 ° C 30, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 мин.

2. rAAV производство

  1. К культуре клетки, семян AD293 клеток на 20-40 см 15 блюд и поддерживать в среде DMEM, дополненная 10% FBS и 1% перо-стрептококк до достижения confluency ~ 90% для transfection.
  2. Разбавить 3 плазмид с 200 мкл сокращение сыворотке среднего (за блюдо): 1) 10 мкг pHelper; pXR 2) 5 мкг (rh.74 или другие серотипы) и 3) В общей сложности 5 мкг смеси pX601-i20 и pX601-i23 (соотношение 1:1). Выполните transfection polyethylenimine (PEI) путем смешивания с 80 мкл пей и инкубации при комнатной температуре на 10 минут добавить смесь на AD293 клеточных культур в духе прикапывают.
  3. Для производства вирус AAV, после 72 ч пост трансфекции используйте скребковых ячейка для сбора средства массовой информации и гранулы AD293 клетки центрифугированием при 1100 x g за 10 минут.
  4. Ресуспензируйте клетки окатышей в 15 мл rAAV литического буфера (50 ммоль/Л Tris база, 150 ммоль/Л NaCl, рН 8,5) следуют 3 циклов замораживания оттаивания с чередующимися инкубации в жидком азоте и ванну воды 42 ° C. Храните lysates клетки в-80 ° C для будущей обработки, если они не обрабатываются немедленно.
  5. Фильтр СМИ культуры с 0,45 мкм фильтром и добавить 40% PEG8000 в 2,5 моль/Л NaCl в конечной концентрации 8%. Инкубируйте смеси на 4 ° C для 1 h и центрифуги на 1100 x g 15 мин.
  6. Ресуспензируйте гранулы rAAV литического буфера и объединить с lysates клетки от шаге 2.3, следуют лечение benzonase (50 ед/мл) при 37 ° C в течение 1 ч.
  7. Центрифуги benzonase лечение rAAV, содержащие смесь 1100 x g 15 мин при температуре 4 ° C и сохранить супернатант (подготовка сырой rAAV).

3. rAAV очищения и концентрации

  1. Загрузить подготовки сырой rAAV на iodixanol градиент в ультрацентрифуга трубку в следующем порядке от верхней до нижней: сырой AAV lysate (~ 15 мл), 8 мл 15% Iodixanol, 6 мл 25% Iodixanol, 5 мл 40% Iodixanol, 5 мл 58% Iodixanol. Заполните оставшиеся пустой объем трубки в верхней, используя 1 x DPBS.
  2. Центрифугуйте образцы на 230 000 x g в ротор Ультрацентрифуги для 120 мин на 10 ° C и сбор 3-4 мл 40% градиента фракции, содержащие частицы rAAV с иглой 18 G.
  3. Развести rAAV частиц с 1 x DPBS и центрифуги с помощью центробежного фильтра блока (MWCO 100 кДа). Повторите этот шаг для 3 - 5 раз и наконец сосредоточиться rAAV подготовке к 300-500 мкл.

4. rAAV Titering

  1. Извлечь геномной ДНК из 2 мкл сосредоточены rAAV, осадка с 3 M NaOAc в этаноле и Ресуспензируйте в 20 мкл ddH2O.
  2. Получения калибровочной кривой для rAAV количественный путем последовательного растворения плазмида pX601: 1 x 109, 1 x 10-8,1 x 10-7, 1 x 10-6, 1 х 105 копий в каждом 10 мкл ddH2O. развести DNAase лечение rAAV образцы как 1:10, 1:50, 1: 100 и 1: 1000.
  3. Определение титра rAAV, Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР) с помощью ПЦР комплект согласно инструкции производителя в реальном масштабе времени PCR системы: 1 мкл 10 мкмоль/Л каждого праймера (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC и 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 мкл 2 x ПЦР Мастер микс, разводят 1 мкл образцы rAAV и 2 мкл ddH2O. запускать реакции с параметрами Велоспорт: 95 ° C 3 мин, 45 циклов [95 ° C 5 сек и 61 ° C 20 сек].

5. внутривенные и внутрибрюшинного введения rAAVrh.74 ТРИФОСФАТЫ в неонатальной mdx/utrophin+ / мыши

  1. Иммобилизации mdx/utrophin+ / мыши щенков (день 3) путем размещения на льду за 1 мин, а затем применять с 1 x 1012 вирусных частиц в 50 мкл на мышь системно через ретро орбиталь подход или внутрибрюшинной инъекции.
  2. Разрешить мышей, чтобы восстановить и место обратно в свои дома клетки. В десяти недель после приема rAAV усыпить мышей на CO2 экспозиции для коллекции тканей.
  3. Snap замораживания тканей геномной ДНК и РНК добыча и использование охлаждения изопентана в жидком азоте для замораживания тканей с оптимального раскроя температуры смеси для cryosectioning.

6. анализ целевого гена редактирования результатов

  1. Геномная ДНК ПЦР-анализа
    1. Изолируйте всего геномной ДНК из тканей сердца mdx/utrophin+ / мышей относились с или без rAAV.
    2. Используйте тот же протокол в шаге 1.12 для ПЦР-анализа.
  2. ПЦР-анализ делеций выражения
    1. Экстракт всего РНК из тканей сердца с РНК добыча комплект после инструкцией производителя.
    2. Для выполнения обратной транскрипции, предварительно лечения всего РНК с DNase РНКазы бесплатно и использовать 5 мкг очищенных РНК в качестве шаблона для синтеза cDNA перв стренги с обратной транскрипции Кит.
    3. Используйте продукт обратной транскрипции для ПЦР-анализа делеций выражения с праймерами cDNA делеций: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT и 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
  3. Оценить Гене редактирования эффективность анализа ПЦР
    1. Оценить Гене редактирования эффективность количественного RT-ПЦР для выявления сокращение экзона 22-содержащих стенограммы с использованием вперед грунтовка (экзона 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA и обратный грунтовка (экзона 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Используйте Gapdh в качестве ссылки ген грунтом вперед: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC и обратный грунтовка: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
    2. Запустить Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР) с помощью ПЦР комплект согласно инструкции производителя в реальном масштабе времени PCR системы и условий реакции 2-шаг: 95 ° C 3 мин, 45 циклов 95 ° C 5 сек и 61 ° C 30 сек.
  4. Иммунофлюоресценции, пятнать для анализа делеций выражение
    1. Вырежьте замороженные ткани с помощью криостата при толщине 10 мкм. исправить замороженных секции с параформальдегида 4% при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Вымойте 2 x с PBS и инкубировать с блокировкой раствора (10% лошадь сыворотки) за 1 ч.
    3. Инкубируйте основного антитела анти делеций, при температуре 4 ° C на ночь.
    4. Вымойте слайды с PBS 3 x 5 мин и проинкубируйте с флуоресцентные вторичные антитела (1: 500) при комнатной температуре в течение 1 ч.
    5. Смонтируйте слайдов с помощью средства монтажа с DAPI и изображений с помощью Перевернутый конфокального микроскопа.

7. off Целевой анализ T7E1 assay

  1. Предсказать потенциальные пробить сайты, используя онлайн ТРИФОСФАТЫ инструменты проектирования, такие как < http://crispr.mit.edu>.
  2. Усилить геномной регионов, охватывающие сверху 5-10 потенциальных пробить сайтов методом ПЦР: геномной ДНК 200 ng, 1 мкл высококачественный ДНК-полимеразы, 5 мкл 10 x буфер ПЦР микс, 1.5 мкл 10 мкмоль/Л праймеров участкам прямого и обратного, регулируя общий объем до 50 мкл с ddH2O.
  3. Запустите продукты PCR, электрофорез, извлечь и очистить ДНК, используя набор для извлечения геля. Измерение концентрации с помощью спектрофотометров.
  4. Способствуем формированию гетеродуплексного денатурации и повторно отжига очищенный ампликонов медленно в буфер 2.1 с помощью ПЦР cycler. Используйте те же условия велосипедного как описано в шаге 1.2.
  5. Дайджест повторно отожженная продуктов для 30 минут при 37 ° C с 0.5 мкл T7E1 фермента и анализировать реакцию, электрофорез с применением геля агарозы 1-2%.
    Примечание: Ампликонов также могут быть проанализированы путем целенаправленной глубокой sequencing.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективность оформления побудить удаления целевого региона геномной ДНК должны оцениваться в клеточных культурах до упаковки в rAAV в vivo исследований. С этой целью оформления и выражая SaCas9 конструкции были electroporated в C2C12 клетки и геномной ДНК была проанализирована методом ПЦР с праймерами фланговые целевых сайтов (рис. 1). ПЦР продукта ~ 500 bp указывает успешного удаления целевого геномной ДНК результате гена редактирования в то время как клетк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы подробно все шаги, необходимые для достижения в естественных условиях сердечной гена редактирования в послеродовой мышей с помощью rAAVrh.74 опосредованной доставки SaCas9 и два оформления. Как отмечалось ранее, этот подход может использоваться для восстановления делеций выражение дистрофические мышей, как описано в нашей работе27, но он также может позволить быстрый обратной генетики исследования сердечно связанных генов мышей без длительного процесса традиционные нок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликта интересов не существует.

Благодарности

О.в. поддерживается США национальные институты здравоохранения грантов (R01HL116546 и R01 AR064241).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 555 козий антикролик IgGThermo Fisher ScientificA-21428
бензоназа нуклеазаSigma-AldrichE1014
Шкафы биобезопасностиThermo Fisher Scientific13471300 серия A2 Класс II, тип A2
BsaIНовая Англия BioLabs IncRO535S
Компетентные клеткиAgilent Technologies
Чашки для клеточных культур, 150 ммNest Scientific США715001
CryostatLeica BiosystemsLeica CM3050S
DMEMThermo Fisher ScientificMT10017CVCorning cellgro
Дистрофин антителаSpring BioscienceE2660
Fast-Ion Midi Plasmdi KitIBI ScientificIB47111
FBSThermo Fisher Scientific26-140-079
Фильтрующий блок, 0,45&мкм; mThermo Fisher Scientific166-0045
GoTaq Master MixesPromegaM7122
Высокоскоростной мини-набор плазмидIBI ScientificIB47102
Сыворотка для лошадейAbcamab139501
Isotemp 2239 Водяная баняThermo Fisher Scientific15-460-11Q
Изотемп Тепловой блокThermo Fisher Scientific11-718
Инвертированный конфокальный микроскопCarl Zeiss Microscopy, LLCLSM 780
LightCycler 480 ИнструментRoche5015243001LightCycler 480 Instrument II
Центрифуга большой емкостиThermo Fisher Scientific46-910Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
МикроцентрифугаThermo Fisher Scientific75002445Спектрофотометры Sorvall Legend Micro 21R
NanodropThermo ScientificND2000CLAPTOPNanoDrop™ 2000/2000c
Олигос для i20-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
Олигос для i20-RIntegrated DNA TechnologiesAAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Олигос для i23-FИнтегрированные технологии ДНКCACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
Олигос для i23-RИнтегрированные технологии ДНКGACCTTTCCCTCTCGGTGc
ОлигосИнтегрированные технологии ДНК
OptiPrep Градиент плотности MediumSigma-AldrichD1556-250ML
OptiMEMThermo Fisher Scientific
PEG8000Sigma-Aldrich89510-1KG-F
ПолиэтилениминPolysciences23966
Протеиназа KSigma-AldrichP2308
Быстрозапечатанная центрифужная пробиркаBeckman Coulter Inc342414
QIAquick Набор для экстракции геляQiagen28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR KitsAlkali ScientificQS2005
RevertAid RT Набор для обратной транскрипцииThermo Fisher ScientificK1691
РоторBeckman Coulter Inc337922тип 70Ti
T4 ДНК-лигазаNew England BioLabs IncM0202S
ТермоамплификаторBio-rad1861096
TRIzol РеагентThermo Fisher Scientific15596026
ультрацентрифугаBeckman Coulter Inc8043-30-1192Optima le-80k
Ультрацентробежный фильтрующий блокMilliporeSigmaUFC510096
VECTASHIELD Монтажная среда с DAPIVector Laboratories, IncH-1200
20031431985070

Ссылки

  1. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
  2. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  5. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  6. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
  7. Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018(2017).
  8. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264(2015).
  9. Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
  10. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
  11. Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
  12. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
  13. Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244(2015).
  14. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
  15. Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454(2017).
  16. Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
  17. Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
  18. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
  19. Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
  20. Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
  21. Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
  22. McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
  23. Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
  24. Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
  25. Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
  26. Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
  27. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
  28. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
  29. Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
  30. Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
  31. Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
  32. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
  33. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Редактирование генов CRISPRвосстановление дистрофинадоставка с помощью rAAVrh.74дизайн гидовой РНКочистка плазмидиммунофлуоресцентное окрашиваниеэкстракция геномной ДНКконфокальная микроскопия
Аденоассоциированный вирус опосредованной доставку ТРИФОСФАТЫ сердечной гена, редактирования в мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.