Method Article

Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол для получения данных последовательности ампликон почвы, ризосфере и корня endosphere microbiomes. Эта информация может использоваться для изучения состава и разнообразие растений связанные микробных сообществ и подходит для использования с широким спектром видов растений.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интимные взаимодействие между растение хост и связанные микроорганизмов имеет решающее значение в определении фитнес завод и может способствовать повышение толерантности к абиотическим стрессам и болезням. Как завод микрофлора может быть весьма сложным, лоу кост, высок объём методы, такие как на основе ампликон секвенирование гена 16S рРНК часто являются предпочтительными для характеризующие его микробный состав и разнообразия. Однако выбор соответствующей методологии при проведении таких экспериментов имеет решающее значение для снижения отклонений, которые может затруднить анализ и сравнение образцов и исследования. Этот протокол описывает подробно стандартизированной методологии для сбора и извлечения ДНК из почвы, ризосфере и корень. Кроме того мы выделите устоявшихся 16S рРНК ампликон последовательности конвейера, который позволяет для изучения состава бактериальной общин в этих образцах и может быть легко адаптирована для других маркерных генов. Этот трубопровод был одобрен для различных видов растений, в том числе сорго, кукурузы, пшеницы, клубника и агавы и может помочь преодолеть проблемы, связанные с загрязнением от завода органеллы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Завод связанные microbiomes состоят из динамичных и сложных микробных сообществ, состоит из бактерий, археи, вирусов, грибков и других эукариотических микроорганизмов. Помимо их хорошо изучена роль в возникновении болезни растений связанных растений микробы могут также положительно повлиять здоровья растений, повышение толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым наличия питательных веществ и поощрения повышения роста растений через производство фитогормонов. По этой причине в характеристике таксонов, которые ассоциируются с завода корень endospheres, rhizospheres и окружающий грунт существует особый интерес. Хотя некоторые микробы могут быть культивировали в изоляции на лабораторных созданный СМИ, многие нельзя отчасти потому, что они могут полагаться на симбиотические отношения с другими микробами, растут очень медленно, или требуют условий, которые не могут быть реплицированы в лабораторной среде. Потому что он обходит необходимость культивирования и относительно недорогой и высокой пропускной способности, филогенетическое профилирование на основе последовательности экологических и связанных с ними принимающей микробиологических образцов стала предпочтительным методом для assaying микробных композиция.

Выбор соответствующей последовательности технологий, предоставляемые различными следующего поколения виртуализации платформ (НГС)1 зависит от потребностей пользователей, с важными факторами, в том числе: желаемого охвата, длина ампликонами, ожидается сообщества разнообразия, а также виртуализации-погрешность, чтение Длина и стоимости за запуск/megabase. Какие Джин будет усилен и какие праймеры будет использоваться другой переменной, которая должна рассматриваться в экспериментах на базе ампликон последовательности. При создании или выборе грунты, исследователи часто вынуждены компромисс между универсальностью амплификации и таксономические резолюции достижимые из результирующей ампликонами. По этой причине эти виды исследований часто выбрал грунты и маркеры, которые выборочно целевых конкретных подмножеств микрофлора. Оценке состава бактериальных сообществ обычно осуществляется путем sequencing один или более из гипервариабельных регионов бактериальных 16S рРНК ген2,3. В этом исследовании, мы описываем ампликон на основе последовательности протокол, разработанный для платформы NGS этого региона цели 500 bp V3 V4 бактериальных 16S рРНК ген, который позволяет для широкого амплификации обеспечивая при этом достаточно изменчивости для бактериальных таксонов различие между различными таксонов. Кроме того этот протокол может быть легко адаптирована для использования с другими наборами грунт, например маркер ITS2 грибов или 18S рРНК Субблок эукариот.

В то время как другие подходы, такие, как ружье метагеномики, metatranscriptomics и одноклеточного последовательности, предлагают другие преимущества, включая решена микробных геномов и более прямого измерения функции сообщества, эти методы обычно более дорого и вычислительных ресурсов, чем филогенетических профилирования описано здесь4. Кроме того выполняя метагеномики ружье и metatranscriptomics на образцах корень дает большой процент читает, принадлежащих к принимающей генома растений, и методы, чтобы преодолеть это ограничение, по-прежнему подвергаются развитых5,6.

Как и в случае с любой экспериментальной платформы, профилирование на основе ампликон можно ввести ряд потенциальных отклонений, которые должны быть рассмотрены в ходе экспериментального проектирования и анализа данных. К ним относятся методы сбора проб, ДНК добычи, отбора праймеры PCR, и как проводится подготовка библиотеки. Различные методы может существенно снизить количество используемых данных и может также затруднить усилия чтобы сравнить результаты исследований. Например метод удаления ризосферной бактерии7 и использование методов различных извлечения или выбор ДНК извлечения комплекты8,9 было показано значительное воздействие течению анализа, что приводит к различные выводы относительно которых микробы формируют настоящее и их относительного обилия. Поскольку можно настроить профилирование на основе ампликонами, делая сравнения различных исследований может быть сложным. Проект микрофлора земли предположил, что исследователи, изучение сложных систем, таких как завод связанные микрофлора выиграют от разработки стандартизированных протоколов как средства минимизации изменчивости, вызванных применением различные методы между исследования10,11. Здесь мы обсуждаем многие из вышеуказанных тем, и предложение предложения относительно наилучшей практики, где это уместно.

Протокол демонстрирует процесс сбора почвы, ризосфере и корень образцов из Сорго зерновое и извлечения ДНК, используя налаженные ДНК изоляции комплект11. Кроме того наш протокол включает в себя подробный ампликон последовательности рабочего процесса с использованием обычно используемых NGS платформы, для определения структуры бактериальных сообществ12,,1314. Этот протокол был утвержден для использования в широком диапазоне растений хостов в недавно опубликованном исследовании корней, ризосфере и связанных почвах 18 видов растения, включая15 гаолян, Zea mays и Triticum aestivum. Этот метод также были проверены для использования с другими маркерных генов, как свидетельствует его успешное применение к изучению грибковых ITS2 маркер гена в изучении агавы микрофлора16,17 и клубники микрофлора 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. сбор и разделения корень Endosphere, ризосфере и образцы почвы

  1. Перед входом на местах, автоклав ультрачистая вода (по крайней мере 90 мл воды на сэмпл) для стерилизации. Подготовьте эпифиты удаления буфера (по крайней мере 25 мл на сэмпл) путем добавления 6.75 g KH2PO4, 8.75 г K2HPO4и 1 мл X-100 Тритон, 1 Л стерильной воды. Стерилизуйте буфер с помощью вакуум-фильтр с размером пор 0,2 мкм.
    1. Для шагов 1,2-1,5 чистые перчатки износа стерилизованное с этанолом на всех раз и замены перчаток между выборками для предотвращения загрязнения. Простерилизуйте все оборудование с 70% этанола и протрите все оборудование между выборками. До взятия пробы, определить глубину оптимальный выборки для вашего эксперимента и соответствовать все почвы и корня коллекции.
  2. Для сбора проб почвы оптом, использовать ядро сборщика этанола стерилизация почвы для получения почвы, которая свободна от корней растений, собирая ядро приблизительно 23-30 см от основания завода.
  3. Передача почвы в пластиковый мешок, гомогенизировать почвы мягкий встряхивания и передачи Алиготе образца грунта (примерно 600 мг) для заполнения одного 2-мл пробирку. Сразу же месте 2-мл пробирку на сухой лед или вспышки заморозить трубку в жидкости N2 до готовности приступить к экстракции ДНК (шаг 2).
    1. В некоторых средах окружающей почвы может содержать растительного материала. В этом случае используйте стерилизованные 2 мм сито для разделения мусора завод от почвы до помещения его в пластиковый пакет.
  4. Для сбора корень и ризосфере, используйте стерилизованное этанола лопатой выкапывают растения, заботясь, чтобы получить как много из корня как можно. Глубина зависит от завода. В то время как небольшие растения, такие как пшеница могут быть удалены путем выкапывать несколько сантиметров, крупных предприятий, таких, как сорго может потребоваться 30 см или более. Аккуратно стряхните излишки почвы от корней до тех пор, пока существует примерно 2 мм почвы, придерживаясь поверхности корня.
    Примечание: Будьте осторожны при работе с малыми заводами, хрупкие корни, или сухой, высокий глина контента почвах. В идеале должна существовать только тонким слоем почвы, оставаясь на корнях после встряхивания. Если остаются большие компоситы почвы, резинового молотка может использоваться выбить почву, осторожно нажав база стрелять. Если количество почвы, оставшиеся после этого процесса превышает или падает ниже 2 мм, следует отметить приблизительный толщина.
  5. Для крупных растений используйте стерильные ножницы и ножницы сократить представитель подраздел корней и поместить как минимум 500 мг, корня ткани в конической флакон 50 мл. Для меньших трав место всей корневой системы в пробирку. Добавьте достаточно эпифиты удаления буфера для покрытия корни, а затем сразу же поместить образец на сухой лед или вспышки заморозить образца в жидкости N2.
    Примечание: заботиться не переполняйте флакон 50 мл конические, как он будет делать Стиральная шаг трудно. Там должно быть достаточно пустого места, таким образом, что эпифиты буфера потока на дно, окружают корни всей флакона и крышка в верхней. Потому что некоторые травы имеют больше биомассы корень не будет вписываться в коническую пробирку 50 мл, подраздел корни должны быть собраны. Однако следует отметить, что резки корни может привести к эндофитные бактерий промывают в ризосфере дроби, так ломать корни должны быть сведены к минимуму. Если образцы не обрабатываются сразу же после возвращения в лаборатории, они могут храниться при температуре-80 ° C.
  6. Чтобы отделить ризосфере от корней, оттепель корень образец на льду, а затем sonicate корень образцы на 4 ° C на 10 мин с импульсами 160 Вт 30 s, разделенных 30 s. передачи корни в охлажденный (4 ° C), очистить 50 мл трубки с помощью стерильный пинцет. Не выбрасывайте оригинальный трубу с буфера и почвы, которая является ризосфере дроби (рис. 1).
  7. Центрифуга трубка, содержащая буфера и ризосфере для флэш-10 мин при 4 ° C, 4000 x g. Decant супернатанта, заморозить трубка, содержащая ризосфере дроби в жидкости N2и хранить ризосфере дробь в-80 ° C до готовности приступить к ДНК добыча (шаг 2).
  8. Для мытья корни, добавьте примерно 20 мл стерильной воды охлажденной (4 ° C) на долю корневой. Вымойте корня путем встряхивания энергично (от руки или смеситель, за 15-30 с) и затем слейте воду.
  9. Повторите этот шаг, по крайней мере дважды, до тех пор, пока не почвы остается на поверхности корня. Если экстракции ДНК (шаг 2) не производится немедленно, оберните корни в стерильных алюминиевой фольги, вспышки заморозить корни в жидкости N2и хранить образцы на-80 ° C до готовы приступить к экстракции ДНК.

2. ДНК добыча

Примечание: На протяжении шаги 2 и 3, чистые стерилизации с этанолом следует надевать перчатки во все времена, и вся работа должна быть выполнена на поверхности стерилизации с этанолом.

  1. Извлечь ДНК из образцов почвы и ризосфере.
    1. Использование стерильных шпатель для быстрой передачи 250 мг почвы и ризосфере из шагов 1.3 и 1.7 в отдельной коллекции трубок предусмотрено в коммерческих комплект изоляции ДНК предназначен для извлечения из почвы, а затем приступить к изоляции ДНК с помощью поставщика комплект Протокол.
    2. После элюирующие ДНК в Элюирующий буфер, поставляемых в комплект изоляции ДНК, храните ДНК при-20 ° C до готовности продолжить с шага 3.
  2. Извлечь из корневого образцов ДНК.
    1. Холод, стерилизованные ступку и пестик, используя жидкость N2. Отмерьте 600 до 700 мг, корня ткани и ткани в раствор. Осторожно добавьте достаточно жидкости N2 для покрытия корни.
    2. Молоть корни на мелкие кусочки. Продолжить процесс добавления жидкости N2 и шлифовальные (по крайней мере два раза, согласовываться между выборками), до тех пор, пока корни являются мелкий порошок. Убедитесь, что ткань корень не размораживать во время этого шага.
      Предупреждение: Использовать надлежащие средства личной защиты (лаборатории пальто, защитные очки и перчатки криогенных) при работе с жидкостью N2.
      Примечание: Для экстракции ДНК низкого качества, это может быть полезно измельчить в порошок избыток корни и хранить порошок-80 ° c.
    3. Быстро до корня порошок начинает таять, стерильные лопаточкой для передачи порошок корень в предварительно взвешенный 1.5 мл пробирок на льду. Запишите вес трубки и порошка. Как правило передается 300-400 мг порошка.
    4. Использование стерильных шпатель для быстрой передачи 150 мг порошка корня на коллекции трубу в коммерческих комплект изоляции ДНК предназначен для извлечения из почвы, а затем приступить к изоляции ДНК с помощью поставщика комплект протокола.
      Примечание: Для некоторых образцов корень, может быть высокой концентрацией органических веществ, оставшихся в ДНК Пелле, который предотвращает амплификации ДНК в PCR, особенно когда другой протокол извлечения ДНК (например., CTAB добычу) используется. При необходимости, очистите ДНК, следуя инструкциям, приведенным в экологической очистки комплект ДНК.
  3. Измерьте концентрацию всех образцов ДНК, используя флуориметр высок чувствительности benchtop.
    1. Добавьте 1-20 мкл каждого eluted образца ДНК в dsDNA высок чувствительности пробирного комплекта трубок. Добавьте флуориметр рабочего раствора (1: 200 краска: буфер) до 200 мкл.
    2. Подготовить две дополнительные пробирки, содержащие 10 мкл ДНК стандарт 1 (0 нг/мкл ДНК) или 10 мкл стандарт 2 (100 нг/мкл) и 190 мкл рабочего раствора флуориметр для каждого стандарта.
    3. Измерьте концентрацию стандартов и каждого образца. Если это не делается автоматически, рассчитайте концентрации ДНК от поглощения вывода методом линейной регрессии двух стандартов.

3. ампликон библиотеки подготовка и представление

  1. Настройка материалы для усиления реакции.
    1. Оттепель образцы ДНК при температуре 4 ° C и держать их на льду в шаг 3. Случайный порядок образцов ДНК, чтобы свести к минимуму предвзятость благодаря расположению на пластину ПЦР (Таблица 2).
    2. В 96-луночных ПЦР-планшете разбавляют ДНК от каждого образца в воде молекулярно класса до 5 нг/мкл в общем объеме 20 мкл. добавить 20 мкл молекулярного уровня воды скважин четыре угловых как негативный контроль для амплификации (пустые) (Таблица 2).
    3. Организовать перепутываются грунтовки (10 мкм) в PCR газа трубы или плиту 96-луночных таким образом, что они могут быть добавлены с многоканальные пипетки (рис. 2).
    4. Подготовьте достаточно мастер смесь ПЦР для того чтобы усилить каждый образец ДНК в трех экземплярах. Подготовить 1.5 мкл BSA (20 мг/мл), 37,5 мкл заранее сделал 2 x главный микс (состоит из буфера PCR, MgCl2, дНТФ и ДНК-полимеразы Taq ), 0,57 мкл хлоропласта PNA (100 мкм), митохондриальных PNA 0.57 мкл (100 мкм) и 25.86 мкл воды молекулярного уровня.
    5. Вылить смесь мастер в стерильные 25 мл многоканальные пипетки водохранилища и распространять 66 мкл мастер смесь в каждой скважине новой 96-луночных ПЦР пластины с помощью многоканальных дозаторов.
      Примечание: При расчете объемов реагент для основной смеси, убедитесь, что также включает 4 пустой скважины за тарелку.
    6. С помощью многоканальных дозаторов, мкл 6 5 нг/мкл ДНК (от нормализованные плиты ДНК) к пластине Мастер микс. Затем добавьте в мастер плита 1,5 мкл 10 мкм вперед грунтовки, таким образом, что каждый столбец имеет разные вперед штрих-код и 1,5 мкл 10 мкм вспять грунт, таким образом, чтобы каждая строка имеет различные обратный штрих-кодов (рис. 2).
      Примечание: Перед добавлением грунты, рандомизированных пластины и мастер смесь может использоваться для усиления его или ITS2 грибковых гены, если были добавлены различные грунтовки. Если это так, можно использовать подобные конструкции праймера.
    7. Спин вниз плита кратко в 3000 x g. использовать многоканальные пипетки осторожно перемешать, а затем разделить на три пластины с 25 мкл реакционной смеси.
      Примечание: Хотя три реплицирует не являются строго необходимыми, и уменьшается влияние технических изменчивости.
  2. Усилить ДНК в каждой пластины с помощью Термоциклер, набор для следующих условий: 180 s на 98 ° C, 30 циклов: 98 ° C на 45 s (денатурации), 78 ° C 10 s (PNA отжига), 55 ° C для 60 s (отжига праймера) и 72 ° C для 90 s (расширение) , затем 600 s при 72 ° C, после чего 4 ° C держать шаг. После усиления объединить три реплицировать пластины в один единый 96-луночных пластины.
  3. Количественного определения ДНК, используя высок чувствительности флуориметр реагенты в 96-луночных пластины читателя.
    1. 2 мкл каждого продукта PCR, в 96-луночных микропланшетов, наряду с 98 мкл флуориметр рабочего раствора (1: 200 краска: буфера). Включает 4 скважин как стандарты: 5 мкл ДНК стандарт 1 (0 нг/мкл ДНК), 1 мкл стандарт 2 (10 нг/мкл), 2 мкл стандарт 2 (20 нг/мкл) и 5 мкл стандарт 2 (50 нг/мкл). Затем добавьте флуориметр рабочего раствора для заключительного тома 100 µL.
      Примечание: Каждый образец может быть измерена с помощью benchtop флуориметр, как описано в шаге 2.3 Если плита читатель не доступен.
    2. Рассчитайте концентрации ДНК от поглощения вывода методом линейной регрессии четырех стандартов.
    3. Для успешно усиливается перепутываются продуктов (те, которые имеют больше чем 15 нг/мкл концентрации), бассейн 100 нг каждого образца в одном 1,5 мл трубку (Таблица 2).
    4. Рассчитайте средний объем выборок, добавляемого в пул, используя функцию =AVERAGE() в программу электронных таблиц. Добавьте объем «пустой» продуктов ПЦР проб имелось.
      Примечание: Поскольку «пустой» продукты PCR имеют свои собственные уникальные штрих комбинации, они можно упорядочивать для проверки любых загрязнений лаборатории.
  4. Измерить концентрацию совместного продукта с помощью benchtop флуориметр, как описано в шаге 2.3 и принимать 600 нг ДНК и развести в воде молекулярно класса в окончательный объем 100 мкл в 1,5 мл. Сохранить оставшиеся совместного продукта при-20 ° C.
  5. Вымойте 600 нг ДНК аликвота, следуя установленным процесс очистки ПЦР с парамагнитными очистки бисером в формате 96-луночных с некоторыми исключениями.
    1. Сделайте свежий 600 мкл аликвота 70% этанола. Встряхните бутылку магнитной бусины вновь приостановить бусы, которые оседают на дно.
    2. Добавьте 1 x объем (100 мкл) шарик раствора в 600 нг Алиготе ДНК. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
    3. Поместите трубку на магнитную подставку для 2 минут (или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным) для разделения бусы из раствора. Пока трубки магнитного стенд, аспирационная ясно супернатант тщательно не касаясь магнитные бусы и отбросить ясно супернатант.
      Примечание: на данный момент, продукция ампликон привязаны к магнитной бусины. Бусы, которые нарушенных или утраченных во время стремление приведет к потере ДНК.
    4. Оставьте трубки в магнитного стенд и 300 мкл 70% этанола на трубу; Инкубируйте 30 s. аспирата из этанола и отменить при комнатной температуре. Повторите этот процесс и удалить все этанола после второй стирки. Снять трубку из магнитного стенд, а воздух сухой за 5 мин.
    5. 30 мкл молекулярного уровня воды сушеные бисером и смешивать, закупорить 10 раз. Инкубируйте при комнатной температуре на 2 мин возвращения трубки магнитного стенд за 1 мин, чтобы отделить бисер от решения. Передать элюата новой трубки.
      Примечание: Магнитные шарики не будет затрагивать течению реакций.
  6. Измерьте конечная концентрация очищены, обобщённые ДНК с помощью benchtop флуориметр, как описано в шаге 2.3. Разбавить Алиготе до 10 Нм в окончательный объем 30 мкл, или концентрации и объема, предпочитают объекта последовательности.
  7. Пользоваться услугами механизма виртуализации для последовательности ДНК на платформе NGS, 2 x 300 bp в паре конец последовательности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выполнение рекомендуемых протокола должно привести к набор индексированных паре конец чтений, которые могут быть сопоставлены обратно каждый образец и назначен либо бактериальной оперативной таксономических единиц (ОТУ) или точную последовательность вариант (ESV, также упоминается как ампликон последовательности вариант (ASV) и sub-operational таксономическая единица (sOTU)), в зависимости от анализа ниже по течению. Для получения высокого качества последовательности данных, необходимо по...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол показывает установленные трубопровода для изучения корня endosphere, ризосфере и почвы микробных композиции, от выборки поля Образец обработки и ниже по течению последовательности. Изучение связанных корня microbiomes представляет уникальные проблемы, из-за частично трудности, присущие выборки из почвы. Почвы очень разнообразны с точки зрения физических и химических свойств, и различных почвенных условий могут быть разделены в несколько миллиметров28,29

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS поддерживается программой стипендий аспирантов исследований NSF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10/20 &; L фильтрованные наконечники для микропипетокСША Scientific1120-3810Можно заменить на аналоги от других поставщиков.
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 млСША Scientific1615-5510можно заменить на аналоги других поставщиков.
10 & микро; L многоканальный дозаторEppendorf3122000027Может быть заменен на аналог от других поставщиков.
10 & микро; L, 100 & микро; L, и 1000 &микро; L микропипеткиEppendorf3120000909можно заменить на аналоги других поставщиков.
100 &микро; L многоканальный дозаторEppendorf3122000043Может быть заменен на аналог от других поставщиков.
1000 &микро; L фильтрованные наконечники для микропипетокСША Scientific1122-1830Можно заменить на аналоги от других поставщиков.
Микроцентрифужные пробирки объемом 2 млСША Scientific1620-2700можно заменить на аналоги от других поставщиков.
Почвенное сито 2 ммПоставщики лесного хозяйства60141009Может заменить на аналог от других поставщиков.
200 &микро; L фильтрованные наконечники для микропипетокСША Scientific1120-8810Можно заменить на аналоги от других поставщиков.
Емкости 25 млVWR International LLC89094-664Можно заменить на аналог от других поставщиков.
Конические флаконы объемом 50 млThermo Fisher Scientific352098можно заменить на аналоги от других поставщиков.
Вакуумные фильтры объемом 500 мл (0,2 & микро; m размер пор)VWR International LLC156-4020
96-луночные микропланшетыСША Scientific655900
96-луночные ПЦР-планшетыBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP шарикиThermo Fisher ScientificNC9933872Инструкция по применению:<бр/> https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Алюминиевая фольгаBoardwalk7124Может быть заменена на аналоги от других поставщиков.
Аналитические весы с разрешением 0,001 гOhaus PioneerPA323можно заменить на аналоги других поставщиков.
Ультразвуковой аппарат Bioruptor PlusДиагенодB01020001
бычьей сывороткой альбумином (БСА) 20 мг/млNew England BiolabsB9000S
ЦентрифугаEppendorf5811000908включая 50 мл и 96-луночные пластины адаптеры для ведра
Криогенные перчаткиMillipore SigmaZ183490Может заменить на аналог от других поставщиков.
Комплект DNeasy PowerClean (опционально)Qiagen Inc.12877-50Ранее MoBio
DNeasy PowerSoil kitQiagen Inc.12888-100Ранее MoBio
Сухой ледЛюбойNA
DynaMag-2 магнитThermo Fisher Scientific12321DНе заменять
этанолVWR International LLC89125-188Можно заменить на аналог от других поставщиков.
Пакеты для заморозки галлонного размераZiplocNAможно заменить на аналоги от других поставщиков.
Gemini EM Microplate ReaderMolecular DevicesEMМожет использовать другой флуориметр, который считывает 96-луночные планшеты сверху.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Lab coatWorkriteJ1367Может заменить на аналог от других поставщиков.
Жидкость N2AnyNAМожно заменить на аналог от других поставщиков.
Жидкость N2 дьюараThermo Fisher Scientific4150-9000Может заменить на аналог от других поставщиков.
Система очистки сверхчистой воды Milli-Q MilliporeSigmaSYNS0R0WW
Мини-центрифугаEppendorf5404000014
Молекулярная водаThermo Fisher Scientific4387937Может заменить на аналог от других поставщиков.
МинометыВВР Интернешнл ООО89038-150могут быть заменены на аналоги других поставщиков.
Нитриловые перчаткиThermo Fisher Scientific19167032BМожно заменить на аналог от других поставщиков.
Бумажные полотенцаООО «ВВР Интернешнл» BWK6212можно заменить на аналог от других поставщиков.
Пленка для запайки ПЦР пластиныThermo Fisher ScientificNC9684493
ПЦР стрип пробиркиСША Scientific1402-2700
PestlesVWR International LLC89038-166Может заменить на аналог от других поставщиков.
Пластиковые шпателиLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNAs - хлоропласты и митохондриальныеPNA BioNAОбязательно проверьте последовательность биоинформатически
защитных очковMillipore SigmaZ759015Может заменить на эквивалент от других поставщиков.
Флуориметр Qubit 3.0Thermo Fisher ScientificQ33216
Набор для анализа dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
Резиновый молоток (опционально)Ace Hardware2258622Может заменить на аналог от других поставщиков.
Ножницы или ножницыВВР Интернешнл ООО89259-936можно заменить на аналог от других поставщиков.
ЛопатуHome Depot2597400можно заменить на аналогичную от других поставщиков.
Грунтовый керносборник (малый диаметр: < 1 дюйм)Ben Meadows221700Может заменить на аналог от других поставщиков.
ПульверизаторSanta Cruz Biotechnologysc-395278можно заменить на аналог от других поставщиков.
Стандартные обессоленные грунтовки со штрих-кодом (10 & микро; M) (Таблица 1)IDTNA4 нмоль Ultramer DNA Oligo со стандартным обессоливанием. Адаптер NGS и праймер для секвенирования (Таблица 1) предназначены для использования с Illumina MiSeq с использованием химического состава v3.
ТермоамплификаторThermo Fisher ScientificE950040015можно заменить на аналог от других поставщиков.
Triton X-100Sigma-AldrichX100можно заменить на аналог от других поставщиков.
Весовые лодкиSpectrum ChemicalsB6001Wможно заменить на аналоги от других поставщиков.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592(2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827(2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209(2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773(2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062(2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257(2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804(2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258(2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360(2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Root Microbiome16S rRNA SequencingSoil DNA ExtractionRhizosphere IsolationRoot EndosphereAmplicon Library PreparationPCR PurificationBacterial Community AnalysisPlant Microbiome ProfilingDNA Isolation Kit

Related Articles