Методическая статья

Лазерная захвата Microdissection высоки чисто Трабекулярная сеть от мыши глаз для анализа выражения гена

DOI:

10.3791/57576

⸱

3 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол для захвата microdissection воспроизводимый лазер (LCM) для изоляции Трабекулярная сеть (TM) для анализа течению РНК. Возможность анализировать изменения в экспрессии генов в НП поможет понять глубинные механизмы глазных заболеваний, связанных с ТМ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лазерная захвата microdissection (LCM) позволило анализ выражения гена одной клетки и обогатили клеточных популяций в разделах ткани. LCM является отличным инструментом для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе дифференцировки клеток и развития и прогрессирования различных заболеваний, в том числе глаукомы. Глаукома, которая включает семейство прогрессивной оптической невропатии, является наиболее распространенной причиной необратимых слепоты во всем мире. Структурные изменения и повреждения в пределах Трабекулярная сеть (TM) может привести к увеличению внутриглазного давления (ВГД), который является основным фактором риска для развития глаукомы. Однако точное молекулярных механизмов все еще плохо поняты. Способность выполнять анализ выражения гена будет иметь решающее значение в получении дальнейшее понимание функции этих клеток и его роль в регуляции ВГД и глаукома развития. Для достижения этой цели, воспроизводимый метод для изоляции высоко обогащенного ТМ от замороженной секции мыши глаза и метод для анализа выражения течению гена, такие как RT-ПЦР и РНК-Seq необходима. Метод, описанный здесь разрабатывается изолировать высоки чисто ТМ от мыши глаз вниз по течению цифровой ПЦР и анализ microarray. Кроме того этот метод может быть легко адаптирована для изоляции других высоко обогащенного глазной клеток и клеточных компартментов, которые было сложно изолировать от мыши глаз. Сочетание анализа LCM и РНК может способствовать более полное понимание сотовой событий, лежащие в основе глаукомы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глаукома – это группа заболеваний, характеризуется оптической невропатии и ретинопатии, что в конечном итоге приводит к необратимой слепоте1,2. Предполагается, что к 2020 году более 70 миллионов людей во всем мире будет жить с некоторой формой болезни3,4,5,6,7. Первичной открытоугольной глаукомы (POAG), наиболее распространенным типом глаукомы, характеризуется уменьшением оттока водянистой влаги (AH), приводит к увеличению внутриглазного давления (ВГД)8,9,10, 11,12,,13143,,1516,17,18. Левый untreated, хронически повышенным ВГД приводит к прогрессивной и необратимого повреждения сетчатки и зрительного нерва голову, вызывая радиальные слепота1,2,19. Все текущие методы для замедления прогрессирования глаукомы акцент на снижение ВГД, либо снижения темпов производства Ах, цилиарного тела или повышения его отток1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Трабекулярная сеть (TM) играет жизненно важную роль в активное регулирование основной путь оттока AH, и его неправильная функция является причинным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Однако молекулярные механизмы, связанные с дисфункцией ТМ и как он регулирует дренаж AH еще не полностью изучены и в настоящее время является одним из основных направлений глаукома исследование1,2,19, 20. Хотя несколько генома всей ассоциации исследования (GWAS) связывают ряд генов глаукомы и повышенная устойчивость к AH отток объекта на ТМ, точные молекулярные механизмы, которые приводят к болезни не являются полностью осознана21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Животные модели значительно расширили наши текущие знания о прогрессирования заболевания в глаукомы (подробно рассмотрены в3,,1516,26,27,28, 29,-30,-31,-32,-33). Некоторые новаторские методы были разработаны для изучения ТМ34,35,36 , и эти методы широко используются для продвижения нашего нынешнего понимания нормальных и пораженной ткани. Одной из областей, которые не были широко изучены является использование генетически модифицированных мыши модели для изучения молекулярных механизмов ТМ отказа. Трансгенные забивные и нокаут-мыши исследования ТМ связанных генов, например Myocilin (Myoc)37,38 и39 Cyp1b1были основными средствами для изучения молекулярных механизмов ТМ функция. Понятно, что небольшой размер ТМ в мышах представляет серьезное препятствие, которое необходимо преодолеть для того, чтобы начать учиться этой ткани. Мышь модели представляют собой мощный инструмент для изучения генетики и молекулярных механизмов заболевания, хотя достижения в области технологий LCM предоставляют необходимые инструменты для расширения возможностей исследования маленьких и самых деликатных тканей, включая ТМ.

В настоящем докладе надежных и воспроизводимых метод описан для LCM высокообогащенного ТМ от мыши глаз вместе с последующей РНК изоляции и усилители для анализа течению выражение. Подобные методы были использованы успешно мышей изолировать других типов глаз тканей40,41,42,,4344, методологии, сообщили здесь могут быть применены к другой дискретные тканях глаза для изучения белков, ДНК, РНК и микроРНК. Важно отметить, что этот метод позволяет использовать генетически измененных мышей, чтобы лучше понять молекулярный патогенез ТМ обесценения глаукомы и глазные болезни3,,1516,17 ,18,,2631,45,46. Способность изолировать ТМ мыши глаза LCM будет полезным способом в получении дальнейшее понимание молекулярных механизмов нескольких глазных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Национальный институт экологических медицинских наук (NIEHS) животное уход и использование Комитета (ACUC) одобрил все методологии настоящего исследования под NIEHS животное изучить предложение IIDL 05-46.

1. оптимальное ткани коллекции для лазерной Microdissection

  1. Получить 2-3-месяца old мышей, мужского или женского пола C57BL/6. Усыпить с CO2 минимум 1 мин, или до прекращения дыхания. Удаление животное из клетки и заверить смерти шейки матки дислокации, обезглавливание или торакотомии.
  2. Перед рассечение убедитесь, что все инструменты рассечение чистой и стерилизовать.
    Примечание: Для удаления глаза изогнутые ножницы и щипцы с зубчатыми наконечником (предпочтительный размер чаевых: 0.5 x 0,4 мм) будет необходимо.
  3. Лег мыши на плоской поверхности на его стороне так, что глаз легко доступен. Цепляемся угла глазной щели (угол глаза) с щипцами для стабилизации мыши, а затем с помощью изогнутые ножницы, стоящих перед кривой от глаз, вырезать вокруг глаз, используя глазницы в качестве руководства до глазного яблока, легко могут быть взяты из розетки (не используйте кривой Советы ножниц).
  4. Осторожно потяните и, используя изогнутые ножницы, вырезать зрительного нерва, которая выпускает глаз от орбитального сокета. Осторожно удалите не глазных тканей из глаз и промыть в 1 x-фосфатный буфер (PBS). Повторите 1.3-1.4 для контралатеральной глаз.
  5. Пятно глаз салфеткой ткани, чтобы удалить влагу до внедрения. Место глаз в образец формы (25 x 20 x 5 мм3), так что объектив и зрительного нерва параллельно верхней скамьи для получения сагиттальной секций. Вставлять глаза в оптимальной резки температуры (O.C.T.) соединение и место на сухой лед для замораживания. После того, как замороженные, храните блоков-80 ° c.

2. замороженные раздел Подготовка к лазерной Microdissection

  1. Прежде чем использовать инкубировать Терефталат полиэтилена (любимчик) мембраны слайды в крест-компоновщик УФ на максимальной мощности по 45 мин.
  2. Спрей РНКазы обеззараживания решение на щетку, щипцы, муфты банки и монтажа патрона. Тщательно протрите. Сполосните свободной от нуклеиназы водой и высушите. Протрите криостат с 100% этанола, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  3. Отрегулируйте криостата до-18 ° C. Удалите один из замороженных блок от-80 ° C морозильник одновременно и доставить криостат с сухим льдом. Разрешить замороженные блок, чтобы сбалансировать с температурой криостат для минимум 10 мин.
  4. Выдавить небольшое количество O.C.T. на монтаж блока (рис. 1A) и снимите блок ткани от плесени и осторожно поместите блок на монтажный зажим (рис. 1B). Как только блок ткани на монтажа патрона является замерзла, вставьте держатель образца криостата (рис. 2A).
  5. Отрегулируйте криостата сократить 8 мкм секций и тщательно раздел через O.C.T. блок для достижения образца ткани. Как только ткани наблюдается, остановить секционирование, обрезать замороженных блоков на всех сторонах, с использованием чистого лезвие бритвы и оставляют 3-4 мм O.C.T., окружающие ткани, чтобы включить обработку с кистью (рис. 2B). Используйте новую щетку чистой краской вместо рулон пластины между каждого изменения образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения образца.
  6. Раздел через глаз, работает быстро. Пятно, пятно каждый третий раздел от наводнения на слайд с быстрой одношаговый гематоксилином и эозином (H & E) для 60 s, промыть водопроводной воды, воздух сухой, ясно в таможенного агента и смонтировать на слайде заряженных стекла с coverslip. Просмотр под микроскопом и продолжить резании до тех пор, пока ТМ проявляется в секции отрезока.
  7. Как только ТМ начинает появляться, вырезать 2 секции и смонтировать на заряженных стекла слайд для обычной H & E пятнать сформировать схему для резки с LCM.
    Примечание: Смотрите раздел 3 для карты и окрашивание деталей.
  8. После того, как первый H & E карта слайд, вырезать и линия 6 последовательных 8-мкм толщиной секций в криостат и одновременно подключить на PET мембраны слайд (рис. 3а, B). Придерживайтесь ткани, кратко двигая перчатках пальцем вдоль задней части мембраны. После монтажа, место PET мембраны слайд сразу в поле слайд на сухой лед.
    Примечание: Меньше секций могут быть установлены, однако, рекомендуется установка нескольких разделов на слайд сразу для уменьшения деградации РНК, ограничивая количество времени, каждый раздел подвергается воздействию воздуха комнатной температуры.
  9. Далее раздел глаз, после каждые два PET мембраны слайды с 6 секциями, собрать две секции на слайде заряженных стекла для создания другой слайд карту для H & E пятнать. Продолжить, секционирование, примерно 100 последовательных 8-мкм толщиной секции, пока ТМ больше не видна. Подтвердите, быстро пятнать один раздел на слайде заряженных стекла (см. 2.6).
  10. Хранить все ПЭТ мембраны слайды при температуре-80 ° C для использования в дальнейшем LCM.

3. H & E карта слайд окрашивание протокол и морфологический обзор

  1. Чтобы визуализировать и обзор карты слайды на слайдах заряженных стекла, исправить ткани немедленно передавать в окрашивание кувшин наполнен 100 мл раствора быстрой фиксации для 7 s. полоскания слайд путем окунать его в дистиллированной воде 10 - 20 раз , затем перенесите слайд муфта сосуд с чистой дистиллированной воды.
  2. Удалить слайд из воды и помарки сухой кромки с wipe ткани. Пипетка 200 мкл изменение фильтруют гематоксилином Харрис на каждой секции и Инкубируйте 30 s при комнатной температуре. Тщательно промойте слайд под проточной водой до тех пор, пока вода течет ясно. Пятно конец слайда с wipe ткани между каждым шагом (блот между каждым шагом от 3,2-3,5), чтобы удалить лишнюю жидкость.
  3. Место слайда в однократном ПБС при комнатной температуре за 30 s. Затем, тщательно промойте слайд под проточной водой для 30 s.
  4. Погрузите слайд 3 - 4 раза в 95% этаноле ванну. Применить раствор красителя достаточно эозина Y для покрытия тканей на слайде и Инкубируйте 15 s при комнатной температуре.
  5. Промывайте слайд в 95% этаноле ванна два раза с быстрой провалы 10-20. Промывайте слайд в 100% этанола ванна два раза с быстрой провалы 10-20. Затем промойте слайд два раза в ксилоле ванна (10-20 по быстрой провалы).
  6. Маунт, применяя смолистые монтажа средних тканей, добавить coverslip тщательно, чтобы избежать воздушных пузырей и дайте высохнуть на ночь в капюшоне.
  7. Обзор H & E слайды, визуально или с помощью цифровых слайд сканера. Идентифицировать карту слайды с ТМ четко видны и доступны для резки. Используйте PET мембраны слайды между этими карта слайды для LCM.

4. Полиэтилен полиэтилентерефталата (ПЭТ) мембраны слайды протокол обработки и окрашивания

  1. До удаления PET слайды из морозильной камеры сначала подготовить количество кресил фиолетовый раствор путем растворения количество кресил фиолетовый ацетата 0,3 г в 20 мл 75% этанола и поместите на шейкер для 2 h. фильтр решение с 0,22 мкм стерильным фильтр и хранить при 4 ° C не более чем 6 мес тыс.
  2. Подготовьте спиртовым раствором эозина Y с свежими 75% этиловом спирте в соотношении 1:4. Подготовьте фиксации (75% этиловом спирте) и обезвоживания решения (75%, 95% и 100% этиловом спирте) в чистой, свободной от нуклеиназы, 50 мл конические полипропиленовые трубы на льду. Каждое решение добавьте АБС битор РНКазы.
  3. Удалите поле слайд, содержащий разделы замороженные ткани от-80 ° C морозильник и поместите его на сухой лед. Процесс один слайд на время. Исправить слайды, поместив слайд сразу в холодную этанол 75% для 30 s.
  4. Аккуратно погрузите слайд в свободной от нуклеиназы воде на 10-15 s распустить O.C.T. без вмешательства в разделах ткани.
  5. Тщательно Пипетка 300 мкл 1,5% количество кресил фиолетовый ацетата раствор непосредственно на разделы и проинкубируйте 45 s при комнатной температуре. Затем вымойте один раз, поместив его в ванну этанол 75% для 30 s. пипеткой 200 мкл рабочего раствора эозина Y-раствор на разделы и Инкубируйте 3-5 s.
  6. Обезвоживания тканей, поместив слайд впоследствии в 75% этанола 95% этиловом спирте и, наконец, 100% этанола ванна для 30 s каждый. Пятно в конце слайда с wipe ткани между каждый шаг, чтобы удалить лишнюю жидкость. Пусть воздух слайд полностью высушите под капотом на 5 мин. После высыхания, выполняют LCM сразу же после этого.
    Примечание: Рекомендуется избегать использования ксилол для этого шага, он может вызвать разделов ткани неадекватно облигаций на слайд мембраны и снижает эффективность захвата ткани.

5. Лазерная Microdissection с УФ лазер

  1. Включите компьютер и разрешить загрузку. Включите Микроскоп белый свет блок питания. Включите УФ лазер ключ и желтый светодиод загорится. Запустите программу LCM, позволяют полностью загрузки и живое видео будет отображаться. Нажмите кнопку лазера на поле контроллера и загорится зеленый светодиод.
  2. Загрузить новый слайд стекла на сцену Микроскоп, а затем поместить слайд мембраны PET с окрашенных тканей лицевой стороной вниз прямо на вершине стеклянное скольжение. Убедитесь, что мембрана и стеклянное скольжение связыванны плотно на микроскопа.
  3. LCM Пуск первого устанавливая пределы слайда. Выберите низкий 4 X масштаб на панели объективных (рис. 4). Затем определите рабочую область слайда мембраны, перемещая Микроскопы xy этап до тех пор, пока верхний левый угол, где сходятся металла и мембрана видна в живой видео-канал, нажмите кнопку «Предел 1» и красный прямоугольник будет появляться на roadmap. Далее перейти к стадии xy в противоположный угол и нажмите на кнопку «ограничить 2». Нажмите кнопку «Проверка» для создания образа схема оболочек и тканей между установленных лимитов.
  4. Дважды щелкните вблизи ТМ одного из глаз секций в рамках «дорожной карты», ТМ могут быть расположены вблизи вершины угла иридо (Рисунок 5A). После того, как была обнаружена ТМ, увеличьте масштаб до 10 X и вручную фокус на ТМ. Повторите с 20 X и 40 X целей. Когда ТМ находится в фокусе с тем 40 X (Рисунок 5B), перейдите в пустую область рядом (фокус может потребоваться немного скорректированы), выберите «инструмент freehand рисования» и нарисуйте длинной линии на пустой области ткани.
  5. Задайте параметры лазерного, чтобы «отрезока скорость» составляет 34%, «фокус» – 58%, и «власть» составляет 70% (Рисунок 4), а затем нажмите кнопку «Вырезать». Корректировать тонкой лазерная скорость, фокус, и параметры мощности до тех пор, пока четкой и тонкой леской наблюдается (см. рис. 5 c). Для точной резки, убедитесь, что операция резки по следующим нарисованные линии.
  6. Загрузить изоляции труб крышку держателя крышки и откройте трубки. Прикрепите держатель крышка Кап-подъемник и убедитесь, что трубка инвертируется. Заверить, что клей крышка материала выступает за кончик крышку, чтобы убедиться, что нужный ткани должным образом захвачено.
  7. Выберите режим «Вручную» рассечение в панели программного обеспечения. Внимательно изучите, что ТМ, (Рисунок 5B) находится непосредственно под изоляции труб. Установите баланс белого и отрегулировать яркость, чтобы получить оптимальное качество изображения (рис. 4).
  8. Чтобы начать резки, вручную настроить фокус и нарисуйте линию с помощью карандаша, убедитесь, что крышка коллекции остается в верхнем положении, пока не касаясь мембраны. Ничья частичной круги возле где ТМ встречает склеры (рис. 5 c), затем нажмите «Вырезать». После этого первого сокращения, поместите колпачок в нижнем положении и повторно настроить фокус, а затем нарисуйте две линии в открытых или свободного пространства для подключения двух частичных круги, завершить круг вокруг ТМ, затем нажмите «Вырезать» и собирать ткани из раздела , убедитесь, что ТМ была подхвачена microdissection колпачок (Рисунок 5 D-F).
  9. Установите крышку обратно в верхнем положении и повторить (5.2-5.8) на остальных участках. Слегка отрегулируйте положение колпачок, так что все изолированные примеры помещается на крышку и не перекрываются (рис. 5 g). Для обеспечения согласованности окно времени для одного слайда — 20 минут использования меньше секций за животное слайда, если требуется больше времени для изоляции ТМ из всех разделов. Для следующего ПЭТ мембраны Вставьте новый изоляции труб и повторите раздел 5.

6. lysis ткани ТМ Microdissected

  1. Свеже Подготовьте РНК литического буфера для лизируют LCM изолированные ткани. Добавьте 10 мкл β-меркаптоэтанол каждый 1 мл буфера lysis. Храните литического буфера с β-меркаптоэтанол при комнатной температуре не более 1 месяца.
  2. Снять колпачок держателя в течение 20 мин от начала microdissection изоляции труб. Визуализация поверхности колпачок на глаз для обеспечения захвата ТМ.
  3. Тщательно Пипетка 10 мкл буфера lysis на крышке коллекции трубки обеспечение литического буфера полностью покрывает microdissected TM. Аккуратно закройте клей крышка и инкубировать коллекции трубу вверх вниз при комнатной температуре в течение 10 мин. После инкубации центрифуги на 800 x g на 2 мин и lysate на сухой лед. Хранить лизатов на-80 ° C для последующей очистки и анализа.

7. РНК изоляции и анализ качества

  1. Анализировать качество РНК, оттаивания образцов при комнатной температуре. Бассейн вместе все образцы изолированы от мыши в один свободный РНКазы 1,5 мл отцентрифугировать трубку.
    Примечание: например, для каждого биологического реплицировать, 10-12 трубы с microdissected наконечниками в 10 мкл lysate были созданы и все лизатов были переведены в одну трубу для каждого биологического репликации (lysate µL 100-120).
  2. Каждый lysate решение добавьте один объем свежеприготовленные 70% этанола (сделанные с РНКазы свободной воды). Затем очищайте всего РНК после руководство пользователя Комплект изоляции РНК. Обеспечивает удаление геномной ДНК от каждого образца РНК.
    Примечание: Геномной ДНК может мешать течению РНК анализа.
  3. Измерьте качество РНК, изолированные от ТМ путем объединения образцов из каждой мыши и анализа целостности рибосомная РНК (Рисунок 6A).
    Примечание: Из-за небольшого размера ТМ, пики рибосомной РНК не может быть наблюдаемой (Рисунок 6B) на РНК качество профиля (две пики наблюдаются между 1000-4000 bp в рисунке 6A, C) который используется для вычисления числа целостности РНК (Рин) 47.
    1. Получите более точное измерение целостности РНК, изолировать РНК из более обильные оставшиеся ткани на слайде мембраны. Для получения представитель Рин, изолировать РНК от глазных тканей на слайде мембраны дозирования 10 мкл лизис буфера на раздел одной ткани и выполнять РНК изоляции. Анализ качества РНК и рассчитать Рин (рис. 6 c).
  4. Для нисходящие РНК приложения используйте низкий входной РНК комплект для секвенирования и cDNA поколения библиотека для получения воспроизводимых результатов как 80 секций LCM изолированных ТМ.

8. анализ

  1. Чтобы убедиться, что ткани собранные в действительности обогащается в ТМ связанных генов, соберите несколько дополнительных РНК от microdissected весь глаз, склера, Ирис, сетчатки, роговицы и объектив от 3 отдельных мышей. Использовать собранные Эта РНК в сочетании с LCM РНК от изолированных ТМ и цилиарного тела, собранных из 4 отдельных мышей.
  2. Конвертировать РНК из образцов microdissected было cDNA, используя набор cDNA обратной транскрипции. Усилить РНК от изолированных LCM образцов и конвертировать в cDNA, используя низкий вклад cDNA комплект РНК.
  3. Анализировать все РНК для Трабекулярная сеть, выражая генов, myocilin (MYOC) и альфа актин-2 (ACTA2) и нормализации с помощью HSP90a1 уборки гена цифровой ПЦР (рис. 7A-B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM собранные РНК от ТМ и цилиарного тела от 4 разных мышей был выделен для того, чтобы иметь возможность анализировать экспрессии генов и сравнить с тем выражение в весь глаз, склера, Ирис, сетчатки, роговицы и объектив изолированы от трех отдельных мышей. ТМ, выражая генов, MYOC48 и49 ACTA2были проанализированы во всех тканях, собранных для подтверждения, что изолированные ТМ образцы были действительно сильно обогащенный ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ТМ играет жизненно важную роль в поддержании активно гомеостатических ВГД и его дисфункции широко признается основным побудительным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Количество единичных нуклеотидных полиморфизмов в нескольких генов определены методом GWAS анализа были связаны с риск увеличения глаукомы и повышенная устойчивость к AH отток объекта на ТМ; Однако точные молекулярные механизмы, которые приводят к этой бо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Праймеры ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282)BioRad10031252FAM
Agilent 2100 БиоанализаторAgilent TechnologiesG2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kitAgilent Technologies5067-1513
BioRad QX200 Капельная цифровая система ПЦРBioRad
Маленькая кисть
для рисованияЗаряженное стекло Предметное стекло Предметное стеклоThermo scientific4951PLUS-001
Cresyl Violet АцетатSigma AldrichC5042
Изогнутые ножницы
Eosin Y dyeThermo scientific71204
Щипцы
HemaCenAmerican MasterTechSTHEM30
высокопроизводительный набор для обратной транскрипции кДНКПрименяемые биосистемы4368814
Праймеры для дПЦР Hsp90a (dMmuCPE5097465)BioRad10031255VEX
Leica CM1850 CryostatLeica
Millex-GS фильтрующий блокEMD MilliporeSLGS033SB0,22 & микро; m
MMI CellCut UV Cutting ModelМолекулярные машины и Отрасли промышленностиLCM intru
MMI CellTools Программное обеспечениеМолекулярные машины и Промышленность50202Программное обеспечение LCM
Пробирка для образцов для микродиссекции лазерного захватаПродукты ASEEST-LMD-M-500Изоляционная пробирка / Произведено Microdissect GmBH в Германии и растрачено ASEE Products
Пробирка для образцов для микродиссекции лазерного захвата (альтернатива)Молекулярные машины и Промышленность
модифицированная Harris HematoxylinThermo scientific7211FAM
MYOC ddPCR Праймеры (dMmuCPE5095712)BioRad10031252
PBS
Memebrane Slides, РНКазные продуктыASEEFS-LMD-M-50rМембрана из полиэтилентерефталата (ПЭТ) / Производится Microdissect GmBH в Германии и распыляется Продукты ASEE
Мембрановые слайды, без РНКазы (альтернатива)Молекулярные машины и Промышленность50102
Rapid FixThermo Scientific6764212H& E окрашивание
RLT BufferQiagen79216лизис бафффер, используемый для образцов
LCM RNAseZapSigmaR2020раствор для обеззараживания РНКазы
Protect RNA Ингибитор РНКазыSigma AldrichR7397
RNeasy Micro KitQiagen74004Набор для выделения РНК
SMART-Seq v4 Ultra Low Input РНК KitTakara Clontech634888набор с низким входом РНК в кДНК для образцов LCM
SuperMix (без dUTP)BioRad1863023цифровой мастер-микс для ПЦР
Tissue-Tek Cryomold (25 мм x 20 мм x 5 мм)Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Stratalinker UV CrosslinkerStratagene400075
XyleneMacron8668
этанола Изогнутый и зазубренный наконечник (предпочтительный размер наконечника: 0,5 x 0,4 мм)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Laser Capture MicrodissectionTrabecular MeshworkMouse EyesGene Expression AnalysisRNA IsolationDigital PCRMicroarray AnalysisH E StainingPET Membrane SlidesCryostat Sectioning

Похожие статьи