Методическая статья

A11-позитивных β-амилоида олигомера подготовки и оценки, с помощью Dot промокательной анализ

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57592

⸱

22 мая 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как подготовить олигомеров значения из синтетических пептидов в пробирке и оценить относительные количества значения олигомера, точка промокательной анализа.

Аннотация

Β-амилоида (значения) – гидрофобная пептид с внутренней тенденцией самостоятельно собрать на агрегаты. Среди различных агрегатов значения олигомера широко признается в качестве ведущих нейротоксина в прогресс болезни Альцгеймера (AD) и считается важным событием в патогенезе AD. Таким образом, значения олигомера ингибиторов может предотвратить нейродегенеративные и имеют потенциал, чтобы быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Однако различные формирования протоколов олигомера значения может привести к олигомеров с различными характеристиками. Кроме того не есть много методов, чтобы эффективно экран значения1-42 олигомера ингибиторов. Антитело A11 может реагировать с подмножеством токсичных значения1-42 олигомера с β-лист анти параллельной структуры. В этом протоколе мы опишем, как подготовить пример олигомер богатые A11-положительные значения1-42 из синтетических значения1-42 пептида в пробирке и оценить относительные количества A11-положительные значения1-42 олигомера в образцах, точка промокательной анализ с помощью A11 и значения1-42-конкретные 6E10 антител. Используя этот протокол, ингибиторы A11-положительные значения1-42 олигомера также может быть изолированы от полуколичественного экспериментальные результаты.

Введение

Болезнь Альцгеймера (AD) является одним из наиболее важных нейродегенеративных заболеваний, затрагивающих пожилых людей во всем мире1. Широко признается, что аномальные агрегации β-амилоида (значения) может быть ведущим фактором патологических AD. Aβ агрегаты являются основными компонентами старческое бляшек, один из биологических маркеров в мозгах пациентов AD. Кроме того статистические значения, в частности олигомеров, производят мощный нейротоксичности, который может быть причиной гибели нейронов как AD прогрессирует. Таким образом, ингибирование значения олигомера формирования может предотвратить нейродегенеративные, и значения олигомера ингибиторы могут быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Многие исследования использовали синтетический пептид значения образуют олигомеров в пробирке, изучения морфологии и структур искусственных значения олигомеров и расследовать ингибиторов Aβ олигомера с помощью в vitro модели2,3 , 4. Однако, различные в vitro формирование протоколов олигомера значения может привести к олигомера с различных морфологических характеристик, которые могут привести к несравненный результаты среди различных исследовательских групп. Таким образом срочно необходима стандартная формирования протокола для значения олигомера.

До сих пор не так много методов поступили непосредственно обнаружить значения олигомеров. Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА), -Денатурирующий гель-электрофорез, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) и точка промокательной анализ может использоваться для изучения объема и/или морфология Aβ олигомера в vitro5, 6. Например, морфологии и структуре значения олигомера может наблюдаться в ТЕА. Относительные количества и молекулярного размера значения агрегатов может быть измерено-Денатурирующий гель-электрофорез. ELISA может использоваться для определения значения олигомера в сыворотке, плазме и выдержки из ткани мозга. И наконец точка промокательной анализ, метод, используемый для выявления, анализа и идентификации белков, могут использоваться для оценки относительной концентрации Aβ олигомера в различных образцах с помощью олигомер значения зависимости и антител. Кроме того точка промокательной пробирного предлагает значительную экономию времени, как электрофорез геля и blotting процедуры гели не требуются. Таким образом этот assay обычно используется для экрана потенциальные значения олигомера ингибиторов. Общая цель настоящего Протокола заключается в описания метода сравнительно простых, надежных и воспроизводимых подготовить пример олигомер богатые значения1-42 , проанализировать количество значения1-42 олигомера точка промокательной анализа и экран значения олигомер Ингибиторы с помощью полуколичественного экспериментальные результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. решение подготовка

Примечание: См. Таблицу материалов для реагент источников.

  1. Приготовляют раствор 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА), добавив 5 g BSA до 100 мл двойной дистиллированной воды. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
  2. Подготовьте раствор антител анти олигомера A11 (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
  3. Подготовьте раствор 6E10 антитела анти Aβ (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
  4. Подготовьте раствор OC антитела анти фибриллярный олигомера (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
  5. Подготовьте трис буфер (TBS) акций физраствора, добавив 24 g Tris база и 88 г NaCl в 1000 мл двойной дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4. Хранят раствор при температуре 4 ° C на срок до 3 месяцев.
  6. Подготовьте трис амортизированное saline и Tween-20 (TBST) решение, добавив 1 мл Tween-20 до 100 мл TBS акций решения и 900 мл двойной дистиллированной воды.
  7. Приготовляют раствор вторичные антитела путем добавления 10 мкл хрен пероксидазы (ПХ) коза анти кролик IgG (H + L) по 10 мл раствора TBST. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
  8. Растворите 3,68 г куркумина в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) сформировать 10-мм куркумин Стоковый раствор.
  9. Растворяют 5 мг синтетических значения1-42 в 2 мл 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-пропанол (HFIP) для формирования решения мономера значения 2,5 мг/мл. Поместите его при комнатной температуре (25 ° C) для 20 минут сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C до 6 месяцев.
    Примечание: Эта процедура должна запускаться так же быстро, как можно скорее. Наконечники должны быть отрезаны обеспечить точное дозирование.
  10. Подготовка electrochemiluminescence (ЭСЛ) жидкости путем смешивания ECL жидкости A и B с тома соотношении 1:1. Это решение следует готовить непосредственно перед использованием.

2. Пробоподготовка

Примечание: Выполните подготовку образца за 2 дня до точки промокательной анализа.

  1. 900 мкл двойной дистиллированной воды для трубки значения1-42 мономера решения; концентрация значения1-42 будет 0,25 мг/мл. Поместите смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
  2. Испарится решение с высокой чистоты азот, до тех пор, пока ее объем составляет около 850 мкл. Концентрация раствора1-42 значения будет о 0,29 мг/мл.
    Примечание: Решение должно быть поколеблен время от времени чтобы убедиться, что HFIP полностью испарилась. Обычно после 30 мин испарения, объем остатков раствора составляет около 850 мкл.
  3. Разбавьте куркумин Стоковый раствор для рабочего раствора куркумин (0,2 и 2 мкм) с двойной дистиллированной воды. Mix решение значения1-42и куркумин рабочего раствора с тома соотношении 1:1. Окончательный концентрации куркумин будет 0.1 и 1 мкм.
    Примечание: Потенциальных ингибиторов олигомера могут быть смешаны с значения1-42 решения в любом соотношении, при необходимости.
  4. Встряхнуть решение непрерывно в магнитной мешалки (см. Таблицу материалы).
    1. Исправьте ящик пластиковый делитель для магнитной мешалкой. Место 2 магнитные перемешать баров на 2 углы окна и поместите образец трубки в центре окна.
    2. Встряхните при комнатной температуре (25 ° C) в течение 48 часов.
      Примечание: Скорость магнитные мешалки составляет около 60 об/мин.
  5. Центрифуга для трубы 15 мин при температуре 4 ° C и 18 000 x g. собирать супернатант.

3. точка промокательной анализ

Примечание: Все инкубаций выполняются на горизонтальной шейкер.

  1. Нитроцеллюлозная мембрана нарежьте полосками шириной 1 см.
    Примечание: Ширина нитроцеллюлозную мембрану можно отрегулировать согласно экспериментальной потребности.
  2. Поместите образцы 2 мкл равномерно на 2 полосы (полоса 1 и 2) с каждой точки интервала на 0,5 см.
  3. Место полосы при комнатной температуре за 5 мин до капли на полосе сухой.
  4. Инкубируйте полоски с 5% BSA раствор для 30 мин при комнатной температуре.
  5. Промойте полоски с TBST решение для 5 мин при комнатной температуре.
  6. Аспирационная решение TBST. За 1 ч при комнатной температуре инкубировать газа 1 с антитело против олигомера A11 решения и газа 2 с решением 6E10 антитела анти значения.
  7. Промойте полоски с раствором TBST три раза, каждый раз в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Аспирационная решение TBST. Инкубируйте полоски с раствором вторичное антитело для 40 мин при комнатной температуре.
  9. Промойте полоски с раствором TBST три раза, каждый раз в течение 5 мин при комнатной температуре.
  10. Равномерно нанесите ECL жидкости, смешанные к поверхности полос. Разоблачить полоски в автоматическое хемилюминесценция Система (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Как правило, 300 мкл ECL жидкости достаточно для одного мембраны. Мембраны должны храниться влажной во время экспозиции. Время экспозиции автоматически вычисляется системой обработки изображений.
  11. Сделайте анализ серого с помощью ImageJ (Национальный институт здоровья) или другой обработки изображений программное обеспечение для получения полу количественных результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Расследовать ли значения1-42 мономера могут образовывать значения1-42 олигомера после подготовки, анализ ТЕА был использован. Без видимых агрегатов наблюдались в образце мономера растворяют HFIP значения1-42 (рис. 1А). Кроме того главным образом шаровидных агрегатов с диаметром около 10-80 Нм были замечены в образце значения1-42 после 48 часов тряски, предполагая, что значения1-42 формы о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы сообщали метод подготовить образцы, содержащие значения1-42 олигомера и для анализа количества A11-положительные значения1-42 олигомера с точкой промокательной анализа. Хотя наши методы для подготовки значения1-42 олигомер богатые образцы являются довольно простых, надежных и воспроизводимых, есть еще некоторые моменты, чтобы быть замеченным. Во-первых HFIP используется для растворения синтетический пептид1-42 значения. Совокупные пептидной1-42 зн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана субсидий из национального естественных наук фонд Китая (U1503223, 81673407, 21475131), применяется исследовательский проект на некоммерческой технологии провинции Чжэцзян (2016C 37110), Нинбо международной науки и технологии Проект сотрудничества (2014D 10019), Нинбо муниципальных Инновации команда жизни науки и здравоохранения (2015C 110026), Нинбо Sci & Tech проекта для общего благосостояния (2017C 50042), Li Dak сумма ИП Чин Yio Кеннет ли морской Фонд развития биофармацевтической, и Magna Вонг C. K. Фонд университета Нинбо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
A11 (ab126892 Rb pAb в амилоидные олигомеры)AbcamGR91739-58
6E10 (бета-амилоидный кролик Ab)Cell  Технология передачи сигналов2454S
OC (антиамилоидные фибриллы OC антитела)MilliporeAB2286
Пероксидаза хрена (HRP) Маркер козы против кролика IgG (H+L) BeyotimeA0208
Aβ 1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-гексафиуоро-2-пропанолАладдинI1523078
куркуминSigmaC1386
Альбумин бычий vSolarbioA8020
Хлорид натрияSangon BiotechD920BA0003
Додецилсульфат натрияSCR30166428
TRISSolarbioT8060
ГлицинSolarbioG8200
  ДиметилсульфоксидSolarbioD8370
5&раз; неденатурирующий гель PAGE Белковый маркерBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
Чистая нитроцеллюлозная блоттинговая мембранаPall CorporationT50189
МетанолSCR10014118
этанолSCR10009218
Сверхнизкий диапазон  белковый маркерSolarbioPR1300
Трансферные мембраныImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue Быстрый окрашивающий растворBeyotimeP0017
Все - автоматическая хемилюминесцентная система визуализацииTanonTanon 5200
Image JNational Институт здоровья
Программное обеспечение для обработки изображенийAdobePhotoshop CS6
Магнитная мешалкаШанхай Huxi

Ссылки

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
  6. Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
  8. Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
  9. Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
  10. Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).
  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

A11TBST

Похожие статьи