Методическая статья

Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

DOI:

10.3791/57599

⸱

2 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children's Hospital, and Houston Methodist Hospital, Baylor College of Medicine, 3Molecular and Cellular Biology Department, Baylor College of Medicine, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для создания инсулина, выражая 3D мышиных pancreatoids от свободного плавания e10.5 отделить поджелудочной железы прародителями и связанные мезенхимы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поджелудочная железа является сложный орган, состоящий из многих различных типов клеток которые работают вместе, чтобы регулировать гомеостаз глюкозы крови и пищеварение. Эти типы клеток включают фермента секретирующих железистый клетки, arborized протоковой системы, отвечают за транспортировку ферментов, кишки и производство гормонов эндокринных клеток.

Эндокринных бета клетки являются единственной ячейки тип в теле, которые производят инсулин, чтобы снизить уровень глюкозы в крови. Диабет, заболевание, характеризующееся потерей или дисфункции бета клеток, достигает масштабов эпидемии. Таким образом важно разработать протоколы для расследования развития бета клеток, который может использоваться для целей отбора для получения наркотиков и на основе ячеек терапии. В то время как экспериментальное исследование мыши развития имеет важное значение, в vivo исследования являются трудоемким и длительным. Культивируемых клеток обеспечивают более удобную площадку для скрининга; Однако, они не в состоянии поддерживать сотовой разнообразия, архитектурные организации и клеточных взаимодействия нашли в vivo. Таким образом крайне важно разработать новые инструменты для изучения физиологии и поджелудочной железы органогенеза.

Эпителиальных клеток поджелудочной железы развивать в тесной связи с Мезенхима с самого начала органогенеза как клетки организовать и дифференцироваться в сложных, физиологически компетентный орган, взрослых. Поджелудочной железы Мезенхима обеспечивает важные сигналы для эндокринной развития, многие из которых не вполне понятны, таким образом трудно резюмировать во время культуры в пробирке . Здесь мы описываем протокол к organoids трехмерную, сотовые комплекс мыши культуры, которые сохраняют мезенхимы, называется pancreatoids. E10.5 мышиных поджелудочной железы бутон расчлененный, отделить и культивировали в среде леса бесплатно. Эти плавающие клетки самостоятельно собрать с мезенхимы, обволакивающий развивающихся pancreatoid и надежный количество эндокринной бета клеток, развивающихся вместе с железистый и проток клетки. Эта система может использоваться для изучения взаимодействия клеток определение судьбы, структурной организации и морфогенеза, ячеек во время органогенез, или наркотиков, малые молекулы, или генетического скрининга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определяющие механизмы нормального развития и физиологии имеет первостепенное значение для понимания этиологии заболевания и в конечном счете культивировать методов лечения. В то время как культивирование и дифференциации стволовых клеток позволяет быстро и высок объём анализ развития, он ограничивается существующего свода знаний о механизмах, регулирующих клеток судьба и искусственно резюмирует развития в относительно однородная, двумерные состояние1,2. Не только в естественных условиях развития пострадавших от внешних влияний, с различных типов клеток в нишу и окружение оказывает паракринными сигналов и организационной поддержки для руководства органогенез, но функция этих клеток также опирается на их окружение для руководства3,4,5. Учитывая важность этих внешних сигналов, ограничения протоколов дифференциации и трудоемкий характер в vivo моделей мышей, новых систем необходимы для экспериментально изучения основных процессов развития и физиологии.

Появление протоколов для создания трехмерных, сложных organoids обеспечивает удобный и конгруэнтных системы к изучению органогенеза, физиологии, эффективность препарата и даже патогенеза. Создание мышиных organoids для различных систем, таких как желудок6 и кишечника7 расширили наше понимание органогенез, обеспечивая инструмент для изучения развития сложностей с меньше ограничений, чем в естественных условиях и в пробирке модели. За эти достижения в мышиных органоид формирования и появлением человеческих плюрипотентных стволовых клеток человека кишечные8, сетчатки9, почечной10,11, и мозгового12 organoids были произведены и это репертуар ограничивается только существующих знаний относительно механизмов развития.

Особый интерес это поколение organoids поджелудочной железы, как множество заболеваний страдает различных поджелудочной железы типов клеток, включая железистый клетки и протоки поджелудочной экзокринной недостаточности13, железистый клетки в панкреатита14, и бета-клетки в диабет15. Получение знаний о разработке этих различных типов клеток может помочь в понимании их патологии и может Кроме того, выступать в качестве платформы для персональной наркотиков скрининг или трансплантации. Ранее Greggio et al. разработали метод для создания мышиных поджелудочной железы organoids пилки в vivo морфогенеза и развивать организованной, трехмерные, сложные структуры, состоящий из всех основных эпителиальных клеток поджелудочной железы типы16,17. Это является крупным шагом вперед в области поджелудочной железы, особенно делая клетки в пробирке может позволить биологические исследования развития бета клеток. Однако нехватка эндокринных клеток формируется в этом протоколе если organoids были пересажены в ткани, где нишу могли взаимодействовать и предоставляют учебные подсказки17. Мезенхима представляет собой наибольшую часть ниши, сильно обертывающей развивающихся эпителия от ранних стадиях органогенеза на более поздних этапах, включая эндокринной расслаивания и дифференциации3,4, 18. Взаимодействие между Мезенхима развивающихся поджелудочной железы является еще одним примером внешней сигнализации и важность сохранения в vivo сотовой сложности для изучения органогенеза.

Здесь мы опишем, как для создания трехмерных поджелудочной железы organoids, называют pancreatoids, от диссоциированных e10.5 мышиных поджелудочной железы прародителями. Эти pancreatoids сохранить родной мезенхимы, самостоятельно собрать в условиях свободного плавания и создать все типы основных клеток поджелудочной железы, включая надежные количество эндокринной бета-клетки19. Этот подход лучше всего подходит для анализа развития эндокринной, как предыдущие протоколы отсутствуют надежные эндокринной дифференциации. Однако используя протокол для поджелудочной железы organoids как описано в Greggio, et al. лучше подходит для анализа поджелудочной железы эпителиальных ветвления и морфогенеза, как ветвление более ограничен в pancreatoids.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все описанные в этом методе эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета из колледж Бейлор.

1. Подготовка мыши эмбриональные день 10.5 поджелудочной железы прародителями

Примечание: Этот протокол не нужно следовать в стерильных условиях до шага 2, однако он является оптимальным для стерилизации инструменты диссекции и спрей с 70% этанол до использования.

  1. Чтобы настроить для вскрытия, заполнить ведро льда и поместите контейнер-фосфатный буфер (PBS) во льду. Очистите два штрафа наконечником щипцы и Рассечение ножницами с 70% этиловом спирте. В районе рассечение, контейнер с по крайней мере три боросиликатное капиллярной трубки, рот пипеткой, зажигалку и фильтруют 1000 мкл наконечники.
    1. Подготовьте по крайней мере 1 мл холодной dispase 1,25 мг/мл разбавленной в стерилизованные воды и место в втором колодец 12 хорошо плиты на льду. Положите PBS в первый, третий и четвертый хорошо тарелка скважин из 12. Место 1 мл 0,05% трипсина в 1,5 мл тюбик на льду. Предварительно теплой пожимая инкубатор на 37 oC.
  2. Усыпить приурочен беременных мышей e10.5 IACUC руководящим принципам. Spray живота с 70% этанола для очистки региона прежде чем V-образный разрез в области половых органов, мыши, используя ножницы, пинцет и продолжать его до диафрагмы.
    Примечание: Появление Вагинальные вилка в этом протоколе указывает день 0,5. С помощью 5 - 6 week-old мышей, веса более чем на 2 g действует как вторичные меры успешного оплодотворения.
    1. Тщательно акцизных матки, делая надрез на верхней боковой части матки, потянув орган вверх от мыши и после этого разреза до области половых органов, прежде чем повторять на противоположной стороне. Поместите его в 10 см Петри с холодной PBS.
      Примечание: Это возможно получить organoids отделить e11.5 клеток, однако в отличие от e10.5 pancreatoids, эти organoids не характеризуются и таким образом не может сохранить способность дифференцировать во всех трех основных линий поджелудочной железы.
  3. Под микроскопом света рассечение поместите чашку Петри и тщательно открыть маточных тканей, поместив две щипцы между каждого эмбриона и пилинг ткани от желточного мешка. Трансфер эмбрионов, держа желточный мешок осторожно с щипцами и место в 10 см Петри блюдо со свежими, холодный PBS. Место на Петри блюдо на льду.
    Примечание: Важно для удаления heedfully эмбрионы, желательно поддерживать в пределах желточного мешка, как насильственное удаление может тянуть пуповины, разрыв ткани эмбриона и ущерба для структурной целостности.
  4. Место несколько капель PBS на крышке Петри 10 см. Используйте эти капельки для передачи эмбриона во время вскрытия, как extraembryonic тканей удаляются для обеспечения видимости. Переноса эмбриона на PBS падение и аккуратно извлеките из желточного мешка, с помощью щипцов, а оставшиеся эмбрионы остаться в PBS на льду (рис. 1А). Удалите головы до переезда в новое падение PBS с помощью щипцов для слегка совок эмбриона, не повреждения ткани (рис. 1Б) эмбриона.
    Примечание: Ткани может потребоваться более часто передаваться свежие PBS капельки, чем описано здесь, в зависимости от непрозрачность жидкости.
    1. В новое падение PBS удалите бутоны передних конечностей с помощью щипцов (рис. 1Б). Место щипцами в отверстие где конечности бутон присутствовал и нежно слезы только наиболее внешней ткани кпереди (рис. 1Б). Вращать эмбриона и повторять в направлении задней, останавливаясь на бутон задних конечностей. На данный момент желудочно-кишечного тракта должна быть видна (рис. 1Б).
    2. Задней части желудочно-кишечного тракта имеет небольшой изгиб (Рисунок 1F). Вставьте щипцами за этот изгиб в проеме между желудочно-кишечного тракта и спинного регионе стенки тела. Отсоедините желудочно-кишечного тракта, работают медленно вверх до наиболее передней региона где регионе сердца соединяется (рис. 1B-E).
      Дополнительно: Удаление изначального сердца и печени почки из брюшной регионов желудочно-кишечного тракта, оставляя только непрерывное кишечника трубки. Первые несколько раз, выполняется этот протокол может быть проще оставить сердца и печени, как брюшной достопримечательности до морфология пищеварительного тракта и спинной поджелудочной железы бутон более знакомые (рис. 1C и D ).
    3. Передать свежие капли PBS желудочно-кишечного тракта.
    4. Возьмите щипцами и осторожно Сожмите ткани под выступающие почки и кишечник и слегка приподнять внешние ткани выключение (рис. 1D-F).
      Примечание: Спинной поджелудочной железы бутон расположен между желудка и кишечника (рис. 1C-G). Поджелудочной железы Бад под должен выглядеть как круглые, Нобби структуру (рис. 1G).
    5. Место щипцы, где бутон подключается к кишечника и щепотку вверх, чтобы ослабить бутон (рис. 1G). Мыть один раз в новый пузырь PBS перед передачей бутон в первых колодец 12 хорошо пластины в холодной PBS на льду. Повторяйте, пока все шишки собираются от эмбрионов и помещены в первой скважины 12 хорошо пластины.
  5. Место 12 хорошо блюдо под микроскопом света рассечение. Подсчитать количество поджелудочной железы рецепторы, успешно разобрал позднее рассчитать коэффициент разделения.
    1. Место отфильтрованных 1000 мкл пипеткой кончик в рот пипеткой с капиллярной трубки прилагается. Пламя стерилизовать капиллярной трубки и создайте изгиб в трубе для простоты использования. Используйте капилляра для передачи почки в второе решение хорошо содержащие холодной dispase 2 мин до передачи третьего колодец с чистой PBS (рис. 1G).
      Примечание: При передаче почки от dispase для PBS, не прикасайтесь к ткани, чтобы кончик капиллярной трубки. Если ткани получает застрял на кончик трубки, Пипетка вверх и вниз или встряхните в чистой PBS решения пока не ослабла.
    2. Пипетка бутоны вверх и вниз и передавать четвертый колодец с чистой PBS. Наконец, с использованием капиллярной устройство передачи почки до 1,5 мл тюбик с 0,05% трипсина. Трубка в подогретым шейкер 37 oC и поколебать на 1500 об/мин на 4 мин.
    3. Вортекс для приблизительно 10 s немедленно поместить трубку в центрифуге и спина для 5 минут при 200 г. удалить все но приблизительно 50 мкл раствора осторожно, чтобы не беспокоить центрифугировали клеток (рис. 1G).

2. выращивание диссоциированных прародителями сформировать Pancreatoids

Примечание: Следующие должно выполняться в стерильной атмосфере в стандартной культуры ткани капюшоном, с использованием стандартных процедур стерильные.

  1. За каждые собранные бутон добавьте 400 мкл органогенеза СМИ16,17 (Таблица 1) центрифугировали клетки. Пульс вихря три раза и пластины 100 мкл на хорошо низкого прикрепления 96 хорошо пластины, расщепление почки в соотношении 1:4 (рис. 1G).
  2. Проверить под микроскопом, чтобы визуализировать отделить клетки, свободно плавающая (рис. 1H). Место культуры блюдо в 37 oC инкубатор с 5% CO2 на рокер на средней скорости.
  3. Ежедневно следить за ходом pancreatoids. Замените 100 мкл свежие СМИ каждые 3 дня, тщательно дозирования СМИ под контролем микроскопических в капюшоне удалить оставляя pancreatoid в скважине. Кроме того свежие µL 100 средств массовой информации могут добавляться к новой скважины и pancreatoid, переданных с использованием придает рот пипеткой и 1000 мкл капиллярной трубки боросиликатное фильтруемый наконечник пипетки.

3. обработка Pancreatoids для Immunofluorescent изображений

  1. Для обработки pancreatoids для immunofluorescent изображений, сначала Подготовьте параформальдегида 4% / PBS, pH7.4 (PFA) решение. Место 50 мкл 4% ПФА в скважинах 96 хорошо пластины.
    1. С помощью капиллярной трубки боросиликатное и рот пипеткой с кончиком отфильтрованных пипеткой 1000 мкл, передачи pancreatoids из питательной среды, с учетом как мало средств массовой информации как можно более свежие колодец с 4% PFA. Установите на коромысле при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Передача pancreatoids от 4% ПФА в колодец с 100 мкл свежих PBS, рок при комнатной температуре на 5-10 мин повторить в общей сложности три свежие PBS моет.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, с pancreatoids, хранящиеся в 100 мкл PBS на 4 oC на срок до одной недели.
  2. Для wholemount изображений (рекомендуется, если антитела являются подходящим, альтернативный подход в разделе 3.3. и микроскопии в 3.4.), передача от PBS в 50 мкл осла 5% сыворотки в однократном ПБС с 0.1% неионогенных моющего средства (PBST) для блока. Рок на ночь при 4 oC или в качестве альтернативы для 4 ч при комнатной температуре.
    1. Передачи pancreatoids новой скважины, содержащие первичных антител, разводят в 50 мкл осла 5% сыворотки в 1 x PBST. Оптимально рок за 24 ч в 4 oC (по крайней мере 12 h но до 36 ч).
      Примечание: Антитела, перечисленных в Таблица материалов против КВУА (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) и Pdx1 (1: 100) подходят для окрашивания wholemount; другие антител может потребоваться оптимизация.
    2. Перевод pancreatoids в колодец, содержащей 100 мкл свежие PBST мыть и рок на 30 минут при комнатной температуре. Повторите этот шаг для в общей сложности три свежие PBST смывки.
    3. Передачи pancreatoids новой скважины, содержащие вторичные антитела, разводят в 50 мкл осла 5% сыворотки в 1 x PBST. Защищают пластину от света и место в 4 oC, качалки для оптимально 24 h (по крайней мере 12 h но до 36 ч).
      Примечание: Все вторичные антитела, перечисленные в Таблице материалов и DAPI ядерной изображение подходят для окрашивания wholemount.
    4. Передачи pancreatoids новой скважины, содержащей 100 мкл 1 x PBST и горные породы при комнатной температуре в течение 30 мин повторить в общей сложности три автомойки в 1 x PBST. В третьей и заключительной мыть, добавьте 300 Нм DAPI.
    5. Наконец место в 100 мкл чистой PBS и хранить при 4 oC, защищены от света на срок до недели перед воображения confocal микроскопии, хотя наилучшие результаты приходят от изображений сразу же после окрашивания. Чтобы предотвратить движение pancreatoids во время визуализации, но предотвратить высыхание, поместите каждый pancreatoid в 20 мкл капли PBS. Если pancreatoids не оставаться еще, Уменьшите объем PBS.
  3. Для замороженных секций передачи pancreatoids от PBS в 30% раствор сахарозы на ночь при 4 oC.
    1. Добавление вложения средств массовой информации в пузырь под микроскопом рассечение. С помощью щипцов под контролем микроскопические, Замочите pancreatoids, осторожно нажав через вложения средств массовой информации несколько раз для удаления остаточных сахарозы перед передачей в ткани блок с замороженных вложения средств массовой информации.
    2. Поместите блок ткани на сухой лед пока заморожен и раздел на криостата на 8 мкм.
      Примечание: Секции могут храниться на-80 oC или immunostained немедленно.
    3. Разрешить секций от-80 oC, чтобы разморозить при комнатной температуре примерно 5 минут до полного высыхания. Нарисуйте гидрофобный барьер с использованием пера гидрофобные ППА вокруг ткани и блока с помощью 5% осла сыворотку разводят в 1 x PBST за 30 мин при комнатной температуре.
    4. Удалите средства массовой информации и немедленно замените первичных антител, разводят в 5% осла сыворотку разводят в 1 x PBST ночь в 4 oC.
    5. Удаление первичного решения и Вымойте тканей три раза с 1 x PBST за 10 мин. После этого, добавьте вторичное антитело раствор разбавляют в 5% осла сыворотку разводят в 1 x PBST за 1 ч при комнатной температуре и защищать слайды от света.
    6. Удаление дополнительного решения и мыть слайды три раза в 1 x PBST за 10 мин. В окончательном мыть, добавьте 300 Нм DAPI.
    7. Удалите средства массовой информации и добавить монтажа СМИ и coverslip. Хранить слайды от света в 4 oC до готовности к изображению.

4. изоляция РНК от Pancreatoids для анализа Стенограмма

  1. Сбор pancreatoids с использованием боросиликатного капилляров, прикрепленных к рот пипеткой с отфильтрованных 1000 мкл кончиком пипетки стерильности и место в 500 мкл раствора кислоты Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ в 1,5 мл. Хранить в-80 oC или немедленно приступить к РНК изоляции.
  2. Для изоляции РНК оттепель образцы на льду, в случае необходимости и 100 мкл хлороформ. Вихревой хорошо и место в 4 oC на 15 мин предварительно охлаждения центрифуги для 4 oC.
    1. Место труб в центрифуге и спина для 20 минут, 12000 g на 4 oC.
    2. Осторожно удалите трубки не беспокоить разделение слоев. С помощью пипетки 200 мкл, собирать четкие водный раствор и место в новой 1,5 мл трубку, оставив небольшое количество буфер из слоя белых белок и розовый слой ДНК. Не прикасаться кончиком пипетки для что-нибыдь в этом процессе и не касайтесь стен 1,5 мл трубки.
    3. Добавьте 500 мкл 100% изопропиловый спирт новых трубка, содержащая водный слой и вихря. Пусть сидят при комнатной температуре за 20 мин, больше на льду, или максимум осадков оставить на ночь в-20 oC.
    4. Центрифуга на 12000 g 15 мин на 4 oC на гранулах РНК. Удаление изопропанола не нарушая гранулы.
      Примечание: Как pancreatoids малы, вполне вероятно, гранулы не будет видна.
    5. Добавьте холодной, 75% этанола и перевернуть трубку несколько раз. В центрифуге и спина на 9000 x g 10 мин на 4 oC. Remove этанола и спина на 2 мин на 9000 x g.
    6. Использование пипетки 200 мкл для удаления любых оставшихся этанола в трубе, не обращаясь в регионе, что гранулы проживает в. Закрывайте крышку на трубе для 5-10 мин при комнатной температуре для обеспечения испарения остаточной этанола.
    7. Ресуспензируйте Пелле в по vortexing в 20 мкл воды чистой, свободной от нуклеиназы.
      Опционально: Тепла РНК в 65 oC на 3 мин и немедленно вернуться в лед. РНК могут храниться на-80 oC или непосредственно использоваться для обратной транскрипции и ПЦР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тщательное вскрытие зародышей мыши на e10.5 из рога матки должна принести неповрежденных эмбрионов в PBS для дальнейшего диссекции (рис. 1А). Желудочно-кишечного тракта можно эффективно удалить из эмбриона (рис. 1Б), позволяя проницательность спинной поджелудочной железы бутон на стыке кишечника и желудка (C-Fрис. 1). Ранее была охарактеризована буто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прогрессирование клетки культуры моделей имеет решающее значение для правильной модели развития, производят типы клинически значимых клеток, эффективность препарата испытания или даже трансплантации пациентам. Однако, искусственно изложив развития в блюдо сложной, как мы все еще далеки от понимания механизмов, органогенез и физиологии в vivo. Таким образом в vitro клетки неэффективно сгенерированный, не полностью функциональный, может сохраняться в течение длительного времени, или гавани другие отклонен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Jolanta Chmielowiec за полезной дискуссии относительно протокола и рукописи. Мы также благодарим Бенджамин Arenkiel для доступа к конфокального микроскопа. Эта работа была поддержана NIH (P30-DK079638 к м.б.) и T32HL092332-13 M.A.S. и м.б., Макнэйр медицинского фонда (м.б.) и конфокальный ядро на BCM интеллектуальной и отклонениями в развитии научно-исследовательский центр (низ U54 HD083092 от Юнис Кеннеди Шрайвер Национальный Институт детского здоровья и развития человеческого потенциала).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM6250
Аспираторные трубки в сборе для калиброванных микрокапиллярных пипетокSigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure Нуклеаза вода без нуклеазыThermoFisherD119
Боросиликатные капиллярные трубкиSutter InstrumentsGB1007515наружный диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,75 мм, длина
1,5 смCaCl2Sigma-AldrichC5080
Клеточно-репеллентный 96-луночный микропланшетGreiner Bio-One650970U-образная
центрифуга 5424 REppendorf5401000013
хлороформаSigma-Aldrich233306
антитела хромогранина-АAbcamab15160
Компактный, модульный стереомикроскоп M60Leica
Countess Автоматический счетчик клетокInvitrogenC10310
Countess Счетчик клеток СлайдыInvitrogenC10312
CryoStar NX70ThermoFisher957000L
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG7528
DAPI (4',6-Диамидин-2'-фенилиндол-дигидрохлорид)Roche10 236 276 001Порошок
антитела DBAVector LabRL-1032
Dispase II, порошокGibco17105041
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-100,05 x 0,02 мм; Титан; Совет по биологии
EGF (эпидермальный фактор роста)Sigma-AldrichE9644
Этанол, 200 ProofDecon Laboratories2716
Forma Steri Cycle CO2 инкубаторыThermoFisher370
Fluoromount-GSouthern BiotechOB10001
Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньиSigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 АнтителоSanta Cruz BioTechnologysc-271408Поликлональная мышь IgG
ИзопропанолFishera4164
Изотезия изофлуран, USPHenry Schein11695-6776-2
Антитело к инсулинуDakoA056401поликлональной морской свинки
KAPA SYBR FAST UniversalKAPA BiosystemsKK4618
KClKaryoMax10575090
KnockOut Замена сывороткиInvitrogen10828028
Leica TCS SPE Спектральный конфокальныйLeica
MgCl2Sigma-Aldrich442615
мышиный C-пептид ELISAALPCO80-CPTMS-E01
Мышь сверхчувствительная Инсулин ИФАALPCO80-INSMSU-E01
MX35 Микротомные лезвияThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS3817
NaH2PO4Sigma-Aldrich
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
PBS 1XCorning21-040-CV
Pdx1 антителоDSHBF6A11Моноклональная мышь MIgG1
Peel-A-Way одноразовые формы для встраиванияVWR15160-157
Раствор пенициллина-стрептомицинаCorningMT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13- ацетат)Sigma-AldrichP1585
Protein LoBind Микроцентрифужные пробиркиEppendorf22431081емкостью 1,5 мл
Рекомбинантный человеческий FGF-10 ProteinR& D Systems345-FG
Рекомбинантный человеческий FGF-кислыйPeprotech100-17A
Рекомбинантный человеческий R-спондин I БелокR& D Systems4546-RS
BenchRocker 2DBenchmarkBR2000
Сахароза 500гSigma-AldrichS0389
SuperFrost Plus МикроскопСлайды Fisher Scientific12-550-15
Super Pap PenЭлектронная микроскопия Sciences71310
Термомиксер REppendorf05-412-401
Ткань Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TRIzol РеагентInvitrogen15596018
TrypLE ExpressInvitrogen12604039(1x), без фенола Красный
Трипановый синий красительInvitrogen15250061Для подсчета клеток слайды
Trypsin-EDTA (0,05% )Corning25-052-CI
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Gibco25200072Фенол красный
Сверхнизкое вложение 24-луночный планшетCorning3473
Сверхнизкое прикрепление Сфероидная пластина 96-луночныйCorning4520
Антитело к виментинуEMD MilliporeAB5733Поликлональный куриный IgY
Vortex GenieBioExpresS-7350-1
Y-27632 ДигидрохлоридR& D Systems1254Также известен как ингибитор ROCK
Zeiss 710 Конфокальный микроскопZeiss

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи