Методическая статья

Кандидат Джин тестирование в клинической когортных исследований с мультиплексной генотипирования и масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/57601

⸱

21 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Molecular Genetics of Chronic Inflammation and Allergic Disease, Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Paediatrics, University of Melbourne, 4Centre for Social and Early Emotional Development, Faculty of Health, Deakin University, 5Department of Paediatrics, University of Western Australia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение генетических вариантов, способствующих сложных заболеваний человека позволяет нам выявить новых механизмов. Здесь мы продемонстрировать мультиплекс генотипирования подход к кандидату генов или гена путь анализа, который максимизирует покрытия при низких затратах и поддается на основе когортных исследований.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сложные заболевания часто подкрепляются несколько общие генетические варианты, которые способствуют восприимчивость к болезням. Здесь мы описываем экономически тег единичных нуклеотидных Однонуклеотидный полиморфизм подход с использованием мультиплексных генотипирования пробирного с масс-спектрометрии, расследовать ген путь ассоциаций в клинической когорт. Мы исследуем пищевой аллергии кандидат Локус Interleukin13 (IL13) в качестве примера. Этот метод эффективно увеличивает охват, воспользовавшись общих связей неравновесия (LD) в пределах региона. Выбранный LD ОНП затем предназначены в мультиплексированных пробирного, позволяя до 40 различных SNPs анализируемым одновременно, повышение эффективности затрат. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) используется для усиления целевой локусов, следуют единичных нуклеотидных расширение, и ампликонов затем измеряются с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время flight(MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Необработанный вывод анализируется с генотипом, программного обеспечения, используя определения строгого контроля качества и обрезков, и высокой вероятностью генотипов, определяются и выход для анализа данных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В сложных заболеваний человека генетических вариантов способствуют восприимчивость к болезням и количественной оценки этих вариантов могут быть полезны для понимания патогенеза, выявление пациентов группы высокого риска и лечение ответчиков. Действительно обещание медицины точности зависит от использования геномной информации для выявления больного подгруппы1. К сожалению в сложное заболевание биологии пространстве, где болезнь фенотипов подкрепляются существенной генетической гетерогенностью, низкой пенетрантностью и переменной экспрессивность, когорты размер требования для генома общесекторальных подходов к идентификации Роман кандидаты, часто чрезмерно большой2. Кроме того подход гена целевых кандидата начинается с априори гипотезы о конкретных генов/путей в этиологии болезней3. Инструменты анализа пути обычно используются для изучения патофизиологии выявленных Целевой локусов, создавая многочисленные пути кандидат, чтобы изучить. Мы демонстрируем здесь мультиплексированных генотипирования подход, позволяющий для расследования десятков до сотен SNPs с одной assay, подходит для человека когортные исследования4. Этот подход является относительно высокой через положили, позволяя сотни тысяч образцов ДНК быть генотипируемого для исследования Роман обнаружения и расследования конкретных путей. Методы, описанные здесь полезны для выявления риска аллелей и их ассоциации с клинических признаков сравнительно быстрой и экономичной основе. Эта платформа была весьма выгодным для скрининга и диагностических целей5,6и совсем недавно, для микробной инфекции7 и вирусом папилломы человека8.

Этот протокол начинается с выбора набора генов, для проведения расследования, т.е., целевых регионах, обычно определяется путем поиска литературы, или априори гипотезы для участия в процессе болезни; или возможно выбранных для репликации как ведущие ассоциации исследования генома всей ассоциации (GWA) обнаружения. Из набора генов исследователь будет выбрать изысканные список тегов ОНП. То есть взаимосвязь равновесия (LD), или корреляции, среди вариантов в регионе используется для идентификации представителя «тег SNP» для группы ОНП в высокой LD, известный как гаплотип. Высокая LD региона означает, что ОНП часто наследуются вместе таким образом, что генотипирование один SNP достаточна для представляют собой вариации на всех ОНП в гаплотип. Кроме того если после на окончательный список SNPs из многих регионов, например., репликация для изучения GWA, этот процесс может оказаться ненужным. Для мультиплексных генотипирования assay затем должны быть направлены вокруг этих целей, такие, что амплификации грунты различных массовых тем, расширение праймеров и продукцию производить интерпретируемых массовые спектров. Эти параметры легко осуществляются мультиплексированных генотипирования пробирного дизайн инструмента. Прямого и обратного праймеры от этой конструкции будет использоваться для целевых маркеры интерес и усилить последовательность, содержащую SNP. Расширение праймеры прикрепить непосредственно проксимальнее полиморфизмов и добавляется один, масса изменение, Терминатор база, которая дополняет SNP. База Терминатор предотвращает дальнейшее расширение ДНК. Масса модификация базы позволяет фрагменты, отличающихся единую базу, чтобы быть обнаружены с помощью масс-спектрометрии. Затем пластина, содержащие химии генотипирования применяется к чип для измерения на платформе масс-спектрометрии. После применения надлежащего контроля качества сырья генотипирования призывы, обнаруженных системой, данные можно экспортировать и использованы для статистического анализа для проверки для ассоциации с болезнью фенотипов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетический материал, используемый в настоящем документе этически был одобрен для использования управлением для детей HREC (человека Комитет по этике исследований) (СГО/07/492), Кафедра HREC человека услуг (10/07) и Королевский Детская больница (РЧ) HREC (27047).

1. Проектирование мультиплексированных Assay

  1. Подготовка списка SNP пробирного дизайн.
    1. Ввод целевого региона в теггер функции Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Используйте LD (корреляции r2), между SNP, охватывающих целевого региона для создания списка SNPs, который обеспечивает полный охват желаемого региона с наименьшее количество необходимых вариантов. Создать список SNPs, таким образом, что все аллели быть захвачен связаны выше порога, определяемые пользователем (например., r2 ≥0.8).
  2. Определение подходящих последовательностей для вперед, реверс и расширение грунтовки
    1. Введите сгенерированный список ОНП в Пробирной дизайн инструмент выбора.
      Примечание: Приведенные ниже инструкции применяются к пробирного средство проектирования, используемое для создания представительных результатов, как указано в Таблице материалов.
    2. После запуска средство проектирования пробирного выберите Новый генотипирования дизайн. Введите имя для пробирного дизайна в Дизайн имя поля.
    3. Предоставьте список SNP, созданный на шаге 1.1.1, нажав на кнопку Редактировать ввода текста с инструкции rs или FASTA слева от баттона.
      Примечание: SNP может быть введен как текстовый список ссылок (РС) SNP идентификаторы или загружены в формате FASTA, или формат файла SNP группы используется инструментом. Чтобы загрузить файлы в этих форматах, выберите кнопку Загрузить файл . Верхний предел вариантов, которые могут быть разработаны в единый пробирного, называется «хорошо», является 40 SNP. Это позволяет указать SNPs, которые являются приоритетными для дизайна перед началом выполнения; Сначала они будут разрабатываться. ОНП управления могут быть указаны: например, проба для выявления гендерной в случае образец микс ups или элемент управления, чтобы определить, что достаточно шаблон был добавлен если работы с низким или плохого качества ДНК. Следует, однако, отметить, что с помощью контроля и приоритет SNPs может уменьшить количество SNPs, которые могут быть разработаны в единый хорошо.
    4. Пресет меню выберите вариант высокий мультиплексирования iPLEX пресет . Из организма меню выберите организма, от которого наследует ДНК, чтобы быть генотипируемого. Для представителя результаты, представленные здесь это было человека.
      Примечание: Мыши и говядину организмы также совместимы с инструментом. Один если можно также выбрать другие работы с альтернативной организма как завод или микробов; Однако автоматизированных шаги для нахождения проксимальной полиморфизмов и оптимального грунтовка областях не будет доступна из-за отсутствия ссылок генома.
    5. В меню база данных выберите Последняя сборка генома, или альтернативного построения, при необходимости, из меню « химии ». Выберите iPLEX и Мультиплексной уровня поля, введите высокий уровень мультиплексирования: 40. Теперь выберите Начать работать. «Шаг 1» инструмента начнется.
      Примечание: Во время шага 1, инструмент извлекает и форматы последовательности SNP. Здесь ошибки может включать форматирование FASTA файла, в котором случае FASTA файл следует проверять и переформатирован в случае необходимости. Другая ошибка — SNP rs чисел, которые были объединены с другим номером РС, в котором случае номер РС должен выполняться поиск в базе данных SNP как NCBI dbSNP определить новый номер РС SNP. Последовательности вокруг SNP Поиск для любых известных проксимальной SNPs, которые могли бы помешать конструкции праймера. Потенциальные PCR праймер сайты сравниваются геном избежать неспецифических амплификации благодаря несколько хитов в геноме.
    6. Дождаться завершения «Шаг 2» дизайн инструмента, в котором будут определены проксимальной SNP.
      Примечание: Если организм, который не поддерживается этим шагом, аннотируйте последовательности с проксимальных полиморфизмов в ИЮПАК аннотации, если эта информация доступна. Есть редко ошибки во время этого шага; Однако могут возникать ошибки, если был выбран неправильно ссылку организма или геном, или последовательностях cDNA были введены вместо геномной ДНК. Чтобы оптимизировать шаг 2, в разделе Дополнительные параметры, можно отфильтровать SNP основанные на население, если работа в рамках конкретной группы населения. Редкие SNPs быть отфильтрованы, исключив те с частотой ниже 1%. Наконец SNP, которые не имеют статус проверенного или не имеют информации по вопросам народонаселения также могут быть исключены при желании.
    7. Дождаться завершения «Шаг 3» дизайн инструмента, который определяет оптимальную грунтовка регионов. Если предпочитаемый праймера места были определены, или если работа с другой организм, вручную вводить праймера места путем пометки входной последовательности (SNP группы файлов) с предпочтительным грунтовка регионов в верхнем регистре и остальная часть последовательности в нижнем Сохранить случае случае, выберите в меню Дополнительные параметры для этого шага.
      Примечание: Ошибки шаги 2 и 3 могут включать: (1) A проксимальной SNP блокирование дизайн праймера с раствором, чтобы маска с базой non шаблона и заказать oligo с универсальной базой, как Isonine или, дизайн двух праймеров, один с каждым из аллелей proxim Аль SNP, или, Дизайн один грунт с общей аллель только. (2) еще одна распространенная ошибка является неспособность определить уникальный сайт для грунтовки с решения, чтобы изменить длину ампликон для того, чтобы определить уникальный сайт. Инструмент, используемый для этого документа по умолчанию используется 80-120 bp. Это может быть изменено от 60-400 bp в диалоге Дополнительные параметры под Amplicon длина параметры «3. Определить оптимальные области грунт» и также на вкладке ампликон «4. Дизайн Assays.» Убедитесь, что оба изменяются. Следует, однако, отметить, что увеличение длины amplicon при использовании деградации ДНК не рекомендуется.
    8. Дождаться завершения шага дизайн пробирного («шаг 4» дизайна инструмент), здесь инструмент призван обеспечить оптимальный перевал разделение между расширение грунты и аллели всех ОНП в мультиплексированном конструкции. После завершения этого шага, экспортируйте файл Oligo порядка, который отформатирован для легкий заказ через oligo заказа поставщика выбора.
      Примечание: Усиление грунтовки (вперед (F) и обратного (R)) предназначены для получения оптимального ампликон размер от 80 до 120 bp. Грунтовка усиления масс должен отличаться от расширения грунта и его продукт, чтобы избежать противоречивых результатов в массовых спектр и для общей производительности ПЦР. Грунтовка расширение должно быть 15 до 30 нуклеотидов длинные (4500-9000 Da), таким образом, что 3' конца будет прикрепить непосредственно прилегающих к сайт полиморфизм. Все эти параметры устанавливаются автоматически в инструмент, используемый для создания представительных результатов.
  3. Экспортировать дизайн из выбранного инструмента и порядок праймеры от поставщика олигомера: 25 нмоль каждого из праймеры PCR (вперед и назад) и 100 нмоль каждого из расширения грунтовки. Для грунтовки, используемый для создания представительных результатов см. таблицу 1 .

2. генотипирования (1-2 дня)

  1. Подготовьте амплификации грунтовки.
    1. Если были заказаны лиофилизированные грунты, воссоздать с молекулярного уровня воды. Используйте в концентрации 100 мкм/мкл для прямого и обратного грунты и 500 мкм/мкл для расширения.
    2. Бассейн вперед и обратного Праймеры для калибровочных мультиплексированных в складе грунтовка смеси, содержащие каждый грунт в концентрации 0,5 мм.
      Примечание: К примеру, 400 мкл грунтовка бассейн для 400 реакций:
      figure-protocol-1
      2 мкл каждого праймера, в концентрации 100 мкм/мкл, необходим для пула запасов грунт. Для 30-plex assay с 60 прямого и обратного грунты, будет в общей сложности 120 мкл грунта требуется (концентрированный грунтовка бассейн). Затем будут добавлены 280 мкл воды молекулярно класса сделать окончательный объем 400 мкл грунтовки смешивают.
  2. Усилители с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
    1. Сделать мастер смесь для ПЦР, содержащие 100 Нм смеси праймера подробно выше, 500 мкм дНТФ, 2 мм MgCl2и 0,5 U фермента ДНК-полимеразы. 1 U необходим для более чем 26-plex анализов. Обратитесь к таблице 2.
    2. Добавьте 4 мкл этой смеси в каждой скважине 384-ну ПЦР пластины, наряду с 1 мкл геномной ДНК в концентрации 5-10 нг/мкл.
      Примечание: контроль качества также должны быть включены на плите, как элемент управления-шаблон и позитивный элемент управления, который ранее выступал с assay (во время выполнения теста). Если запущено несколько пластин, несколько ДНК образцов из других знаке, например., в трех экземплярах, должен выполняться как технические элементы управления между plate изменчивости.
    3. Центрифуга пластину на 200 x g 1 мин при комнатной температуре с крышкой пластины для обеспечения все жидкости содержится в нижней части тарелка скважин.
    4. Запустите ПЦР с соблюдением следующих условий Термоциклер: 4 мин инкубации на 94 ° C для активации ДНК-полимераза; 45 циклов следующее (денатурация при 94 ° C для 20 s, отжиг на 56 ° C 30 s, и расширение в 72 ° C в течение 1 мин) и затем окончательное расширение при 72 ° C для 3 мин обратитесь к программе ПЦР в таблице 3.
    5. Выполняйте геля агарозы для обеспечения что амплификации ДНК является успешным. Использовать 1 мкл ПЦР продукта (с 3 мкл буфера погрузки) на геле агарозы 2% (w/v), сделал, смешивая порошок агарозы и буфер Tris Борат ЭДТА (КЭ) 0,5% и запустить по 45 мин 100 V.
  3. Шаг очистки креветок щелочной фосфатазы (SAP)
    Примечание: Этот шаг используется для удаления неинкорпорированных нуклеотидов. SAP фермента расщепляет фосфатные группы для предотвращения избыточного грунт и неинкорпорированных дНТФ от вмешательства в предстоящих расширения реакции.
    1. Сделайте мастер mix содержащие 1.7 единиц/мкл фермента щелочной фосфатазы креветок (SAP), 10 x буфер SAP и составляют тома с молекулярного уровня воды. Обратитесь к таблице 4.
    2. Добавить 2 мкл свежеприготовленные вверх SAP мастер смесь для каждой скважины пластины, уже содержащий 5 мкл от реакции PCR. Центрифуга для кратко и вернуться к Термоциклер при 37 ° C 40 мин и затем на 85 ° C за 5 мин для инактивации ферментов. Обратитесь к таблице 5.
  4. Грунтовка расширения реакции
    Примечание: Концентрация расширение грунтовки в смеси праймера расширения должны быть скорректированы по размеру (линейный грунтовка перестройки – LPA). Это потому, что есть обратная связь в пика интенсивности (на массовые спектры) и продукта массы. Регулировка концентрации грунтовка расширение исправляет для этого отношения производить вершины равной интенсивности. Скорректированы грунты, используемый для создания представитель результаты предоставляются в таблицах 6 и 7. Объемах должны генерировать 1,5 мл смеси праймера расширение.
    1. Вычислить разрежения факторов для каждого праймера, с использованием градиента алгоритма, доступные от Agena бионаукам («Настройка линейной грунтовка»), который настраивает для массы и концентрация праймера и общее количество грунтовки в мультиплексированном реакции (см. В таблицах 6 и 7). Введите UEP массы для каждого праймера в поле UEP_MASS листа линейной грунтовка перестройки.
      Примечание: Масса скорректированной концентрации для грунтовки будет автоматически рассчитывается в ячейку с текстом заголовка «Целевой реакции концентрацию (мкм).» Объем грунта будут добавлены в пул грунтовка будет выводить в ячейки под текст заголовка «Фондовой букварь тома будут добавлены в пул (мкл).» Объем воды будут добавлены в пул грунтовка составляют расчетные концентрации выводится в ячейку рядом с текстом «объем ПЦР класс РНКазы бесплатно H2O быть добавлены грунтовка бассейн (мкл)».
    2. Возьмите объем каждого праймера, как указано в файле линейной грунтовка перестройки и составляют пул грунт. Добавьте объем воды, алгоритм, чтобы размыть грунт бассейн, как определено в шаге 2.4.1.
      Примечание: Если градиентный алгоритм метода недоступен, другой метод является разделить на низкой массы и высокой массы праймеры и добавить двойной концентрации высокой массы грунты по отношению к группе низкой массы. Три или четыре группы, которые могут потребоваться для высоких plex assay (то есть, более чем 19 SNPs). Однако этот метод не даст как оптимальные тарифы как метод градиентный алгоритм.
    3. Соберите расширение основной микс. Для низких plex assay (1-18 plex) добавьте 0.2 мкл буфера, 0.1 мкл прекращение смеси, 0.94 мкл смеси праймера LPA скорректирована и 0.0205 мкл фермента (подготовленных на льду). Для высокой plex assay (19-36 plex) добавьте двойной концентрации смеси прекращение и фермента (прекращение смесь 0,2 мкл и iPLEX фермента 0,041 мкл). Обратитесь к таблице 8.
    4. Добавьте 2 мкл расширения реакции мастер смеси к пластине из предыдущей реакции, общий объем теперь достигло 9 мкл на хорошо. Центрифуга для кратко и место в Термоциклер: 94 ° C за 30 s первоначальный инкубации, 40 циклов 1 x 94 ° c за 5 s с 5 x (52 ° C за 5 s, а затем 80 ° C за 5 s) и затем 72 ° C для 3 мин см. в таблице 9.
  5. Очистки смолы.
    Примечание: Избыток солей теперь могут быть удалены из реакции с использованием смолы.
    1. Добавьте 16 мкл деионизованной воды скважин проверено пластины, чего объем в пластину до 25 мкл.
    2. Примените смолы, обычно 6 мг ямочка Смола плиты (приобретается отдельно), равномерно по всей пластине. Оставьте смолы для просушки в пластину ямочка смолы для 20 мин при комнатной температуре перед применением к пластине реакции. После добавления смолы, повернуть пластину для 5 мин при комнатной температуре от руки или с смесителем подвеска с медленной скоростью (например., 7,5 об/мин).
      Примечание: Перед загрузкой генотипирования аналита микросхему генотипирования, образцы и пробирного макет должен быть вклад в программный интерфейс. Это достигается с помощью файла дизайн резюме от пробирного дизайн инструмента.
  6. Измерения на платформе масс-спектрометрии.
    1. Центрифуга пластину на 3200 x g на 5 минут, чтобы избежать применения смолы для массового спектры чип.
    2. Загрузите макет пластины образцов интерфейс программного обеспечения системы до запуска.
      Примечание: Шаг 2.6.3 должна выполняться только квалифицированным персоналом.
    3. Применять смесь аналита генотипирования от пластины для генотипирования чип с системой дозирования. Далее загрузите чип на MALDI-TOF системы для создания массовых спектров от аналита смесь, которая затем может интерпретироваться с помощью программного интерфейса платформы.
      Примечание: Система генерирует массового спектры, направляя короткие импульсы Ультрафиолета на каждом «pad,» соответствует один колодец генотипирования пластины, массового спектры чипа. Этот пульс приводит к ионизации аналита и десорбции. Эти ионизированный ДНК молекул затем propelled в верхней части вакуумной трубки высокого напряжения электростатического поля, выделяя легкие ионы, которые передвигаться быстрее и достигнуть извещателя во-первых, от более тяжелых ионов. «Время полета» эти аналитов регистрируются в системе, из которой масса каждого фрагмента ДНК может определяться и таким образом может быть выведено базе нуклеотидов, присутствующих на SNP.

3. генотипирования данных

Примечание: контроль качества и интерпретации данных, являются не в центре внимания этой методологии бумаги. Однако следующие будут вкратце опишу интерпретации спектров массы.

  1. Ручной проверки и контроля качества массового спектров.
    Примечание: Сырой массы спектры генерируются системой и проанализированы с помощью программного обеспечения, перечисленных в Таблица материалов. Смесью Гаусса, метод кластеризации применяется к этот выход вероятностные генотипирования звонить.
    1. Откройте программное обеспечение для анализа. Выберите Typer анализатора. В меню файл выберите Открытых колодцев из файла и выберите XML-файл с данными спектра, созданные на шаге 2.6.3. Имя чип для запуска должна быть видна, выберите его и панель «светофор» 384-ну пластины будет отображаться список ОНП в выбранной хорошо. Отсюда выберите Вызвать кластера участков для просмотра рассеяния точек данных для каждого SNP.
      Примечание: Рекомендуется применить результат «без вызова» для низкой интенсивности SNP. В программное обеспечение, используемое для представителя результаты кластеризации отсечения величины 5, которая выше, чем по умолчанию, предлагается для строгого контроля качества. Этот параметр может корректироваться в Cutoff величины поля в разделе Параметры панели Пост обработки кластеров . Выберите Autocluster из вкладки инструменты для запуска кластерного анализа.
    2. Выполните ручной проверки генотип вызовов путем изучения декартовых участки в области обработки Post. В панели Assay выберите SNP интерес и нажмите на вкладке Постобработки кластеры , кластер участок с генотипом кластеризации будет видна с образец удостоверения и соответствующие генотипы для SNP.
    3. Изучить генотипа вызов кластеры и оценить, насколько хорошо каждый индивидуальный вызов кластеры с другими вызовами для SNP. Программное обеспечение предоставляет некоторые линии границы на участке для каждого генотипа для руководства; Смотрите пример генотип вызовы кластера участка от IL13 SNP (рис. 1). Если вызов не плотно кластера с другими вызовами и четко сидит вне кластера, или если он имеет очень низкой интенсивности, щелкните правой кнопкой мыши объект datapoint и выберите Изменить вызов вручную установить его нет , вызов.
    4. Чтобы обеспечить высокое качество генотипирования данных используется для анализа ниже по течению, исключите полиморфизмов и лиц с тарифы ниже порога КК, например , 90%. После того, как были сделаны соответствующие корректировки для вызова данных, экспортируйте данные для статистических приложений. В программное обеспечение, используемое для создания представительных результатов (перечислены в Таблице материалы) это достигается с Табличке данных выбором из меню Вид и выберите Сохранить как.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С протоколом, описанных выше мы генотипируемого тег SNPs через Th2 иммунного гена IL13 в когорте пищевой аллергии дела и управления9. Мы прикладной анализ логистической регрессии, скорректированные с учетом происхождения и других потенциальных ковариат проверить ли генетические варианты в рамках региона интерес увеличился риск аллергии еды. Таблица 10 9 показывает, что один вариант rs1295686 ассоциируется с вызов до...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем метод мультиплексированных генотипирования с помощью масс-спектрометрии. Представитель результаты были получены с помощью ПЦР в паре с MALDI-TOF масс-спектрометрии4 с Пробирной химии, перечисленных в Таблица материалов13. С этой платформы мы создали в общей сложности 11,295 генотипов на 1,255 лиц за 9 ОНП в течение 40 часов в лаборатории.

Мы проиллюстрировать полезность технику в отвечая генетических гипоте...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют без подтверждений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Геномная ДНК --1 μ L в концентрации 5-10 нг/мкм; L
Праймеры: прямая и обратная амплификация и удлинениеIDT-см. раздел рукописи 1.2.1 о дизайне праймеров
Деионизированная вода Например, вода Milli-Q -деионизированный с 18,2 MΩ. набор
реагентов iPLEX Gold Chemistry Agena Bioscience#10148-2включает в себя все реагенты для реакций в 2.2.1, 2.3.1 и 2.4.2, чипы и смоляные
ПЦР-планшеты (384-луночные)Abgene#ABGAB-1384Для системы MassARRAY планшеты Abgene совместимы
микропипеткамиодно- и 8-канальные
центрифуги совместим с 384-луночными планшетами
Термоамплификаторсовместим с ПЦР-программами, как подробно описано в 2.2.4, 2.3.2 и 2.4.3
Планшет для смолы Dimple Agena Bioscience6 мг, 384-луночный
ротатор пластин 
MassARRAY Analyzer 4 СистемаAgena BiosciencesMALDI-TOF (matrix-assisted laser desorbtion/ionization – время пролета) Масс-спектрометр.
Нанодиспенсер RS1000Agena Biosciences
Assay Design SuiteИнструмент для разработки мультиплексных анализов генотипирования
Hot Start TaqДНК-полимераза фермент 
Смола Agena BiosciencesПоставляется с комплектом iPLEX

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
  2. Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
  3. Kwon, J. M., Goate, A. M. The candidate gene approach. Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).
  4. Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
  5. Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
  6. Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
  7. Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791(2015).
  8. Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
  9. Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
  10. Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251(2013).
  11. Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
  12. Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
  13. Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
  14. Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
  15. Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MALDI TOF

Похожие статьи