Методическая статья

In Vitro модель для изучения воздействия 5-аминолевулиновой кислоты-опосредованной фотодинамической терапии на золотистый стафилококк биопленки

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57604

⸱

16 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эта рукопись описывает протокол для изучения Антимикробный эффект 5-аминолевулиновой кислоты опосредованной фотодинамической терапии (ALA-PDT) на золотистый стафилококк биопленки. Этот протокол может использоваться для разработки в vitro модель для изучения в будущем лечении бактериальных биопленок с PDT.

Аннотация

Золотистый стафилококк (S. aureus) является общей человеческой возбудителя, который вызывает гноеродной и системных инфекций. S. aureus инфекции трудно искоренить не только из-за появления устойчивых к антибиотикам штаммов, но и ее способность формы биопленки. Недавно фотодинамическая терапия (PDT) указан как один из потенциальных методов лечения для контроля инфекции биопленки. Однако чтобы улучшить наши знания о его влиянии на бактериальных биопленок, а также основных механизмов необходимы дальнейшие исследования. Эта рукопись описывает модель в vitro ФДТ с 5-аминолевулиновой кислоты (5-ALA), предшественник фактической фотосенсибилизатора, протопорфирин IX (PpIX). Вкратце, Зрелые S. aureus биоплёнки были инкубировали с Ала и затем подвергаются света. Впоследствии антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки был количественно путем расчета колонии, образуя единиц (CFUs) и визуализированное жизнеспособности флуоресцентные окрашивание через Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Представитель результаты показали сильный антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки. Этот протокол является простой и могут быть использованы для разработки в vitro модель для изучения обращения S. aureus биоплёнки с ALA-PDT. В будущем она может также ссылаться на PDT исследований с использованием других фотосенсибилизаторов для различных штаммов бактерий с минимальными изменениями.

Введение

S. aureus является важным грамположительных возбудителя, который колонизирует кожу и слизистую оболочку человека хостов. Его способность формы биоплёнки считается важным аспектом его патогенез1. Бактериальные биопленки – сообщество бактерий, внедренные в матрицу собственного производства, которая состоит из внеклеточного полимерных веществ, включая полисахарид, ДНК и белка. Эта матрица играет значительную роль в сохранении бактериальных инфекций, способствует высокая степень сопротивления для иммунной системы человека и текущих антимикробной терапии2. Антибиотики являются по-прежнему основных лечения для инфекции биопленки, хотя влияние антибиотиков на биоплёнки ограничены. Ранее показано, что клетки в биопленки 10 - 1000 раз более устойчивы к антибиотикам, по сравнению с их планктонных коллегами3. Таким образом чтобы завоевать этот вопрос необходимы альтернативные стратегии.

PDT, альтернативное лечение для лечения бактериальных инфекций, использует свет соответствующей длины волны для того чтобы активировать фотосенсибилизаторов. Это приводит к производству реактивнооксигенных видов (ров), которые являются смертельным для клеток-мишеней, нарушения клеточной стенки, инактивируют ферменты и повреждения ДНК4. Эта характеристика многолетних целевых делает его трудным для бактерий развивается устойчивость к лечению PDT.

Антимикробный эффект PDT на бактериальных и грибковых биопленки, с несколькими фотосенсибилизаторов, например толуидиновый синий, зеленый малахит, метиленовый синий, хлора e6 и порфиринов, был изучен в предыдущих докладах5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, пролекарство фактической фотосенсибилизатора, PpIX, характеризуется своей небольшой молекулярной массой и быстрое разминирование12,14. Эти преимущества дают ALA-PDT огромный потенциал в качестве терапевтического применения. Хотя многие группы12исследовано влияние ALA-PDT на планктонные бактерий, Антимикробный эффект ALA-PDT на бактериальных биопленок еще не выяснены. Между тем трудно сравнить результаты предыдущих исследований. Одной из причин является, что различные протоколы используются различными группами. Таким образом этот протокол описывает в vitro модель ALA-PDT системы, основанной на нашей предыдущей работы15. Влияние этой модели была подтверждена CFU расчет и жизнеспособности, окрашивание с CLSM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. биопленки

  1. Биопленки в 96-луночных планшетов
    1. Получения штамма S. aureus USA300 и 3 биопленки формирование клинических штаммов (C1 - C3) хранятся при температуре-80 ° C.
      Примечание: Способность клинических штаммов к форме, которую биоплёнки определяется микротитровальных пластина пробирного описано ранее15.
    2. Прививок бактерии в 5 мл Триптон соевый бульон (TSB) среде и культивировать в инкубаторе с тряску при 37 ° C ночь с неподвижной фазой.
    3. Центрифуга ночи бактериальной культуры на 4000 x g 10 мин при 25 ° C и затем удалить супернатант. Ресуспензируйте гранулы в фосфатный буфер (PBS) до конечной концентрации 2.0 x 109 кое/мл.
      Примечание: Концентрация бактерий был оценен измерения оптической плотности и далее определяется пластины рассчитывать16, показывая что OD 1600 суспензии содержит 1,5 х 108 кое/мл.
    4. Разбавить бактериальных подвеска до 1: 200 (1,0 x 107 кое/мл) в БСЭ носитель, содержащий 0,5% раствор глюкозы. В каждой скважине клетки Культура лечение полистирола 96-луночных микропланшетов инокуляции 200 мкл бактериальной подвески.
    5. Инкубируйте микроплиты статически при 37 ° C для 24 h под хорошо кислородом среде.
      Примечание: Время инкубации для зрелой биопленки может различаться для разных штаммов бактерий; Это должны быть определены до того, как PDT эксперимент15.
    6. Отказаться от средств массовой информации в скважинах и мыть Гонав скважин нежно с PBS три раза и затем удалить супернатант.
      Примечание: Шаг должно осуществляться очень осторожно чтобы не мешать сформированных биопленки.
  2. Биопленки в блюда
    1. Прививок штамма S. aureus USA300 в 5 мл среды TSB и культивировать в инкубаторе с тряску при 37 ° C ночь с неподвижной фазой.
    2. Центрифуга ночи бактериальной культуры на 4000 x g 10 мин при 25 ° C и затем удалить супернатант. Ресуспензируйте гранулы в PBS в конечной концентрации 2.0 x 109 кое/мл. Затем разбавить бактериальных подвеска до 1: 200 (1,0 x 107 кое/мл) в БСЭ носитель, содержащий 0,5% раствор глюкозы. Прививок 2 мл бактериальной подвеска в 35-мм оптическое качество стекла дно клетки культуры блюдо и инкубировать статически при 37 ° C в течение 24 ч.
      Примечание: Концентрация бактерий оценивалась путем измерения оптической плотности.
    3. Аспирационная СМИ с пипеткой и затем смойте биопленки в блюдо нежно с PBS три раза и затем, тщательно удалить супернатант.
      Примечание: Не дотрагивайтесь до кончика пипетки на дно посуды. Шаг 2.2 следует выполнять сразу же после этого шага для предотвращения высыхания сформированных биопленки.

2. свет облучения

  1. Хранить в холодильнике 4 ° C 5-Ала. Перед эксперимент разбавляют 5-ALA с PBS до 10 мм.
    Примечание: решение 5-ALA должно быть свежеприготовленный до эксперимента.
  2. В экспериментальной группе добавьте 200 мкл 10 мм Ала в каждой скважине Гонав или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 1 ч. Затем облучать пластины/блюдо с светоизлучающих диодов (СИД) с интенсивностью освещения 100 МВт/см2 за 1 ч до достижения свет дозы 360 Дж/см2 основных длины волны 633 нм ± 1017.
    Примечание: Для того, чтобы позволить световой энергии эффективно и равноправно доставлен биопленки во всех блюд скважин, исправить расстояние от вершины источника света до хорошо/блюдо на 6,0 см и ограничить экспериментальной региона в области Центральной облучения (10 см х 8 cm). для обеспечения воспроизводимые результаты, эксперименты должны выполняться в том же комнатной температуре.
    В Светодиодные облучения шаг чтобы избежать прямого воздействия пластины других источников света, таких, как солнечный свет, освещение в комнате или Ламплайт, Сид был включен перед перемещением блюдо пластины в зоне облучения, и свет был достаточно ярким, чтобы завершить операцию.
  3. Настроить группы управления (три контрольные группы были созданы в нашем эксперименте).
    1. Для первого элемента управления группа (Ала - LED-), добавить 200 мкл PBS в каждой скважине микроплиты или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и проинкубируйте 2 ч.
    2. Для второй группы управления (Ала + LED-), 200 мкл 10 мм Ала для каждой скважины микроплиты или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и проинкубируйте 2 ч.
    3. Для третьей группы управления (Ала-LED +), 200 мкл PBS для каждой скважины микроплиты или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и проинкубируйте 1 ч. Затем подвергайте пластину к LED с 360 Дж/см2 легких облучения на основных длины волны 633 нм ± 1017.
      Примечание: В шаге облучения LED, Избегайте прямого воздействия на других источников света, например, Солнечный свет, освещение в комнате или Ламплайт пластины.

3. определение эффективности лечения PDT

Примечание: Для подтверждения эффект ALA-PDT на биоплёнки S. aureus , жизнеспособность клеток с или без ALA-PDT оценивалась CFU подсчета, а также жизнеспособность пятнать.

  1. Определение оставшихся жизнеспособных бактериальных клеток
    1. После ALA-PDT лечения отказаться от средств массовой информации в скважинах и мыть скважин с PBS три раза, чтобы удалить все non сторонник клетки для обеих экспериментальных и контрольных групп.
      Примечание: Этот шаг должно осуществляться очень осторожно.
    2. Тщательно очистите бактерии адэрентных клеток из скважин с кончиком пипетки и собирать клетки в конические трубы.
    3. Центрифуга для бактериальных подвеска на 4000 x g 10 мин при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант.
    4. Ресуспензируйте бактерий в 1 мл 0,25% Панкреатин фермента в PBS и инкубировать при 37 ° C для 1,5 ч.
    5. Центрифуга на 4000 x g 10 мин; отбросить супернатанта, а затем Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл PBS.
    6. Сделать 1:10 серийных разведений мобильные решения с PBS; затем 5 мкл каждого последовательного разбавления образца на пластину Триптон соевый агар (TSA). Инкубировать TSA пластины при 37 ° C для 16 h; затем граф (по невооруженным глазом) количество бактериальных колоний (кое/мл).
  2. Наблюдение за биоплёнки S. aureus , CLSM
    1. После легких облучения мыть биопленки в культуре блюдо с PBS три раза.
      Примечание: Этот шаг должно осуществляться очень осторожно.
    2. Добавьте 1 mL 1 мкм Грин люминесцентные ядерных и хромосомы пятно, что проницаема прокариот клеточных мембран (например, SYTO9) и 1 мл раствора 1 мкм пропидий йодидом (PI) за 20 мин до пятно биопленки, а также мертвых клеток.
    3. Соблюдать жизнеспособных клеток (зеленое флуоресцирование, Ex / Em 485 Нм/530 Нм) и мертвые клетки (красное флуоресцирование, Ex / Em 485 Нм/630nm) под CLSM с 63 X 1.4-NA нефти погружение объектива.
    4. Создание изображения с помощью микроскопии программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Жизнеспособность бактерий в биопленке уменьшилась после ALA-PDT лечения по сравнению с элементами управления (Ала - LED-, Ала + LED - и Ала-LED +) в USA300 и три клинических штаммов (рис. 1).

Подтвердить результаты кое пробирного и наблюдать антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки в situ, USA300 биопленке были визуализированное CLSM с жизнеспособность пятнать. Жизне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

PDT был хорошо изученных терапии для лечения рака, поскольку он был изобретен более чем 100 лет назад18. За последнее десятилетие PDT применялся в качестве антимикробного стратегии и показал эффективность против некоторых устойчивых к антибиотикам болезнетворных бактерий12. По сравнению с планктонных государства, бактериальных биопленок представляется более устойчивы к антибиотикам лечения3, в то время как эффект ALA-PDT на биопленок не исследовано п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Эта работа финансировалась национальный характер науки фонд Китая для молодых ученых (№ 81300810), Шанхай молодой доктор учебной программы (№ 20141057) и национальные естественные науки фонд Китая (81671982, 81271791 и 81571955). Мы хотели бы поблагодарить LetPub (www.letpub.com) для обеспечения языковой помощи в ходе подготовки этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Триптон Соевый бульон (TSB)ОКСОИДCM0129B
Триптон Соевый агар (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012Наборы жизнеспособности бактерий ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ BacLight 
Пропидий йодид (PI)Thermo Fisher ScientificL7012Наборы для определения жизнеспособности бактерий ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ BacLight 
ПанкреатинSigma-AldrichP3292
5-аминолевулиновая кислота (АЛК)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus штамм USA300//ИсточникСША 300 ссылок " Теновер Ф.К., Геринг Р.В. J Антимикробная химия. 2009 Сентябрь; 64(3):441-6".
Staphylococcus aureus клинические штаммы (C1-C3)//Все клинические штаммы были выделены у пациентов с хроническим риносинуситом в отделении оториноларингологии-хирургии головы и шеи, глазной и ЛОР-больнице Фуданьского университета [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-луночный микропланшетCorning Inc3599Прозрачные микропланшеты с плоским дном и полистиролом, обработанные TC, индивидуально упакованные, с крышкой, стерильный
фторишNEST Biotechnology801001стеклянным дном, непирогенные
пробирки Eppendorf Safe-Lock, 1,5 млEppendorf0030120086
микроцентрифуга Eppendorf 5417EppendorfZ365998 |  Инкубатор SIGMA
Thermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Настольные орбитальные шейкеры
Светоизлучающий диод (LED)Wuhan Yage Оптико-электронная техника COLED-IB
Leica TCS SP8 конфокальный лазерно-сканирующий микроскопLeica Microsystems Leica Microsystems
программное обеспечение Leica LAS AF LeicaMicrosystems
IMARIS программное обеспечениеBitplane

Ссылки

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202(2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863(2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи