Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Завод микробных взаимодействий: Транскрипционный анализ ответ Bacillus Mycoides картофель корень экссудаты

11.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57606

⸱

2 июля 2018 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Groningen

В этой статье

Краткое содержание

Цель Протокола, представленные здесь является изучение реакции транскриптомики endosphere изолированные Bacillus mycoides картофель корень экссудата. Этот метод способствует выявлению важных бактериальных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий и в принципе применима к другим эндофитов и растений, с незначительными изменениями.

Аннотация

Полезные бактерии завод связанные играют важную роль в поощрении роста и предотвращения болезней растений. Применение rhizobacteria роста растений (PGPR) как Биоудобрения или биоконтроля агентов стал эффективной альтернативой использования обычных удобрений и может увеличить урожайность при низких затратах. Завод микробных взаимодействий зависит от хоста выделяется завод сигналов и реакцией расписка их связанные бактерий. Однако молекулярные механизмы как полезных бактерий реагировать их связанного растительного сигналы полностью не поняты. Оценка транскриптомики реакции бактерий на корень экссудата является мощный подход для определения экспрессии генов бактерий и регулирование rhizospheric условиях. Такие знания необходимо понимать основные механизмы, участвующие в завод микробных взаимодействий. Этот документ описывает подробный протокол для изучения реакции транскриптомики B. mycoides EC18, штамм, изолированные друг от друга от endosphere картофеля, картофель корень экссудата. С помощью последних технологий высокопроизводительного секвенирования этот протокол может выполняться в нескольких недель и производить массовых наборов данных. Во-первых мы собираем корень экссудата в стерильных условиях, после чего они добавляются в б. mycoides культур. RNA от этих культур изолированы с помощью метода фенол/хлороформ в сочетании с комплектом коммерческих и подвергли контроля качества инструмент автоматизированного электрофореза. После виртуализации, проводится анализ данных с помощью веб T-REx конвейера и определены группы дифференциально выраженной генов. Этот метод является полезным инструментом для содействия новым открытиям на бактериальных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий.

Введение

Растения могут экссудата до 20% углерода, зафиксированной во время фотосинтеза через корни в ризосфере1, т.е., узкая зона почвы возле корней. Из-за более высокую доступность питательных веществ ризосфере является подходящую среду обитания для различных микроорганизмов, включая поощрение роста растений бактерии. Экссудат корня содержат широкий спектр неорганических соединений как ионы, неорганических кислот, кислорода и воды. Однако большинство из корня экссудата формируется органических материалов, которые могут быть разделены низкомолекулярных соединений и высокомолекулярных соединений. Низкомолекулярных соединений относятся аминокислоты, органические кислоты, сахара, фенольные соединения, жирные кислоты и массив вторичных метаболитов. Высокомолекулярные соединения состоят из белков и слизь2,3. Ризосфере микроорганизмов можно использовать некоторые из этих соединений как источника энергии для экономического роста и развития. Корень экссудата играют важную роль в формировании rhizobacterial сообщества, поскольку завод выпускал соединений в экссудата может повлиять на поведение связанных ризосферной бактерии, затрагивая экспрессии определенных генов.

Понимание бактериальных ответ на корень экссудата является ключевым шагом в расшифровке механизмы взаимодействия растений микроба. Как бактериальный ответ на завод микробных взаимодействий является продуктом экспрессии генов дифференциальных, могут изучаться с транскриптом анализа. С помощью этого метода, предыдущие исследования определили ряд важных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий. В Pseudomonas aeruginosaгенов, участвующих в метаболизме, хемотаксис и тип II секрецию показывали реагировать сахарная свекла корень экссудата4. Вентилятор и др. 5 изучал транскриптомики профилирование б. amyloliquefaciens FZB42 в ответ на кукурузный корневой экссудата. Их результаты показывают, что, генов, сильно индуцированных корень экссудата, несколько групп участвуют в метаболических путях, касающиеся утилизации питательных веществ, хемотаксис, моторики и не рибосомной синтеза антимикробных пептидов и поликетиды.

Точность этих исследований зависит от коллекции корневых экссудата. Хотя несколько методов описал коллекцию корневых экссудат для различных целей, они требуют сложных инструментов или не выполняются в строго контролируемых условиях6,,7,8. Кроме того, ингибирующих ризосфере микроорганизмов могут влиять корень экссудата состав, влияя на завод проницаемости клеточных мембран и повреждения тканей корня, особенно в случае консорциумов микроорганизмов9. При расследовании микробной ответ на корень экссудаты, важно использовать четко определенных условиях для того, чтобы избежать изменения соединений от других микроорганизмов10. Кроме того высокое качество РНК требуется для РНК seq транскриптом исследования. Однако при работе с не модель бактериальных штаммов, стандартные протоколы или коммерческих комплекты обычно имеют низкую эффективность из-за неизвестных факторов или специальных роста свойства.

Протокол, описанные здесь была проверена с помощью б. mycoides, который является грамположительных, спорообразующих бактерий Фила Firmicute. Это повсеместно в ризосфере различных видов растений. Несколько свойств поощрение роста растений были зарегистрированы для этого вида, в том числе индукции систематического сопротивления (ISR) в сахарной свеклы11, ингибирование затухания от возбудителя Pythium огурец12, а также азота Фиксация в ризосфере подсолнечника13. Однако молекулярные механизмы взаимодействия с растения-хозяина не хорошо изучены.

Цель экспериментов, представленные здесь является изучение реакции транскриптомики изолированные endosphere B. mycoides картофель корень экссудата. Иными словами, протокол состоит из следующих этапов: во-первых, собирать картофель корень экссудата в стерильных условиях. Затем извлечь РНК высокого качества из бактериальных клетках, обработанных с корневой экссудата. Последним шагом является анализ данных, с помощью конвейера T-REx веб-14. Этот протокол был использован для идентификации генов б. mycoides , которые показывают изменения в уровнях выражения при контакте с корня экссудата и таким образом могли бы играть важную роль в завод микробных взаимодействий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. прорастания картофеля в стерилизованные условиях

  1. Промойте поверхность картофеля с стерильной водой. Искупайте картофеля в 70% этанола, а затем в 3% гипохлорита натрия, 5 мин. Промойте его снова с стерильной водой, чтобы удалить любые оставшиеся гипохлорита натрия.
  2. Подготовить материалы, необходимые для прорастания и выращивания клубней картофеля; стерилизовать пластиковые горшки, приживления корзины, вермикулита и воды путем автоклавирования их при температуре 121 ° C 20 мин.
    Примечание: Убедитесь, что все материалы, используемые, автоклавируемый. В противном случае используйте другие методы стерилизации.
  3. Поставьте стерилизовать поверхности картофеля в приживления корзину и это в газобетона горшок, содержащие мокрой вермикулит.
  4. Держите горшок в климатической камере при температуре 24 ° C в течение трех недель. Установите его на циклах 16 h света (120 мкмоль м-2s-1) и 8 h тьмы. Во избежание микробного загрязнения, используйте большие стеклянные волокна для покрытия горшок.

2. сбор картофеля корень экссудаты

  1. Когда ростки прорастают, передачи корзину с весь картофель в стерилизованные стакан заполнены с 150 мл газобетона деионизированной воды, с картофелем клубни помещен чуть выше поверхности воды и корни погруженной в воду (см. Рисунок 1). Держите саженец в климатической камере и использовать те же параметры как и раньше [24 ° C; циклы 16 ч света (120 мкмоль м-2s-1), 8 h тьмы].
  2. Со второго дня на сбор воды, содержащие экссудата и пополнить стакан с стерильных деионизированной водой. Выполнение выборки каждый день до седьмого дня после передачи саженец.
  3. Храните каждый образец отдельно при 4 ° C. Для каждого образца, распространение 100 мкл на Лурия Бертани (LB; триптон 1%, 0,5% экстракт дрожжей, 0,5% NaCl) плита агара для проверки микробиологических загрязнений. Отбросить загрязненных образцов.
  4. Объединить собранные образцы один саженец и сконцентрировать их, для них при-40 ° C до окончательный объем 150 мл.

3. рост бактерий

  1. Полоска штамм B. mycoides от-80 ° C глицерин запас на плиту LB агар и инкубировать пластину на 30 ° C на ночь.
  2. Прививок LB жидкой среде с одной колонии от плиты и расти в культуре в тряску инкубатор на 200 об/мин на ночь на 30 ° C.

4. лечение и выборки бактерий

  1. Для сравнения кривая роста бактерий, угощали отрицательный контроль с корневой экссудаты, подготовьте серию флаконов, содержащих 50 мл жидкой среды LB. Добавить 0,5 мл на ночь бактериальной культуры все колбы и добавьте 0%, 5%, 10%, или 15% (v/v) корня экссудата или стерильной деионизованной воды в среднесрочной, соответственно.
  2. Использование культуры с дейонизированной водой вместо корня экссудата как элемент управления. Измеряют оптическую плотность на 600 Нм (600OD) каждые 1 час позже. Создание кривой роста путем построения значения600 ОД против времени.
    Примечание: Мы увидели, что 10% экссудата корень не влияет на рост B. mycoides (см. Рисунок 2); Этот показатель был использован для РНК seq экспериментов.
  3. Разбавить ночь культуры B. mycoides с 90 мл подогретым LB средних первоначального ОД600 ~ 0.05 в 300 мл флакон. Добавить 10 мл корень экссудата в культуре и Инкубируйте на 30 ° C в течение 1 ч.
  4. Используйте для лечения 10 мл стерильной деионизованной воды как элемент управления. Сбор от культуры клетки центрифугированием при 9000 x g на 2 мин при 4 ° C. Отбросить супернатанта и немедленно заморозить гранулы в жидком азоте, то храните его при температуре-80 ° C до использования.

5. РНК изоляции

Примечание: Перед началом изоляции, подготовить верстак, стойки и пипетки, очищая их раствором обеззараживания РНКазы (см. Таблицу материалы). Надевайте перчатки на все время и убедитесь, что все трубы, советы и решения РНКазы бесплатно. Всегда держите образцы на льду, когда это возможно.

  1. Добавить 0,1% (v/v) диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) ультрачистая вода (100 мкл DEPC в 100 мл раствора), смешайте это хорошо и держать его при комнатной температуре на ночь. Автоклав смесь для инактивации DEPC после лечения на ночь. Используйте этот DEPC-лечение ультрачистая вода для подготовки TE буфера [10 мм трис-HCl (рН = 8); 1 мм ЭДТА] и 10% раствор SDS (w/v).
  2. Оттепель клетки окатышей на льду и приостановить в 400 мкл буфера TE (DEPC). Перенесите суспензий в 2 мл трубы колпачок.
  3. Премикс 300 мкл хлороформ изоамилового спирта (24:1 v/v) и 300 мкл фенола (кислоты фенола, класс РНК) и дайте смеси настояться 5 мин. Возьмите 500 мкл органических верхнего этапа для добавления в ресуспензированы клетки. Затем добавьте 50 мкл 10% SDS и 0,5 г в стеклянных шариков (0,5 мкм) в трубку.
  4. Плотно закройте крышку и поместить трубку в гомогенизатор мельницы (см. Таблицу материалы). Выполните 3 × 45 s пульс гомогенизации с интервалом 1 мин на льду.
  5. Центрифугуйте образцы на 10 мин на 11000 x g (4 ° C) и передачи Верхний этап новой трубки.
  6. 500 мкл хлороформ изоамилового спирта (24:1) на верхний этап шага 5.5 и центрифуги смесь для 5 мин на 11000 x g (4 ° C).
    Примечание: Следующие шаги были изменены инструкцией производителя Коммерческая стеклянных волокон на основе фильтра РНК изоляции комплект (см. Таблицу материалы).
  7. Передать свежие трубки 500 мкл верхнего этапа, добавить 2 тома (1 мл) буфера lysis/привязки и смешайте его закупорить вверх и вниз.
  8. Совместить фильтр и коллекции трубок (из комплекта изоляции РНК) и Пипетка смесь из шага 5.7 трубки фильтра. Центрифуга для трубы 15 s на 8000 x g и отмены потока через.
  9. Приготовить 1,5 мл microcentrifuge трубы с 100 мкл буфера DNase, 10 мкл DNase I и 5 мкл битор РНКазы (см. Таблицу материалы). Добавить приготовленный раствор смеси на фильтр фильтр трубки и проинкубируйте его за 20-30 мин при температуре 15-25 ° C.
  10. Выполните стирки согласно инструкции производителя. Используйте 50 мкл буфера для элюировать РНК.
  11. Сохраните eluted РНК-80 ° c и поставьте пластиковые парафин фильм вокруг него. В то же время передать несколько микролитров образца 1,5 мл microcentrifuge трубки для выполнения проверки качества.

6. Проверка качества РНК и последовательности

  1. Проверьте РНК с microvolume спектрофотометром.
    Примечание: Коэффициенты поглощения на 260/280 должна быть выше 1.8, и коэффициенты на 260/230 должна быть выше по крайней мере 1.8, предпочтительно выше 2.0.
  2. Запуск, очищенный РНК в инструмент автоматизированного электрофорез с помощью анализа РНК рекомендовать комплекта (см. Таблицу материалы); число целостности РНК (Рин) должно быть по крайней мере выше 7, чтобы продолжить.
  3. Использовать общее количество 3 мкг РНК за образец для создания библиотек с подготовкой библиотеки РНК-Seq комплекта (см. Таблицу материалы) следуя рекомендациям изготовителя.
    Примечание: Библиотека препараты были виртуализация на платформе высокопроизводительного секвенирования и паре конец чтений были получены.

7. анализ данных с помощью веб-конвейер T-REx

  1. Выполнить, качество фильтрации с помощью FASTX-Инструментарий версия 0.0.13 (показатели качества Phred > 20). Трим сырье РНК-Seq считывает из адаптер последовательностей с помощью средства Trimmomatic.
    Примечание: Все ниже по течению анализы были основаны на чистый данных с высоким качеством.
  2. Скачать базу данных генома ATCC 6462 NCBI B. mycoides (NCBI присоединение №: CP009692.1) и использовать его как ссылку генома для сопоставления чистого читает, используя Bowtie2/2.2.3.
  3. Использование HTSeq v0.6.1 для подсчета числа читает сопоставляется каждый ген и читает за kilobase транскрипт на миллион сопоставленных читает (RPKM) каждого гена, основанный на длину гена и читает граф сопоставлен этот ген.
  4. Для анализа данных по трубопроводу T-REx, используйте таблицу RPKM в качестве входных данных, а также три описательного файла: (i) файл факторы описать эксперимент в факторы, (ii контрасты файл, чтобы определить, какие факторы будут сравниваться для экспрессии генов дифференциальной и (iii) файл класса для описания групп генов интерес.
    Примечание: Описательный файлы формата in.txt. Примеры можно найти на веб-странице T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Подробная инструкция для анализа данных с помощью T-REx можно найти в предыдущей публикации, де Йонг и др. 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Завод связанные микроорганизмы могут положительно влияют рост растений и здравоохранения. Однако механизмы сложных взаимодействий между растениями и их микробной симбионтами полностью не поняты. Корень экссудата играют важную роль в регулировании деятельности rhizobacterial и поведение, и как правило постулируется, что микробная колонизация корней инициирует с привлечением микробов в корень экссудата. Целью этой работы было расследовать ответ транскриптомики rhizobacterial б mycoides<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Завод микробных взаимодействий было предположить, чтобы определяться тонкое равновесие между бактерий и растений. Такого взаимодействия являются очень сложными и трудно изучать в природные системы, которая включает различных видов микроорганизмов, потенциально действуя как консорциумы. Этот документ описывает упрощенный протокол к изучению бактериальных ответ на корень экссудата в строго контролируемых условиях. Транскриптом профиль rhizobacteria, под воздействием корень экссудаты, содержится подробная информация о бакте...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Jakob Viel за его полезные замечания и предложения. Мы также благодарим Анн де Йонг за его помощь в анализе биоинформатики. Yanglei-Йи и ли Жибо поддерживаются Советом стипендии Китая (CSC). Мы благодарим NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (тки-AF-15510) за их финансовую поддержку в предустановочный набор OPK.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
гипохлорит натрияSigma  CAS: 7681-52-9 10-15%  активный хлор
Luria-Bertani (LB)
Нью-Брансуик ScientificInnova 4000
спектрофотометрThermo Fisher ScientificGenesys 20
стеклянные шарики с жидким азотом
SigmaG88930,5 &; m
пробирка 2,0 мл с завинчивающейся крышкойРНКаза без РНКазы
1,5 мл и 2,0 мл пробиркабез РНКазы
Гомогенизатор Бисерная мельницаBioSpec607Mini_beadbeater
центрифугаEppendorf5430
Диэтилпирокарбонат (DEPC)sigmaCAS: 1609-47-8
Додецилсульфат натрия (SDS)сигмаCAS: 151-21-3 10% раствор, приготовленный из воды, обработанной DEPC MQ
TE буфер10 мМ Tris-HCl; 1 мМ ЭДТА, рН=8
фенолСигмаРНК класса
хлороформ-изоамиловый спирт приготовить 24:1 хлороформа:изоамилового спирта, хранить при комнатной температуре
Набор для выделения высокочистых РНКRoche11828665001
раствор для обеззараживания РНКазыInvitrogenAM9780РНКаза-Zap
Автоматизированный электрофорезAgilent2100Биоанализатор
Микрообъемный спектрофотометрThermo Fisher ScientificNanodrop ND-1000
AgilentRNA 6000 Nano kit 
Ингибитор РНКазыThermo Fisher ScientificRiboLock
Набор для подготовки библиотеки направленной РНКNEBUltraFor Illumina
Инкубатор бульона eppendorf Набор для анализа качества РНК

Ссылки

  1. Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
  2. Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
  3. Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).
  4. Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
  5. Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).
  6. Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
  7. Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
  8. Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
  9. Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
  10. Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
  11. Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
  12. Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
  13. Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
  14. de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).
  15. Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).
  16. Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
  17. Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).
  18. Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
  19. Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

T REx
Завод микробных взаимодействий: Транскрипционный анализ ответ Bacillus Mycoides картофель корень экссудаты
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.