Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

9.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57609

⸱

7 октября 2018 г.

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для содействия интеграции трансген и основатель трансгенных мышей с высокой эффективности производства путем простой инъекции лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться оплодотворенной яйцеклетки.

Аннотация

Почти 40 лет pronuclear ДНК инъекций представляет собой стандартный метод для создания трансгенных мышей с случайных интеграции трансгенов. Такая обычная процедура широко используется во всем мире и его основное ограничение проживает в бедных эффективность интеграции трансген, что приводит к низкой урожайности основатель животных. Трансген включили только несколько процентов животных, родившихся после имплантации вводят оплодотворенных яйцеклеток. Напротив лентивирусные векторы являются мощными инструментами для переноса интегративной генов и их использование для передают оплодотворенной яйцеклетки позволяет высокоэффективное производство основателя трансгенных мышей с средняя урожайность выше 70%. Кроме того любой штамм мыши могут использоваться для производства трансгенных животных и пенетрантностью трансген выражение является чрезвычайно высокой, выше 80% с лентивирусные опосредованной трансгенез, по сравнению с ДНК микроинъекции. Размер фрагмента ДНК, которая может быть груз лентивирусные вектор ограничено 10 КБ и представляет собой главное ограничение этого метода. С помощью простой и легко выполнять процедуры инъекции под вителлинового оплодотворенных яйцеклеток, более чем 50 основатель животных могут быть произведены в одной сессии микроинъекции. Такой метод является очень приспособлены для выполнения непосредственно в основатель животных, быстрый выигрыш и потери функции исследований или геномной ДНК областей экрана для их способность контролировать и регулировать ген выражение в естественных условиях.

Введение

Новаторскую работу Гордон et al. в 1980 году показал, что после имплантации в pseudopregnant мышей, плазмида ДНК инъекции в мужской pronuclei оплодотворенных яйцеклеток может принести производства трансгенных животных, которые интегрированы плазмида ДНК1. Демонстрация, что могут быть получены трансгенные млекопитающих оказали огромное воздействие на глобальные наук о жизни, открыв путь к Роман областях исследований, как для фундаментальных наук и трансляционная биомедицинских наук. В последние четыре десятилетия ДНК микроинъекции стало обычной практикой. Хотя огромное количество трансгенных мышей были произведены, стандартный метод не является полностью пригоден для всех штаммов мыши и требует много времени беккроссов2,3. Его применение в отношении других видов остается сложной4 и урожайность трансген интеграции ограничивается несколько процент род животных5. Кроме того эффективность интеграции трансген представляет сдерживающим фактором, который объясняет бедных урожайность pronuclear ДНК инъекции. В этой связи интегративной вирусных векторов являются наиболее эффективные инструменты для груза и интегрировать трансгенов и таким образом может предоставить новые средства для значительного увеличения урожайности интеграции, единственное ограничение в том, что размер трансген, который не может превышать 10 КБ6 .

Лентивирусные векторы псевдо-типизированных с конверт белков вируса везикулярного стоматита (ВСВ) являются инструментами передачи pantropic и высоко интегративной гена и может использоваться для передают оплодотворенных яйцеклеток7. Zona pellucida окружающих яйцеклеток является естественным вирус барьер и должен быть передан позволить трансдукция с лентивирусные векторы. Трансгенные животные были получены путем преобразования оплодотворенных яйцеклеток после микро бурение или удаление вителлинового8,9. Однако инъекции под вителлинового в пространстве наблюдаться, по-видимому, самый простой способ передавать оплодотворенные яйца как первоначально описано Лоис и коллеги-7.

Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы позволяет высокие урожаи в производстве трансгенных животных, которые находятся выше 70% род животных. Такая доходность свыше 10 раз выше, чем лучший доходность, которая может быть достигнута с помощью стандартных pronuclei ДНК инъекций7,10,11. В этом контексте одной сессии инъекции создаст по меньшей мере 50 основатели трансгенное (F0). Таким образом, большое количество учредителей совместим с фенотипирование эффекта трансген, непосредственно над F0 мышей без необходимости создания трансгенные мыши линии. Это преимущество позволяет для быстрого скрининга трансген эффект и специально приспособлены для выполнения в vivo выгоды и потери функции исследований в течение недели. Кроме того регулирующие элементы ДНК можно также быстро проверяться на карте усилители и ДНК мотивы связаны факторы транскрипции11,12. С pronuclear инъекции трансгенов обычно интегрировать как несколько копий в уникальный Локус. С лентивирусные векторы интеграция происходит в нескольких локусов одну копию за Локус10,13. Таким образом множество интегрированных локусов скорее связаны с очень высокой выражение пенетрантностью, наблюдается в трансгенных учредителей, что делает новый сгенерированной модели более надежной.

Важно отметить, что при использовании pronuclear для инъекций ДНК, визуализация pronuclei во время процедуры абсолютно необходим. Это техническое ограничение предотвращает использование оплодотворенных яйцеклеток, происходящих из разнообразных штаммов мыши. Таким образом, производство трансгенных модели в определенном напрягаться, для которых pronuclei невидимый требует производства животных в разрешительной штамм следуют по крайней мере 10 последовательных беккроссов для передачи трансген в желаемой мыши штамм. С лентивирусные вектор инъекции наблюдаться пространства всегда видна и инъекции не требует узкоспециализированных навыков. В качестве примера NOD/SCID трансгенных мышей, которые не подходят для инъекций pronuclei были получены с вирусный вектор инъекции14.

Здесь всеобъемлющий протокол представляется простой производства трансгенных мышей с использованием инъекций лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться одной ячейки стадии эмбриона. Трансген выражение, контролируемых либо с вездесущими или подробно описаны конкретные промоутеров ячейки.

PTrip ΔU3 лентивирусные костяк был использован в данном исследовании15. Этот вектор позволяет производить репликацию дефектных лентивирусные векторы, в которых последовательность U3 был частично удален чтобы удалить U3 промоутер активности и создания самостоятельной инактивирующего вектор (SIN)16. Лентивирусные вектор запасы были произведены переходных transfection клеток ГЭС 293T с p8.91 инкапсуляции плазмида (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G кодирование гликопротеин G (ВСВ) вирус везикулярного стоматита17и pTRIP ΔU3 Рекомбинатные вектор. Процедура подробно производства предоставляется в качестве дополнительных методов.

Производство высокого титра лентивирусные вектор запасов осуществляется в условиях биобезопасности уровня II (BSL-2). Это верно для большинства трансгенов за исключением онкогенов, которые должны быть произведены в BSL-3. Таким образом производство в условиях BSL-2 в большинстве случаев достаточно. Кроме того использование и производство обычно отключены для большинства национальных регулирующих органов, занимающихся генетически модифицированных организмов (ГМО). Ограниченное количество некомпетентных ГРЕХ репликации лентивирусные векторы (ниже 2 мкг белка капсид p24) может использоваться в условиях BSL-1, как описано в ГИО французского Агентства согласился с рекомендациями Европейского союза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, которые включают животных работы получили этические утверждения и было санкционировано французского министерства научных исследований и образования под номером #5094-20 APAFIS 16032916219274 v6 и 05311.02. ICM животных фонда PHENOPARC была аккредитована Министерством сельского хозяйства Франции под номером аккредитации B75 13 19. Общий протокол требует выполнения каждой процедуры в точные сроки, которая резюмируется в на рисунке 1.

1. животных покупки и подготовка основных соединений

  1. Покупка животных
    1. Порядка 25 вазэктомии самцов B6CBAF1/JRj, которые являются 8 недель возраста (поколения F1 от оригинала пересекает между ♀C57Bl/6JRj и ♂CBA/JRj).
      Примечание: Изолировать мужчины по прибытии. Вазэктомии мужчины может быть повторно использован для по крайней мере один год.
      Измените клетки каждые 3 недели.
    2. Порядка 50 B6CBAF1/JRj самок, которые 10 недель возраста и сохранить пул по крайней мере 50 животных.
    3. Порядка 10-15 C57BL/6JRj плодородные мужчин, которые являются 8-недельного возраста.
    4. Порядка 30 C57BL/6JRj женщин, которые являются 4-недельного возраста.
  2. Анестезия и эвтаназии
    1. Анестезия осуществляется с помощью тома 300μL кетамин/Ксилазина смеси, вводили внутрибрюшинно (кетамин в дозе 150μg/г веса тела, Ксилазина в дозе 0.15μg / g массы тела). Животные помещены под грелку для регулировки температуры тела. Проверьте рефлексов, щипать хвост животного до начала процедуры.
    2. Эвтаназия была исполнена шейки матки дислокации. Обезглавливание была включена в качестве дополнительного способа подтвердить смерть животного. Эвтаназия эмбрионов была выполнена путем обезглавливания.
      Примечание: По прибытии, позволяют животных минимум 1 неделя, чтобы приучать к фонду (без обработки или спаривания). Важно отметить, что любой мыши штаммов, включая трансгенных линий может быть использован как плодородные мужчин и плодородные женщин для суперовуляции. Выбор штамм должна производиться согласно требованиям научный вопрос.
  3. Гормональный препарат
    1. 910 мкл буфера PSMG (беременных Маре гонадотропина сыворотки) в 1 флакон лиофилизированных ГСЖК, сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
      Примечание: Каждый Алиготе содержит 55 UI для 11 мышей. Никогда не держите ГСЖК аликвоты для более чем 2 недели после первого использования.
    2. Добавьте что 2730 мкл буфера ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) в 1 лиофилизованные препараты ХГЧ во флаконе. Сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
      Примечание: Каждый Алиготе содержит 55 UI для 11 мышей.
  4. Гиалуронидаза подготовка
    1. Растворить 1 флакон 3 мл среды м2 для получения 10 мг/мл, раствор и сделать 50 мкл аликвоты гиалуронидазы. Затем, хранить при температуре-20 ° C.
  5. Подготовка инструментов хирургии
    1. Простерилизуйте все хирургии инструменты, с помощью автоклава.

2. суперовуляции женщин-доноров

  1. В объекте животных, с использованием 12 h день - ночь циклы, придать ГСЖК на 2 вечера в день -3. Придать ХГЧ в 12 утра в день -1 и мат плодородные мужчин сразу после инъекции ХГЧ.
  2. В день -3, добавить 1 мл стерильного 0,9% раствора NaCl в 1 Алиготе 100 мкл ГСЖК (55 UI). Придать 10 C57BL/6JRj женщин с 100 мкл, внутрибрюшинно с помощью шприца без каких-либо мертвого объема.
    Примечание: Каждая мышь будет получать 5 UI ГСЖК.
  3. В день -1, добавить 1 мл стерильного 0,9% раствора NaCl в 1 Алиготе 100 мкл ХГЧ (55 UI). Придать мышей, которые получили внутрибрюшинно ГСЖК инъекции с 100 мкл разбавленного раствора ХГЧ (5UI). Используйте шприц без каких-либо мертвого объема. Выполнение инъекции медленно и ждать перед удалением иглы, таким образом, чтобы жидкость не утечки.
    Примечание: Каждая мышь будет получать 5 UI ХГЧ. Инъекция ХГЧ должны быть выполнены 46 h после ГСЖК.
  4. Место каждой девушки C57BL/6JRj в клетке мужчины стад непосредственно после инъекции ХГЧ.
  5. Проверьте вагинальных свечей в первой половине дня 0 и использовать позитивные женщины для сбора оплодотворенных яиц.

3. Подготовьте женщин Pseudopregnant B6CBAF1/jRj

  1. Мат вазэктомии мужчина за день до-коллекция-яйца (день -1) с 2 B6CBAF1/JRj суки в 5 вечера.
    Примечание: Очень важно для спаривания самок, которые возникая от разных клетках чтобы избежать синхронизации циклов женщин. Это позволит увеличить урожайность получения вагинальных свечей. Кроме того не добавляйте женщина в клетке мужчины, что изменилось в течение последних 2 дней. Эффективность репродуктивного поведения самцу увеличивается, когда клетка грязный.

4. оплодотворенные яйца коллекции

  1. Подготовка
    1. Мкл 1450 м2 гиалуронидаза запасов решение подготовить рабочий раствор гиалуронидазы.
    2. Поместите одну каплю 100 мкл рабочего раствора гиалуронидаза одну женщину, используемой для производства оплодотворенные яйца в 100 мм Петри блюдо и держать при комнатной температуре.
    3. Добавьте 500 мкл M16 плиты 4 скважины. Используйте 2 скважины на тип лентивирусные векторы, которые будут вводиться: один будет содержать вводят яйца и другие те не вводили. Место 4 хорошо пластины в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 атмосферой.
  2. Подготовьте пипетки для сбора и обработки эмбрионов.
    1. Смягчить стеклянные капилляры гематокрит (75 мм/60 мкл), вращающийся центр жесткий стеклянные капиллярные трубки в пламени.
    2. Удаление капилляров от жары как можно быстрее и потяните, чтобы получить трубки с внутренним диаметром около 300 µm. тянуть на охлаждением труб для получения аккуратные перерыв.
  3. Собирайте яйцеводов.
    1. Усыпить C57BL/6JRj самок на шейки матки дислокации в 9 утра в день 0. Смерть подтверждена обезглавливание.
      Примечание: Этот метод эвтаназии был одобрен IACUC и соответствует европейским рекомендациям.
    2. Выполните большой горизонтальный разрез открыть брюшной полости с ножницами. Маточных труб расположен между матки и яичника.
    3. Удаление mesometrium и мембраны, перевозящих видных кровеносных сосудов с изогнутой щипцами.
    4. Отделяйте маточных труб от яичника с изогнутой щипцами.
    5. Изогнутый пинцет можно используйте в качестве руководства сократить маточных труб из яичника с помощью изогнутые ножницы.
    6. Вытяните маточных труб и вырезать из матки с изогнутые ножницы.
      Предостережение: Не прикасайтесь опухшие ампула, содержащий оплодотворенных яиц. Выполните всю процедуру с использованием стерильных инструментов.
    7. Поместите все собранные яйцеводов в среде м2 (35 мм культуры блюдо) при комнатной температуре
    8. Место 2 яйцеводов же падения 100 мкл гиалуронидаза рабочего раствора (0,3 мг/мл).
  4. Удаление ячеек кучевые из оплодотворенных яиц.
    1. Под стереомикроскопом, используйте 2 инсулиновые шприцы: первый провести маточных труб и вторая изорвать ампула и разогнать оплодотворенные яйца в рабочий раствор гиалуронидазы.
    2. Возьмите подготовленные стеклянные пипетки для сбора яиц и подключить его к трубе и 0,22 мкм фильтр, установленный на мундштук, чтобы удалить все яйца. Собрать все яйца и мыть их путем последовательных проход в 6 различных капли µL 100 м2 среды.
    3. Место промывают оплодотворенные яйца в инкубатор увлажненные 37 ° C с атмосферой 5% CO2 в среде M16.

5. делать инъекции пипетки

  1. Использование тонкостенных стеклянные капиллярные трубки (10-15 см длиной) с внешним диаметром 1 мм и зажим этот капилляр в горизонтальных микропипеткой съемник.
    Примечание: В наиболее горизонтальных пипеткой пулеры застежки молнии, 3 параметры можно регулировать: тепловой энергии, потянув силы и время задержки между Отопление и вытягивать. Настройте эти параметры для получения инъекций пипец, которые напоминает представленному на рисунке 2A. Для пользователей, которые регулярно выполняют микроинъекции ДНК используйте стандартные параметры и настроить задержку между Отопление и вытягивать чтобы изменить глобальный форму кончика пипетки.

6. Создание холдинга пипетки

  1. Использование инъекций пипеткой подготовить проведение пипеткой.
  2. Прикрепите впрыскивая пипетки к microforge. Вырежьте пипетку с microforge для получения острый кончик симметрично диаметром 80 до 100 мкм. Тогда польский кончик с тепла на microforge для получения симметричной круглой формы без острых изгороди.

7. Подготовка инъекции пипетки, содержащие лентивирусные вектор

  1. Центрифуга лентивирусные вектор подвеска на 160 x g за 2 мин до Пелле мусора часто присутствуют в замороженных лентивирусные запасов.
  2. Восстановить супернатант и перенести его в новой 0,5 мл трубку в класс безопасности II кабинета.
  3. Передача 1 мкл супернатант инъекции пипетки, подготовленный, как описано в шаге 5, с помощью микро погрузчик.
  4. Установите инъекции пипетки на держателе инструмент правой микроманипулятор. Подключение к левой микроманипулятор накапайте Холдинг.
    Примечание: Титр трансдукции лентивирусные вектора будет прямо коррелировала с эффективностью производства основатель. Для высокой эффективности (> 70%), использование вирусных векторов с титр в диапазоне 100 нг p24 капсульных белков/мкл. Когда титр выражается как трансдукции единиц (ту), титр должна быть выше 109 ту/мл. Лентивирусные вектор запасы должны быть произведены переходных transfection клеток 293T с p8.91 encapsidation плазмиды, pHCMV-G, кодирование везикулярного стоматита вирус (ВСВ) гликопротеин G, как описано в дополнительные методы18.

8. микро инъекций

  1. Лунки 8 мкл среды м2 в центре крышки и депрессии слайд с легкими парафинового масла (зародыш испытания) чтобы избежать испарения.
  2. Место 20 яйца в падение как наименее разошлись как можно скорее.
    Предупреждение: Не делайте пузырей при сдаче на хранение эмбрионов.
  3. Убедитесь, что открыт кончиком пипетки инъекции. Если нет, то нажмите инъекции пипетку с пипеткой Холдинг.
  4. Набор microinjector для инъекций время 20 s.
    Примечание: Вязкость вирусный подвеска позволяет четкие визуализации дисперсии вирусный вектора в пространстве наблюдаться. Давление впрыска следует скорректировать для того, чтобы заполнить все пространство в пределах 20 s инъекция, которая представляет объем от 10 до 100 pL. Давление впрыска не должна превышать 600 гПа.
  5. Аспирационная одного оплодотворенная яйцеклетка, которая содержит 2 pro ядер и 2 полярные органов с пипеткой Холдинг под стереомикроскопом.
  6. Придать яйцо с microinjector, с помощью параметров, описанных в 8.4, в пространстве наблюдаться.
    Предостережение: Не прикасайтесь к плазматической мембраны с инъекций пипетки.
  7. Внедрить все оплодотворенные яйца в пакетах 20 яиц и вводят яйца сразу в предварительно нагретой среде M16 в инкубатор увлажненные 37 ° C с атмосферой 5% CO2.
    Примечание: Инкубируйте яйца вводят минимум 30 мин после инъекции перед переводы эмбриона.

9. перенос эмбрионов в B6CBAF1/JRj Pseudopregnant женщин

  1. Проверьте совокупления вилка 16 h после спаривания самок B6CBAF1/JRj с B6CBAF1/JRj вазэктомии мужчины. Сделать это непосредственно перед запуском коллекции яйцо.
  2. Подготовьте имплантации пипеток вводят эмбриона.
    1. Сделайте пипетки имплантации эмбрионов, как описано для сбора и обработки эмбрионов (шаг 4.2). Выберите пипетки с внутренним диаметром около 150 мкм с узкой части около 4-5 см в длину.
      Примечание: Наконечник должен быть пламени, полированные, с тем чтобы уменьшить возможный ущерб яйца или маточных труб.
      1. Заполните с легкими парафинового масла (зародыш испытания) чуть выше плеча пипеткой.
      2. Аспирационная небольшой воздушный пузырь, а затем м2 среднего и, наконец, второй воздушный пузырь.
      3. Составить эмбрионов один позади друг друга, чтобы свести к минимуму общий объем среднего, которые будут вводиться в маточных труб вместе с эмбрионов.
      4. Завершить загрузку очень маленькая капля света парафинового масла (зародыш испытания) шириной около одного эмбриона.
        Предупреждение: Будьте нежны пока регулирующ пипеткой.
  3. Перенос эмбрионов.
    1. Простерилизуйте все инструменты.
    2. Анестезировать самка с помощью внутрибрюшинного введения 300 мкл стерильного 0,9% раствора NaCl, содержащий 150 мкг / г веса тела кетамина и 0,15 мкг / г веса тела Ксилазина.
    3. Проверка глубины анестезии, щипать хвост животного с щипцами и придать subcutaneouly 0,1 мг/кг обезболивающее (бупренорфин) до начала процедуры.
    4. Бритье 2 см по обе стороны спины вдоль спинного мозга на уровне последнего ребра.
    5. Место женщины мыши на грелку и в поле стерильным. Вырежьте 2 см x 2 см окно в середине спины мыши.
    6. Применить антисептическим раствором (10% повидон йодид) на коже и сделать поперечный разрез 1 см с ножницами, а затем слайд кожи сбоку до тех пор, пока завязи (оранжевый цвет) видна через стенку тела.
    7. Сделайте 5 мм разрез в стенке тело чуть выше яичника с тонкой ножницами под Микроскоп бинокулярный хирургического.
    8. Подобрать жировой ткани с атравматической бульдог зажим и вытащить яичников, маточных труб и в верхней части матки.
    9. Визуализировать ампула и сделать гемисекция ножницами беззаботными в сегменте маточных труб, которая связывает завязи ампула.
    10. Ввести передачи эмбриона пипетки и доставить яйца в ампула, останавливаясь на первый воздушный пузырь в пипетку имплантации.
    11. Повторите процедуру на втором маточных труб.
    12. Заделывают кожи с раной клипов.
    13. Место животного в восстановлении камеры (39 ° C, 30-60 мин) до полностью проснуться.
    14. Повторите обезболивающее инъекции через 12 ч и 48 часов в случае признаков боли или страданий.
    15. Удалите клипы рану 7-10 дней после операции.
    16. Проверьте имплантированных самок для беременности, следуя их вес кривой каждые 3 дня после имплантации. Значительного веса можно наблюдать 10-12 дней после имплантации и будет свидетельствовать для беременности.
      Примечание: Все эмбрионы, которые будут развиваться здесь будет представляют предполагаемого трансгенных учредителей. Фенотип этих учредителей могут быть проанализированы на любой стадии развития или после рождения согласно научный вопрос связан с поколения этих трансгенных животных.

10. генотипирования трансгенных основатели

  1. Подготовить генотипирования буфер, содержащий 10 мм трис-HCl, рН 8; 5 мм ЭДТА, рН 8,0 с 0,2% SDS (w/v), 50 мм NaCl. Стерилизовать генотипирования буфера через фильтр 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
  2. Положите extraembryonic мембран (для эмбрионов) или кусочек хвоста (для род животных) в 500 мкл отфильтрованных генотипирования буфера и мкл 15 протеиназы K (20 мг/мл). Инкубируйте на ночь при 55 ° C.
  3. Центрифуга lysate на 15000 x g 5 минут, а затем использовать 1 мкл супернатант для реакции PCR. Lysate может храниться при температуре 4 ° C на несколько месяцев.
  4. Выполните амплификации PCR фрагмента трансген 20 мкл реакции тома, содержащего 1 x PCR буфера, MgCl 1,5 мм2, 200 мкм дНТФ, 0,2 мкм каждого праймеры PCR, 1 UI полимеразы дна Taq и 1 мкл каждого переваривается образца. Как отрицательный контроль используйте 1 мкл H2O. Как позитивный элемент управления используйте ДНК из лентивирусные вектор плазмиды, содержащие трансген.
  5. Для обнаружения eGFP описано использование:
    eGFP вперед грунтовка: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP вспять грунтовка: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Выполнять амплификации PCR в Термоциклер: 4 мин на 94 ° C, после чего 35 циклов 1 мин на 94 ° C, 1 мин при 60 ° C и 2 мин при 72 ° C.
  7. Загрузите продукт PCR на 2% гель агарозы для того, чтобы визуализировать 300 bp eGFP продукт PCR как показано на рисунке 2B.
    Примечание: Все лица, показаны 300 группа ПЦР bp интегрировали eGFP трансген и может рассматриваться как мутация.
  8. Анализируйте трансген выражение в трансгенных животных. Например, выполнить гистологические и иммуноокрашивания, как показано на рис. 3 и рис. 4 и описал в дополнительных методов.
    Примечание: Оба трансген выражение и анализ фенотипа должны выполняться с помощью соответствующих методов, согласно глобальный научный вопрос.

11. Количественная оценка числа трансген копирования

  1. Подготовка образцов ДНК для количественного PCR.
    1. Экстракт геномной ДНК (геномная ДНК) от lysate протеиназы K, полученного на шаге 10.3 с использованием коммерческих комплекта согласно инструкциям производителя.
    2. Количественно геномная ДНК методом спектрофотометрии на 260 Нм.
    3. Развести каждого геномная ДНК образца до конечной концентрации 10 нг/мкл.
    4. Для каждого образца, подготовить 5 серийных разведений (1:5) в H2O получить 6 трубок в следующих концентрациях: 10 нг/мкл, 2 нг/мкл, 0,4 нг/мкл, 0,08 нг/мкл, 0,016 нг/мкл и 0.0032 нг/мкл
  2. Подготовьте количественные микс реакции PCR (ПЦР).
    1. Подготовьте грунт смесь для ПЦР. Для каждой пары праймера для ПЦР, добавить 10 мкл вперед праймера (Стоковый раствор грунтовки 100 мкм), 10 мкл обратного праймера (100 мкм) и 80 мкл H2O.
      Примечание: Для того чтобы усилить eGFP, используйте вперед TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA и обратить вспять TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG грунтовки. Ген Cdx2 используется как нормализация для ПЦР (2 копий на геном). Для Cdx2 нормализатор использовать вперед GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG и обратный GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT грунтовки
    2. Готовить 2 смеси ПЦР, один с eGFP смеси праймера и один с Cdx2 грунтовка микс. Подготовьте достаточно смеси ПЦР для усиления 6 разведений в дубликаты каждого геномная ДНК. Один ПЦР-реакции содержит 3,8 мкл H2O, 5 мкл флуоресцентный зеленый 2 x реакция смеси и 0,2 мкл смеси праймера.
      Примечание: Для каждого трансгенных животных для тестирования, будет производиться 24 реакций ПЦР. Смесь реакции предоставляется для 384 хорошо ПЦР машины.
    3. Для каждого животного, тестирование, распространение: 12 скважин с 9 мкл eGFP смеси ПЦР и 12 скважин с 9 мкл Cdx2 смеси ПЦР. 1 мкл каждого разведения геномная ДНК, 2 скважины, содержащие смесь ПЦР eGFP и 2 скважины, содержащие смесь ПЦР eGFP.
    4. Отпуск 2 скважин для каждого ПЦР смешать в котором геномная ДНК была заменить H2O как отрицательный контроль.
  3. Поместите 384 хорошо пластину в машину ПЦР и применять следующие работает протокол: 10 мин при 95 ° C 50 циклов 10 s при 95 ° C и 1 мин при 60 ° C.
  4. Анализ данных. Для каждого геномная ДНК для тестирования участок Ct значения как функция журнала геномная ДНК общего количества (6 очков в дубликатов). Соответствовать кривой с использованием линейной регрессии методом наименее квадратных и экстраполировать Ct значение, соответствующее точки пересечения с осью y. Используйте экстраполированных значений Ct eGFP и нормализованных Cdx2 для вычисления числа eGFP копирования по отношению к Cdx2 (2 копии), используя стандартный 2ΔdCt метод11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Трансгенных животных были получены с помощью протокола, представленные здесь. Представитель приводит оба повсеместно и проиллюстрированы выражения конкретных трансген типа ячейки.

Учредительный выражение трансгенов

Вездесущие промоутеров являются фундаментальные исследования инструменты выразить трансгенов в устойчивой и эффективной основе. Для очень б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы в оплодотворенных яйцеклеток, описанные здесь в результате производства трансгенных эмбрионов, которые принесли более чем 70% эмбрионов трансгенных относительно общее количество собранных эмбрионов. Этот результат согласуется с предыдущими докладами и является примером специфика процедуры2,7,10,,1112. При сравнении вс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим Магали Дюмон и Роландо Мелони для критических чтении рукописи и iVector и Phenoparc ядер ICM для оказания технической помощи в производстве лентивирусные вектор и животных жилья соответственно. Эта работа была поддержана нейронаук де Hospitalo-Университетский институт Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, будущее Investissements АНР-10-IAIHU-06. P.R. получил финансирование ассоциации де Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) и совместных JDRF / INSERM гранта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PMSG 50UISigmaG4527
hCG 5000UISigmaCG5-1VL
NaClSigma7982
100 мм чашка ПетриDutsher353003
4 лунки Nunc чашкаDutsher56469чашка для ЭКО
M2 средняяSigmaM7167
M16 средняяSigmaM7292
0,22 & микро; m Шприцевой фильтрDutsher146611
фермент гиалуронидазы 30 мгSigmaH4272эмбрион мыши протестирован
инсулин серингVWR613-3867Terumo Myjector
Изогнутые щипцыMoria2183
Изогнутые ножницыMoriaMC26
Аспиратор трубки в сборе для калиброванных микрокапиллярных пипетокSigmaA5177-5EA
Капилляры из боросиликатного стеклаГарвардский аппаратGC 100-10
Горизонтальный пуллер микропипетокNarishigePN-30
MicroforgeNarishigeMF-900
Инвертированный микроскопNikonTransferman NK2 5188Hoffman модуляция контрастная подсветка требуется
МикроманипуляторEppendorfCelltram воздушный
контролер удержания пипеткиEppendorfFemtojet
Минеральное маслоSigmaM8410мышиный эмбрион протестирован
МикроинъекторEppendorfFemtojetМожет использоваться для введения ДНК или вирусных векторов
Dumont # 5 щипцыMoriaMC 40
vannas микроножницыMoria9600
ИзофлуранцентраветISO005ISO-VET 100% 250мл
окригельcentravetOCR002
Повидон иодурецентраветVET001ветедин 120мл
БупренорфинцентраветBUP002Бупрекер 0,3мг/мл 10мл
Tris-HClSigmaT5941Тризма гидрохлорид
EDTASigmaE9884
SDSSigma436143
NaClSigmaS7653порошковая
протеиназа KSigmaP2308 
oneTaq kit NEBM0480L
ПраймерыEurogentec
Strip of 8 PCR tube4titude4ti-0781
96 луночный термоамплификаторApplied Biosystems4375786Veriti
Genomic DNA mini kitinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Мастер миксRoche4887352001SYBR Green 
Планшет Multiwell 384Roche5217555001
прибор для количественной ПЦР 384 лункиRoche5015243001LightCycler 480

Ссылки

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741(2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413(2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274(2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

M16M2
Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.