Методическая статья

Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы

DOI:

10.3791/57619

⸱

25 августа 2018 г.

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем organotypic культивирование протокол вырастить эмбриональные куриные органов в пробирке. С помощью этого метода, развитие эмбриона курицы ткани могут быть изучены, сохраняя при этом высокую степень контроля над окружающей среде культуры.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные куриные обычно используется как организм надежная модель для развития позвоночных. Его доступность и короткий инкубационный период делает его идеально подходит для экспериментов. В настоящее время изучение этих путей развития в куриного эмбриона проводится путем применения ингибиторов и наркотики на локализованных участках и при низких концентрациях, с использованием различных методов. В vitro культивирования тканей — это метод, который позволяет исследование тканей, отделены от организм хозяина, минуя одновременно многих физических ограничений при работе с весь эмбрионов, например восприимчивость эмбрионов высокие дозы потенциально смертоносных химических веществ. Здесь мы представляем organotypic протокол для культивирования эмбриональные куриные половины головы в пробирке, который открывает новые возможности для изучения процессов развития за пределами в настоящее время установленных методов культивирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные куриные (Gallus gallus) является организма отличную модель широко используется в области биологии. Ее инкубационный период составляет около 21 дней, и много яиц может быть инкубировали одновременно, делая эксперименты быстро и эффективно. Возможно самое главное, эмбрион также легко манипулировать, позволяя обширное исследование из ключевых процессов развития и генов и белков, которые управляют эти процессы.

Эмбриональные куриные глаз это сложный орган, который развивается через взаимодействия целого ряда различных тканях похож на многих других систем организма. Этот метод позволяет исследование развития этих тканей, особенно на поздних стадиях развития. К примеру многослойные сетчатки может быть особый интерес для тех, кто изучает развитие нервной системы. Альтернативные методы, позволяющие изучение других тканей глаза, такие как роговицы, тело vitreal, объектив, склера и веки пользу исследователей. Глаз эмбриональные куриные также содержит ряд плоских костей, склеры косточки, которые могут быть использованы в качестве модели для изучения intramembranous кости индукции и окостенения в позвоночных1.

В настоящее время существует целый ряд методов, используемых для изучения эмбрионального развития. Микроинъекции ингибирующее антител или других ингибирующее молекулы2,3, хирургически имплантированных микрошарики, пропитанной ингибитор4, и электропорации5 все методы, которые могут быть использованы для помощью генов или протеинов интереса в эмбрион. Подобные методы используются для upregulate белков. Эти методы не являются без их ограничения. Например, при использовании химических веществ изменять эмбрионального развития, должны быть оценены смертоносное воздействие на эмбрион, и это ограничивает использование вышеупомянутых методов локализованные сайты применения при дозах достаточно низким для обеспечения живучести эмбриона.

В vitro культивирования тканей используется в широком диапазоне организмов для изучения развития и может использоваться для обхода некоторых из вышеуказанных ограничений. К примеру бедрах6, перо бутоны7,8и9 конечностей курица все были изучены с помощью ткани, культивирование методы, как яичках мыши10 и корни и стебли растений11. Эти методы предоставляют ученые высокую степень контроля над развитием ткани, такие как способность к колебаниям температуры и изменять доступность питательных веществ. Изоляции ткани от всей эмбрионов также делает его гораздо меньше подвержены смертоносного воздействия химических веществ, таким образом позволяя манипуляции исследований в глобальном масштабе в более высоких концентрациях. Другим заметным преимуществом в vitro культивирование является сохранение ткани клеточной среды; расположение тканей остается относительно неизменным, что делает его возможным изучение взаимодействия между различными ткани типы9. Таким образом, в пробирке культивирования открывает двери для дополнительных экспериментальных подходов не доступны в естественных условиях или в ovo модели.

В настоящее время изучение развития эмбриона курицы глаза с помощью химических веществ является особенно сложным. Количество extraembryonic мембраны покрытия эмбриона, что делает его трудно применять микрошарики или химических веществ; эмбрион также очень активны в яйцо, как он становится старше, еще более усложняют метод уже трудно. Этот протокол позволяет легкий доступ для глаз и окружающих тканей, устранение этих барьеров, а также предоставляет новые возможности для изучения процессов развития в глаза. Этот протокол был создан для изучения индукции склеры косточки внутри эмбриона глаз.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: На стадии эмбриона, используйте гамбургер и Гамильтон12 (HH) Промежуточная таблица.

1. эмбриона инкубации

  1. Инкубируйте яйца оплодотворенные куриные в инкубатор стерильные, контролем температуры при 37 ° C ± 1 ° C и ~ 40% влажности.
  2. Поверните яйца 1 x в день и позволяют им инкубировать в HH34 (8 дней после оплодотворения).

2. Подготовка и стерилизации материалов

  1. Для 12 эмбрионов, автоклав, 2 Л дистиллированной воды, 1 Л 0,85% куриных физраствора, 12 стеклянной пипетки, 1 коробка бумажных салфеток, 24 2,5 х 2,5 см квадратов полу пористой фильтровальной бумаги и 24 2,5 х 2,5 см площадей стальной проволоки сетки с краями загнутыми вниз. Для стерилизации материалов, автоклав их при температуре 121 ° C по меньшей мере 15 мин.
    Примечание: Автоклавирование материалов можно сделать заранее.
  2. Стерилизуйте инкубатор с 70% этанола, вытирая стороны, полки и дверцы. Место 2 пластиковые контейнеры, содержащие газобетона дистиллированной воды внутри инкубатор для поддержания влажности. Prewarm инкубатор культуры до 37 ° C ± 1 ° C и ~ 40% влажности. Убедитесь, что инкубатор полностью темно; Если дверь является прозрачным, накройте фольги.
  3. Prewarm 100 мл питательной среды и 1 мл пенициллина, помещая их в инкубатор культуры.
  4. Обложка области с бумажным полотенцем и стерилизовать скамейке путем распыления с 70% этиловом спирте. Стерилизуйте 2 пары щипцы, Рассечение ножницами, лезвием бритвы и пластиковой ложкой с 70% этанола в подобной манере.
  5. Петри стерильные 100 мм место 12 и 24 Петри стерильные 35 мм на скамейке для использования. Убедитесь, что блюда остаются в стерильный пакет до использования.

3. эмбриона подготовка

Примечание: С этого момента, носите маски защитные пыли во избежание загрязнения культур. Бактериальной или грибковой инфекции будет уничтожить культуру, и существует опасность его распространения быстро для всех культур в инкубаторе.

  1. Трещина открыть яйцо и переноса эмбриона в чашке Петри 100 мм, содержащие 0,85% куриных физиологического раствора. Стадии эмбриона в соответствии с анатомическими особенностями описанные в гамбургер и Гамильтон, постановка рекомендации12 и подтвердить эмбрион находится HH34.
  2. Вырезать шею и затем пополам голова эмбриона на средней линии с использованием стерилизованные лезвия бритвы. С помощью стерильный пинцет, удалите мозга. Клюв оставьте нетронутыми.

4. Культура установки

  1. 2 место из 35 мм Петри внутри одной чашке Петри 100 мм.
  2. Поместите сетку стальной проволоки внутри каждой чашке Петри 35 мм.
  3. С помощью щипцов, передать 1 глав пополам кусок 2,5 x 2,5 см, полу пористой фильтровальной бумаги с глаз вверх. Обеспечить ткани является безопасным и не соскользнуть, слегка наклоняя его.
  4. С помощью щипцов, тщательно место тканей глаза и фильтровальную бумагу поверх сетки стальной проволоки в 1 35 мм Петри, создавая поднял этап с тканей глаза на вершине.
  5. Повторите шаги с 4.3 и 4.4 с другими половину головы.
  6. Тщательно с помощью стерильной стеклянной пипетки, добавьте питательной среды непосредственно в каждой чашке Петри 35 мм, пока он не достигнет уровня фильтр-бумаги. Не погружайте половину головы в питательной среде.
  7. Добавьте 50 мкл 10 000 ед/мл пенициллин стрептомицином питательной среды в каждой чашке Петри.
  8. Сложите кусок оберточной бумаги в небольшой площади и поместите его в 100 мм Петри. Смачивают газобетона дистиллированной водой.
  9. Место культуры блюдо в стерильной, темные инкубатора при 37 ° C ± 1 ° C и ~ 40% влажности до 4 дней.
  10. Повторите шаги 3 и 4 для каждого эмбриона.
    Примечание: Количество эмбрионов необходимо будет зависеть от конкретного эксперимента; Здесь мы описываем протокол для 12 эмбрионов.

5. Культура обслуживания

  1. Один раз в день пополните пластиковые контейнеры в инкубаторе свежий, газобетона дистиллированной водой.
  2. Ежедневно проверяйте всех культур для бактериальной или грибковой инфекции. Инфицированы культур, распались или в котором среды изменил цвет. Отмена всех культур, которые заражены.

6. Фиксация

  1. После культивирования, удалите все блюда из инкубатора.
  2. Используя пару щипцов, аккуратно удалите глаз из фильтровальной бумаги, стараясь не рвать ткань.
  3. Исправьте тканей глаза в параформальдегида 4% в 1 x фосфат амортизированное saline на ночь при 4 ° C или в нейтральных амортизированное формалина 10% на ночь при комнатной температуре.
  4. Магазин ткани на 4 ° C в 1 x фосфат амортизированное saline.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью этого метода, эмбриональные куриные глаз может культивированный от 8 день его развития (HH34) в vitro на 4 дня. Четыре дня в ovo развития соответствует HH38.

Этот метод культивирования поддерживает развитие бутонов перо вокруг глаз и на веках (рис. 1B). Эти перья почки не являются настоящей в ovo в HH34 до культивирования (рис. 1а), ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует установленные ткани, культивирование методы для достижения роста, курица глаза от эмбриональных день 8 (HH34) в vitro на 4 дня. Этот метод культивирования сетки первоначально был описан Trowell15. Мы оптимизировали протокол от Пинто и холл в 1991 исследование16 используя полу пористые мембраны с сеткой для изучения индуктивный сигналов между слоями разделенных тканей эмбриона курицы глаз15. С помощью этого метода, пл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели поблагодарить Грегори Халлер (Маунт Сент Винсент университет) за его предварительную работу по разработке протокола. Авторы хотели бы также поблагодарить Николас Джонс (Университет Маунт Сент-Винсент) для его технического опыта и помощи с съемок и производства аудио визуальной части рукописи. Дэниэл Эндрюс был поддержан финансирование от МСВУ и естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) через награду исследования студент бакалавриата. Тамара а. Франц-Odendaal поддерживается грантом Сенти обнаружения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки Петри для клеточных культур 35 ммЧашка353001удобным захватом, полистирол, непирогенный
100 мм чашки Петри для клеточной культурыЧашки Corning353003для культуры тканей, полистирол, непирогенная
бумажная салфеткаKimtech34155Kimtech Science Brand Wipe Wipers, 280 на картонную
проволочную сеткун/д/дпроволочная сетка из нержавеющей стали (размер сетки 0,7 мм)
одноразовые стеклянные пипеткиVWR14673-010Боросиликатное стекло одноразовые 5 3/4"
питательная средаGibco12591-038Fitton-Jackson Modification, [+] L-глутамин с феноловым красным (BGJB)
пенициллин-стрептомицинSigma-AldrichP445810000 единиц/мл пенициллин стрептомицин раствор стабилизированный
фильтр бумагаВатман1454 090полупористая фильтровальная бумага 90мм
оплодотворенные куриные яйцаСельскохозяйственный колледж Университета Далхаузин/д можнополучить на местных фермах
хлорид натрия (NaCl)EMDSX0420-3кристаллы хлорида натрия, реагент класс
1 л стеклянная бутылкаVWR89000-2401 л пирекс автоклавируемая стеклянная бутылка
этанолFisher ScientificBP8201170% молекулярно-биологические
контейнеры для посудын/дн/д магазинныестерилизованные
одноразовыми бритвенными лезвиямиEtOH VWR55411-050однолезвийные промышленные бритвенные лезвия (хирургическая углеродистая сталь)
пластиковые ложкин/д н/д н/дмагазинные и стерилизованные с
пылезащитной маски3Mн/д3M 8500 Comfort Mask
параформальдегидSigma-AldrichP6148параформальдегид, реагентный класс, кристаллический
нейтральный буферизованный формалинFisher Scientific7221010% нейтральный буферизованный формалин
фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)н/а/д10X фосфатно-солевой буферный pH 7,4 (137 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)15
мл соколиные пробиркиVWR21008-216предварительно стерилизованные центрифужные пробирки
щипцыFSTн/дмелкие щипцы
цыплый физиологический раствор н/дн/ 0,85% NaCl
фольган/дн/дмагазинное
бумажное полотенцен/д/дмагазинный
для культуры тканей Corning н и помощью EtOH н н

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
  2. Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
  3. Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
  4. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).
  5. Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).
  6. Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
  7. Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
  8. McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
  9. Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
  10. Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).
  11. Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  13. Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
  14. Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
  15. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
  16. Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
  17. Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
  18. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи