Методическая статья

Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим

DOI:

10.3791/57627

⸱

20 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает важнейшие шаги и меры предосторожности, необходимые для выполнения одноклеточного мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим. Эта техника является простой и эффективный метод для анализа выражения профиль заранее определенный набор генов из одной клетки характеризуются патч зажим записей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, экспонируется различных морфологических, физиологических и молекулярные особенности. Это разнообразие препятствует простой идентификации и характеристика этих типов клеток, предпосылки для изучения их конкретных функций. Эта статья описывает мультиплекс одной ячейки обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) протокол, который позволяет, после фиксации записи в форме долек, обнаружить одновременно выражение десятки генов в одной ячейке. Этот простой метод может быть реализован с морфологическая характеристика и широко применяется для определения фенотипических признаков различных типов клеток и их конкретной клеточной среды, такие как вблизи кровеносных сосудов. Принцип этот протокол является для записи ячейки с техникой патч зажим, чтобы урожай и обратить вспять транскрибировать его цитоплазматических содержание, и обнаружить качественно выражение предопределенный набор генов мультиплексной ПЦР. Это требует тщательной разработки праймеры PCR и внутриклеточных патч зажим решение, совместимое с RT-PCR. Для обеспечения стенограмме селективный и надежного обнаружения, этот метод также требует надлежащего контроля от цитоплазмы заготовки для усиления действия. Хотя необходимо строго соблюдать правила, обсуждаемых здесь, практически любой электрофизиологической лаборатории можно использовать мультиплекс одну ячейку техника RT-PCR.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, участвующих в различных физиологических процессах. Их определение и характеристика, предварительным условием для понимания их специфических функций, может быть очень сложным ввиду большой морфологических, физиологических и молекулярных разнообразия, что характеризует корковых клеток типы1 ,2,3,4.

Одноклеточных мультиплексной ПЦР-основан на комбинации патч зажим и методов RT-PCR. Она может одновременно зонд выражение более чем 30 предопределенные генов в клетки electrophysiologically выявленных5. Включение трассирующими нейронов в записи пипеткой далее позволяет морфологическая характеристика записанные клеток после гистохимические откровение6,,78,9, 10. это очень полезный метод для классификации типов нейронов, на основе многофакторного анализа их фенотипических признаков5,9,10,11,12 ,,1314. Одна ячейка мультиплексной ПЦР-также подходит для характеризации не нейрональных клеток, таких как астроциты15,16,17и может применяться практически каждый мозг структуры18, 19,20,21,22,23 и ячейки типа, предполагая, они могут быть записаны в целом ячейки конфигурации.

Этот метод очень удобен для выявления клеточных источников и/или цели передачи систем7,8,,1516,20,21, 24,25,26,27,28, особенно, когда отсутствуют специфические антитела. Он опирается на патч зажим записи от визуально выявленных клетки29и таким образом также позволяет ориентации клетки в конкретной клеточной среды8,,1516. Кроме того так как cytoarchitecture ткани мозга сохраняется в срезах головного мозга, этот подход также позволяет исследования анатомических отношений характеризуется клеток с нейронов и не нейрональных элементы7,8 , 18.

Поскольку этот метод является ограниченное количество собранного цитоплазмой и эффективности RT, обнаружение мРНК, выраженные на низких копии номер может быть затруднено. Хотя другие подходы, основанные на RNaseq технологии позволяют анализировать весь транскриптом одиночных клеток3,4,30,31, они не обязательно дорогим секвенсоров высок объём доступны для каждой лаборатории. Так как одну ячейку мультиплексной ПЦР-техника использует конечную точку PCR, он только требует thermocyclers широко доступны. Это могут быть легко разработаны в лабораториях, оснащенных электрофизиологических установок и не требует дорогостоящего оборудования. В течение одного дня, она может обеспечить качественный анализ выражения предопределенный набор генов. Таким образом этот подход предлагает легкий доступ к молекулярная характеристика одиночных клеток в быстрой манере.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры с использованием животных были выполнены в строгом соответствии с положениями французского (код сельских R214/87-до R214/130) и соответствует этические руководящие принципы Европейского экономического сообщества (86/609/EEC) и французской национальной хартии по этике экспериментов на животных. Все протоколы были утверждены Комитетом по этике Чарльз Дарвин и представлен в Министерство образования и научных исследований (утверждение 2015 061011367540) Франции. IBPS животных центр аккредитован французскими властями (A75-05-24).

1. предварительные соображения

Примечание: Чтобы избежать загрязнений, соответствуют следующие рекомендации до проведения одной ячейки ПЦР-после патч зажим.

  1. Не используйте плазмид, содержащие гены интереса в лаборатории, как они являются потенциальным источником загрязнения.
  2. Резерв лаборатории скамейке от зале электрофореза геля подготовить PCR.
  3. Выделите набор пипетки и устойчивостью аэрозоля фильтр советы для манипулирования ДНК и РНК при концентрациях менее 1 нг/мкл. Никогда не использовать их для анализа продуктов PCR.
  4. Всегда используйте РНКазы - и DNase бесплатных продуктов и носить перчатки.
  5. Используйте выделенный химикаты для подготовки решения внутренней фиксации. Никогда не используйте шпатель, но скорее весом бумаги для взвешивания порошков.
  6. Используйте выделенный рН электрода и рН стандартные решения, как они могут быть источником загрязнения (например, RNase).
  7. Хранить боросиликатного стекла капилляров; 20 мкл длинные, тонкой и гибкие советы; 20 мкл микропипеткой; самодельные экспеллер (патч зажим пипеткой держатель придает шприц 10 мл); 500 мкл ПЦР пробирок; 10 мкл аэрозоля устойчивостью фильтр советы; и тонкие перманентные маркеры в поле выделенные (рис. 1).

2. грунтовка дизайн

Примечание: Мультиплексной ПЦР-опирается на два шага амплификации. Во время первого PCR все гены интереса совместно размножаются путем смешивания вместе все праймеры PCR. Для обнаружения надежно транскрипты от единичных клеток, важно для разработки эффективных и селективного праймеры PCR. Использование вложенных (внутренний) грунты для второго раунда ПЦР улучшает как специфический, так и эффективности амплификации.

  1. Извлечь куратор последовательностями мРНК генов интерес к последовательности данных NCBI32 , а также их соответствующие семьи (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Введите имя gene(s) и видов интерес как запрос и нажмите на Проверено соответствующей последовательности.
    2. Чтобы ограничить анализ кодирующая последовательность gene(s), нажмите на Отправить (в правом верхнем углу) и выберите в качестве формата кодирования последовательностей и FASTA нуклеотидов . Затем нажмите на Создать файл и сохранить последовательность FASTA, используя расширение файла «.nt».
  2. Использование Ара программного обеспечения33 (несколько выравнивания строительство & анализ Workbench) или любого другого несколько выравнивания программного обеспечения для определения регионов гомологии.
    1. Нажмите на файл | Новый проект... и выберите тип последовательности ДНК . Чтобы импортировать последовательности гена, выберите последовательности | Импортировать последовательность... и загрузки файла «.nt». Повторите эту процедуру для всех связанных последовательностей.
    2. Щелкните и перетащите все последовательности в окне схема для выбора всей последовательности.
    3. Поиск в регионах гомологии, выбрав Выравнивание | Поиск блоков... (CTRL + S). Выберите сегмент пара перекрываются в Методе поиска. Отрегулируйте Pairwise Оценка среза относительно высокое значение (например, 1000) и мин seqs. на блок на общее количество последовательностей для выравнивания и нажмите кнопку начать.
    4. В появившемся окне Результатов поиска выберите результаты с высокий балл MP и нажмите на ссылку. Если результат не будет найден, уменьшение Pairwise Оценка среза и/или мин seqs. на блок.
    5. Для облегчения визуализации гомологичных регионов, выберите Выравнивание | Затенение | Значит, оценка.
    6. Выберите несвязанные части последовательности и повторите шаги 2.2.3–2.2.4 потенциально определить другие регионы гомологии с нижней MP-оценка.
    7. Для получения наиболее специфические праймеры, выберите регионы с наименее гомологию последовательностей.
  3. Fetch последовательности всех вариантов сращивания и повторите шаги 2.2.1–2.2.6. Выбор их общих областей для общего обнаружения. Рассмотрим альтернативные кассеты для выделенный соединитель варианты анализа20,34,35,36.
  4. Выровняйте последовательностями мРНК по геному животных моделей, с помощью взрыва37 геномов (основной инструмент поиска местных выравнивание) для определения структуры Интрон экзона генов (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Выберите геноме мыши ДОМЕННАЯ, щелкнув мышью и загрузить проверено FASTA последовательность в разделе Ввод последовательности запроса . Выбор программывыберите оптимизировать для очень похожие последовательности (Мегавзрыв), а затем нажмите на кнопку взрыва .
    2. В разделе описания выберите выравнивание с высоким личность (до 100%). Убедитесь, что он соответствует гена интереса, как указано в особенности выравнивания раздела.
    3. Сортировать выравнивание путем запроса стартовую позицию в том же разделе для получения последовательности экзонов последовательности кодирования. Обратите внимание на начальную и конечную позиции всех хитов, которые примерно соответствуют позиции интронов на запрос последовательности (рис. 2A).
  5. Выберите два разных экзонов для чувства и antisense грунты легко дифференцировать cDNA от геномной амплификации ДНК (геномная ДНК), на основе критерия размера (рис. 2).
    Примечание: Амплификации геномная ДНК может произойти на низкой частоте, когда ядро собрано с цитоплазмой. Таким образом крайне важно разработать Интрон overspanning грунтовка пар (рис. 2A). В случае Интрон меньше генов коллекции ядра проблематично, поскольку это может привести к потенциально смешанные результаты. Для решения этой проблемы, включают в себя набор грунты, направленных на усиление intronic последовательности для проверки на наличие геномная ДНК25. Если геномной управления является положительным, результаты для всех генов Интрон менее следует отказаться.
  6. Для достижения эффективной амплификации, выберите грунтовки генерации ампликонов с длиной идеально состоит между 200 и 400 пар оснований (рис. 2).
  7. Для того чтобы усилить одновременно различные cDNAs этапе мультиплексной ПЦР, Дизайн грунты с длиной между 18 и 24 нуклеотидов и температурой плавления (Tm) между 55 и 60 ° C.
  8. Чтобы свести к минимуму образование вторичных структур, которые снижают урожайность амплификации, выберите смысл и анти чувство грунты с минимальными шпильки и дуплекс длины (рис. 2B).
  9. Дизайн внутреннего грунты, используя те же критерии (шаги 2,5-2,8).
  10. Проверка специфичности ПЦР праймеры, совместив грунтовки на базе последовательности РНК ссылка из организма с помощью нуклеотидов взрыв интереса.
    1. В результате взрыва (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) нажмите на нуклеотид взрыва. Вставьте последовательность праймера в Введите последовательность запросов.
    2. В разделе Выберите Поиск набор нажмите на других (nr и т.д.), выберите ссылку РНК последовательности (refseq_rna) в параметр базы данных и укажите организма (например, Mus musculus (taxid:10090) ) для ограничения анализа желаемый вид.
    3. В Выбор программы выберите оптимизировать для несколько аналогичных последовательностей (blastn). В разделе Параметры алгоритма уменьшите Размер слова до 7 увеличить шанс получить хиты.
  11. Для разработки избирательного грунты, храните только те, чьи последовательность имеет по крайней мере 3 несоответствия с нежелательным cDNAs, когда это возможно.
  12. Закажите обессоленной грунтовки в относительно высокой концентрацией (например, 200 мкм), чтобы обеспечить, что все внешние грунты могут быть смешаны вместе в конечной концентрации 1 мкм.

3. Подготовка реагентов RT

  1. 5 x RT-микс: подготовить в РНКазы свободной воды 400 мкл рабочего раствора смеси RT (5 x), содержащий случайных праймеров на 25 мкм и дНТФ на 2,5 мм. Сохранить эту рабочую смесь как 20 мкл аликвоты в 500 мкл трубы.
  2. 20 x Дитиотреитол (DTT): подготовка 1 мл 0,2 М DTT в РНКазы свободной воды и сохранять его как 50 мкл аликвоты.
  3. Хранить как 5 мкл аликвоты 2500 U АБС битор РНКазы (40 U/мкл) и 10,000 U обратной транскриптазы (RTase, 200 U/мкл).
  4. Для обеспечения оптимального качества RT реагентов, храните аликвоты-80 ° c. Используйте их для до 10 клеток и только на один день.

4. ПЦР проверка

  1. Подготовьте cDNAs, делая обратной транскрипции на относительно большой объем всего РНК (обычно 1 мкг) извлечено38 из структуры интереса.
    1. Не используйте пипетки выделенный для одной ячейки ПЦР-для этих предварительных шагов, но использовать пипетки РНКазы бесплатно. Разбавьте всего РНК до 1 мкг/мкл.
    2. В 500 мкл ПЦР-пробирку добавьте 1 мкл разбавленного всего РНК и 8 мкл РНКазы свободной воды. Денатурируйте при 95 ° C за 1 мин и охладить вниз по трубе на льду.
    3. Добавить 4 мкл буфера 5 x RT, поставляемый изготовителем, 4 мкл раствора смеси RT, 1 мкл RTase, 1 мкл АБС битор РНКазы и 1 мкл 200 мм DTT (см. раздел 3).
    4. Флик трубки, спина его и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    5. Храните cDNAs на-80 ° C до нескольких лет. Подготовьте Алиготе cDNAs разбавляют до 1 нг/мкл всего RNAs эквивалентов.
  2. Смешать и разбавляют пипетки, посвященный одной ячейки ПЦР-каждой пары праймера на 1 мкм. Используйте 20 мкл каждого праймера смеси для 100 мкл ГКДЗ.
  3. На льду, подготовить для каждой пары праймера премикс, содержащий: вода (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 X буфер, 1 мкл 100 x dNTPs (50 мкм каждый), 500 – 1000 pg cDNA разводят в 1 нг/мкл и 0,5 мкл (2,5 U, 5 U/мкл) полимеразы Taq.
  4. Использование ПЦР трубы, которые плотно подходят скважин ПЦР машины для элемента оптимальной температуры. Добавьте 2 капли (~ 100 мкл) минерального масла на премикс, не касаясь стены или крышка ПЦР-пробирку.
  5. Чтобы свести к минимуму образование грунт димеры, выполните горячий старт, поместив ПЦР трубы в Термоциклер, разогретую на 95 ° C. После 30 сек, быстро высылать 20 мкл грунтовка смесь на вершине нефти.
  6. После 3 минут при 95 ° C, запустить 40 циклов (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) последовал последний удлинение шаг в 72 ° C за 5 мин.
  7. Анализировать 10 мкл каждого продуктов ПЦР агарозы gel электрофорез (2%, вес/объем)39. Если некоторые продукты PCR не имеет ожидаемый размер, ре-дизайн другой грунтовки (см. раздел 2).
    Предупреждение: Бромид Ethidium — интеркалирующего химическое вещество, которое может вызвать мутации ДНК. Проконсультироваться с управлением безопасности перед его использованием. Всегда надевайте перчатки при его обработке. Используйте коммерчески доступных решение ethidium бромид (10 мг/мл) раствора вместо порошка для сведения к минимуму риска ингаляции. Аналогично УФ-излучения может быть вредным, поэтому убедитесь, что носить защитные очки УФ-защиты или маску. Снять загрязненную гели, советы, перчатки и буфер в контейнерах, посвященный ethidium отходов.
  8. После того, как все пары праймера индивидуально проверена, испытания мультиплекс протокол (рис. 3).
    1. Смешать и разбавленных все внешние грунтовки вместе на 1 µM. магазине мультиплекс грунтовки смешивают при-20 ° C до нескольких недель.
    2. На льду, подготовить премикс, содержащий: вода (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 X буфер, 1 мкл 100 x dNTPs (50 мкм каждого), 500 – 1000 pg cDNAs разводят в 1 нг/мкл и 0,5 мкл (2,5 U, 5 U/мкл) полимеразы Taq.
    3. Флик ПЦР-пробирку, спина его и добавить две капли (~ 100 мкл) минерального масла.
    4. Выполните горячий старт, как описано в шаге 4.5 с 20 мкл мультиплекс грунтовка смеси. После 3 минут при 95 ° C запустите 20 циклов PCR идентичны шаг 4.6.
    5. Подготовьте ряд ПЦР трубок идентичен количество генов для анализа. Подготовьте премикс как шаг 4.8.2, но с использованием 1 мкл первого продукта ПЦР на ген как шаблон. Настройте все тома по данным количество генов, чтобы проанализировать и рассмотреть возможность использования 10% от объема дополнительной компенсации для дозирования ошибок.
    6. Слегка встряхните, спина трубки, направить 80 мкл премиксов в каждую ПЦР-пробирку и добавить две капли (~ 100 мкл) минерального масла на трубки не касаясь стены или крышка трубки.
    7. Выполнить горячего запуска (см. шаг 4.5) высылающего 20 мкл внутренних грунтовка смеси подготовлен на шаге 4.2. Выполните 35 циклов PCR идентичны к шагу 4.6.
    8. Анализ второй продукты PCR электрофорезом геля агарозы. Убедитесь, что каждый второй ПЦР генерирует ампликон ожидаемого размера. В случае неэффективного или неспецифических амплификаций, ре-дизайн новой грунтовки (шаги 2,5 – 2.12) и проверять их (шаги 4.2 – 4,8).

5. Подготовка и проверка решения внутриклеточных патч зажим

Примечание: Следующий протокол описывается подготовка и проверка K+/gluconate на основе внутреннего решения, но практически любой тип патч зажим решения может использоваться до тех пор, пока это не препятствует эффективности RT-PCR. Перчатки является обязательным для получения свободных РНКазы внутреннего решения.

  1. Для 60 мл раствора внутренней фиксации записи Подготовьте экспромтом 10 мл 0,1 м Кох.
  2. Растворите 11.4 мг EGTA (0,5 мм окончательный) в 0,9 мл 0,1 М Кох.
  3. Добавить бесплатно РНКазы 40 мл воды и распустить 2.02 g K-глюконат (окончательный 144 мм), 143 мг HEPES (последний 10 мм) и 180 мкл 1 М MgCl2 (окончательный 3 мм).
  4. Регулировка рН 7,2, добавив ~ 6 мл 0,1 м Кох.
  5. Отрегулируйте осмолярности до 295 мОсм ~ 13 мл РНКазы свободной воды.
  6. Поскольку внутреннее решение также используется в качестве буфера для обратной транскрипции, тщательно контролировать мг2 + концентрации. Компенсировать низкой мг2 + концентрации в решении внутреннего путем добавления2 MgCl потом, чтобы добраться до конечной концентрации 2 мм в RT реакции.
  7. Для обозначения заготовленных клеток после фиксации записи, добавьте 2-5 мг/мл РНКазы свободный biocytin внутреннее решение, описанные выше (шаги 5.1 – 5.5).
  8. Фильтр (размером пор 0,22 мкм) внутреннего решения и храните его при температуре-80 ° C как 100-250 мкл аликвоты.
  9. Для проверки использования внутреннего решения для одной ячейки RT-PCR, 0.5 мкл всего РНК, разводят в 1 нг/мкл до 6 мкл раствора патч зажим и оставить его на скамейке около 30 мин.
  10. С 2 мкл микропипеткой, добавить 2 мкл 5 x RT-микс, 0.5 мкл 20 x ДДТ, 0.5 АБС битор РНКазы мкл и 0,5 мкл RTase и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  11. Вращайте трубу. На льду добавьте воду (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 X буфер и 0,5 мкл (2,5 U, 5 U/мкл) полимеразы Taq.
  12. Выполните 40 циклов PCR с помощью набора проверенных грунтовки (шаги 4.4 – 4.6).
  13. Анализ продуктов ПЦР электрофорезом геля агарозы (см. шаг 4.7) и убедитесь, что они имеют ожидаемый размер.
    Примечание: Пропуск 0.5 мкл всего РНК и заменив его 0.5 мкл РНКазы свободной воды обеспечит, что внутреннее решение является свободной от загрязнений РНК и ДНК.

6. острый срез подготовка

Примечание: Этот протокол описывает нарезки процедуры для несовершеннолетних (то есть, менее 28 дней послеродового) Мужские и женские мышей. Другие решения резки, например на основе сахарозы искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) являются также использоваться40.

  1. Приготовить 2 Л фаго, содержащую (в мм) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 глюкозы и 15 сахарозы. Чтобы уменьшить глутаматергические активности во время подготовки срез, приготовляют раствор резки, добавив 1 мм Кинуреновая кислота.
  2. До нарезки, подготовьте рассечение комплект, содержащий хирургические ножницы, ножницы штраф Ирис, две лопатки, щипцы, диск бумажный фильтр и Цианакрилатный клей.
  3. Используйте ледяной резки раствор, насыщенный O2/CO2 (95% / 5%) и охлаждения режущей камеры при-20 ° C.
  4. Анестезировать мыши небольшой бумажной салфеткой, смоченной изофлюрановая. После ~ 2 мин убедитесь, что указатель мыши находится под глубокой анестезии, проверяя отсутствие ответа на лапу щепотку.
  5. Быстро обезглавить мышь. Удалите головы и открыть черепа. Осторожно извлеките мозга и поместите его в небольшой стакан, наполненный ледяной (~ 4 ° C) резки раствор кислородом с O2/CO2.
  6. Удалите режущей камеры от условий-20 ° C и влажности с бумажным полотенцем.
  7. Тщательно анализировать мозг, чтобы изолировать области интереса, приклейте его на режущей камеры и добавить решение ледяной Резка кислородом с O2/CO2.
  8. Вырежьте 300 мкм толстые ломтики с помощью vibratome. Передача их при комнатной температуре в камере покоя, наполненный кислородом резки решения и дать им возможность восстановить для по крайней мере 0,5 ч.

7. одной ячейки ПЦР-после записи патч зажим

  1. Очистить перфузии системы регулярно с ~ 100 мл 30% H2O2 решения и сполосните широко ~ 500 мл дистиллированной воды, чтобы избежать роста бактерий, как это забывают источником загрязнения РНКазы.
  2. Хлорирование накаливания с патч пипетки, заполнены с концентрированной отбеливатель уборочной каждый день. Не используйте микропипеткой для заполнения пипеткой патч, но скорее 20 мкл длинные, штраф, гибкий наконечник прилагается к 1 мл шприц. Затем промойте его широко РНКазы бесплатную воду и насухо тряпкой газа.
  3. Подготовьте небольшую коробку льда, содержащих 5 x 20 x DTT аликвоты и RT-микс. Магазин RTase и РНКазы ингибитор аликвоты при-20 ° C в benchtop прохладнее.
  4. Передача ломтик в записи камеру увлажненную на 1 – 2 мл/мин с кислородом фаго.
  5. Вытяните патч пипетки (1 – 2 мкм открыть диаметра кончика, 3-5 MΩ) из боросиликатного стекла при ношении перчатки и заполнить один из них с 8 мкл внутреннего решения. Имейте в виду, что ручки пулера тележки пипеткой являются источником загрязнения РНКазы.
  6. Поместите пипеткой в пипетку держатель во время новых перчатках и не касаясь накаливания с пальцами.
  7. Подход патч пипетку с положительным давлением и выполнять запись поклеточного характеризовать целевых клеток (рис. 4).
  8. Чтобы сохранить мРНК, ограничивайте время, в целом ячейки конфигурации до 20 мин41.
  9. В конце записи, подготовить 500 мкл ПЦР-пробирку заполнены с 2 мкл 5 x RT Mix 0.5 мкл 20 x DTT, спина его и хранить его на льду.
  10. Урожай в цитоплазму клетки путем применения нежный отрицательного давления (рис. 4). Визуально управления, что содержимое ячейки приходит внутри пипеткой при сохранении герметичное уплотнение.
    1. Избегайте как можно больше собирать ядро, если некоторые гены Интрон менее считаются. В таком случае всегда включайте набор праймеров, направленных на усилительных геномная ДНК для геномной загрязнения.
    2. Если ядро приближается к кончиком пипетки, отпустите отрицательное давление и переместите пипетку от ядра. Обеспечить сохранение герметичности и перезапустите собирать в цитоплазму на новом месте пипеткой.
  11. Остановите сбор когда идет не больше материала и/или до потери герметичности.
  12. Снять пипеткой нежно сформировать вне из патч ограничить загрязнение, внеклеточная мусора (Рисунок 4) и в пользу закрытие клеточной мембраны для последующего гистохимический анализ.
  13. Имейте в виду, что ручки, микроманипуляторы, клавиатуры компьютера, или компьютерной мыши являются потенциальными источниками загрязнения РНКазы. Если они были затронуты во время записи, измените перчатки.
  14. Придавать экспеллер пипетки и изгнать его содержание в ПЦР-пробирку, применяя положительное давление (рис. 1).
  15. Разбейте кончиком пипетки ПЦР-пробирку для коллекции его содержание.
  16. Кратко центрифуга трубки, добавить 0,5 мкл битор РНКазы и 0,5 мкл RTase, осторожно перемешать, центрифуга снова и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  17. Спина трубки и хранить его на-80 ° C до несколько месяцев до ПЦР анализа.
  18. Выполните первый шаг амплификации непосредственно в пробирку, содержащую ~ 10 мкл RT продуктов путем добавления воды (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 x буфер и 0,5 мкл (2,5 U) полимеразы Taq. Затем следуйте инструкциям, описанным в шагах 4.8.2–4.8.8.

8. гистохимические пятнать записанные ячейки (опционально)

  1. После электрофизиологических записи поддерживать срез для 20 мин в насыщенной кислородом фаго разрешить распространение biocytin в дереве аксональное и дендритных.
  2. Место среза в хорошо 24-ну пластины и исправить его на ночь при 4 ° C с 1 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера.
  3. Вымойте ломтики 4 раза, 5 минут каждый, с 1 мл Фосфатный Buffered (PBS).
  4. В том же хорошо, разрушения и насыщают среза в течение 1 ч при комнатной температуре с 1 мл раствора PBS с 0,25% Тритон X-100 и 0,2% желатина из холодной воды рыба кожи (PBS-GT).
  5. Инкубируйте на ночь с дневно обозначенные авидин разбавлять на 1/400 в 250 – 500 мкл PBS-GT.
  6. Мыть 5 раз, 5 минут каждая, с 1 мл раствора PBS и смонтировать ломтики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представитель проверки мультиплексной ПЦР-это показано на рисунке 3. Протокол был разработан одновременно зонда выражение 12 различных генов. Глутамата Везикулярный транспортер vGluT1 было принято как позитивный элемент управления для глутаматергические нейронов42. ГАМК синтеза ферментов (GAD65 и GAD 67), нейропептида Y (NPY) и соматостатина (SOM) были использованы в качестве маркеров ГАМК интернейронов3,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одной ячейке мультиплексной ПЦР-после того, как патч зажим можно одновременно и надежно зонд выражение более чем 30 генов в клетки electrophysiologically выявленных5. Анализ экспрессии генов на уровне отдельной ячейки требует высокоэффективных праймеры PCR. Одним из наиболее ограничивающим шагов является сбор содержимого ячейки. Его эффективность зависит от диаметра кончика пипетки патч, который должен быть максимально сопоставления размера ячейки. Пипетки с открытым наконечником диаметром 1-2 мкм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р Александр Mourot за его замечания по рукописи. Эта работа была поддержана от грантов от Agence Nationale de la Recherche (НРУ 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 и АНР-17-CE37-0010-03), BLG поддерживается стипендий от Fondation pour la Recherche sur Альцгеймера. Мы благодарим животных фонда IBPS (Париж, Франция).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MACAW v.2.0.5NCBIМножественное выравнивание для дизайна праймеров
DithiothreitolVWR443852A
RT Случайные праймерыSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT и ПЦР
РНКазин Ингибиторы рибонуклеазыPromegaN2511RT
SuperScript II обратная транскриптазаинвитроген18064014RT
Taq ДНК-полимеразаQiagen201205ПЦР
минеральное маслоSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLПЦР ПЦР
праймерыSigma-Aldrich (Merck)ПЦР / обессоленные и разведенные при 200 мкм;
Пробирки M, 0,5 мл, плоский колпачокThermoFisher ScientificAB0350RT и PCR
BT10 Series - 10 & микро; L Фильтрующий наконечникNeptune ScientificBT10RT и PCR
серии BT20 - 20 & микро; L Фильтрующий наконечникNeptune ScientificBT20RT и PCR
BT200 серии - 200 & микро; L Фильтрующий наконечникNeptune ScientificBT200RT и PCR
BT1000 серии - 1000 & микро; L Фильтр НаконечникNeptune ScientificBT1000.96RT и ПЦР
ДНК Термический CylcerPerkin Elmer CetusPCR
Бромид этидияSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLЭлектрофорез в агарозном геле
Tris-Borate-EDTA буферSigma-Aldrich (Merck)T4415-1LЭлектрофорез в агарозном геле
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500Электрофорез в агарозном геле&
Phi; X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SЭлектрофорез в агарозном геле
EDA 290KodakЭлектрофорез в агарозном геле
Электрофорез EPS 3500Pharmacia BiotechЭлектрофорез в агарозном геле
Горизонтальный электрофорез Midi Модель SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Электрофорез
в агарозном гелеГладкая бумага с атласным видомFisherbrand1748BПатч-хомут внутренний раствор
Гидроксид калияSigma-Aldrich (Merck)60377Патч-хомут внутренний раствор
Этиленгликоль-бис(2-аминоэтилевый)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислотаSigma-Aldrich (Merck)E3889Патч-хомут внутренний раствор
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Пластырь зажим внутренний раствор
Калия D-глюконатSigma-Aldrich (Merck)G4500Пластырь зажим внутренний раствор
Раствор хлорида магнияSigma-Aldrich (Merck)M1028Пластырь зажим внутренний раствор
5500 Осьмометр давления паровWescorПатчовый зажим внутренний раствор
биоцитинSigma-Aldrich (Merck)B4261Пластырь зажим внутренний раствор
СахарозаSigma-Aldrich (Merck)S5016Препарат для слайса
D-(+)-Глюкоза моногидратSigma-Aldrich (Merck)49159Препарат для слайса
Хлорид натрияSigma-Aldrich (Merck)S6191Препарат для слайса
Хлорид калияSigma-Aldrich (Merck)60128Препарат для слайсов
Бикарбонат натрияSigma-Aldrich (Merck)31437-MПрепарат для слайса
Одноосновной фосфат натрияSigma-Aldrich (Merck)S5011Препарат для слайса
Раствор хлорида магнияSigma-Aldrich (Merck)63069Препарат для слайса
Раствор хлорида кальцияSigma-Aldrich (Merck)21115Препарат
Кинуреновая кислотаSigma-Aldrich (Merck)K3375Препарат для слайса
IsofluranePiramal Healthcare UKПрепарат для слайса
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Препарат для слайса
Раствор перекиси водородаSigma-Aldrich (Merck)H1009Patch Clamp set для очистки
тонкостенных стеклянных капилляров с нитью накалаWorld Precision InstrumentsTW150F-4Патч-хомут
PP-83NarishigeПатч-хоум
Eppendorf MicroloaderЭппендорф5242956003Патч-хомут
BX51WI Вертикальный микроскопOlympusПатч-хомут
XC-ST70/CE CCD Ч/б видеокамераSonyПатч-хоум
Axopatch 200B УсилительМолекулярные приборыПатч-хомут
Digidata 1440Молекулярные приборыПатч-хомут
pCLAMP 10 программный пакетМолекулярные приборыПатч-хомут
10 мл шприцTerumoSS-10ESExpelling
E series с прямым корпусом (держателем)Phymep64-0997Изгнание
двухосновногофосфата натрияSigma-Aldrich (Merck)S7907Гистохимическое раскрытие
Одноосновной фосфат натрияSigma-Aldrich (Merck)S8282Гистохимическое раскрытие
ПараформальдегидSigma-Aldrich (Merck)P6148Гистохимическое раскрытие
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Гистохимическое раскрытие
Желатин из холодноводной кожирыбыSigma-Aldrich (Merck)G7041Гистохимическое открытие
Стрептавидин, Alexa Fluor 488 конъюгатThermoFisher ScientificS11223Гистохимическое открытие
24-луночный планшетGreiner Bio-One662160Гистохимическое раскрытие
для слайса Патч-хомут

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13(2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи