Этот протокол описывает важнейшие шаги и меры предосторожности, необходимые для выполнения одноклеточного мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим. Эта техника является простой и эффективный метод для анализа выражения профиль заранее определенный набор генов из одной клетки характеризуются патч зажим записей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, экспонируется различных морфологических, физиологических и молекулярные особенности. Это разнообразие препятствует простой идентификации и характеристика этих типов клеток, предпосылки для изучения их конкретных функций. Эта статья описывает мультиплекс одной ячейки обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) протокол, который позволяет, после фиксации записи в форме долек, обнаружить одновременно выражение десятки генов в одной ячейке. Этот простой метод может быть реализован с морфологическая характеристика и широко применяется для определения фенотипических признаков различных типов клеток и их конкретной клеточной среды, такие как вблизи кровеносных сосудов. Принцип этот протокол является для записи ячейки с техникой патч зажим, чтобы урожай и обратить вспять транскрибировать его цитоплазматических содержание, и обнаружить качественно выражение предопределенный набор генов мультиплексной ПЦР. Это требует тщательной разработки праймеры PCR и внутриклеточных патч зажим решение, совместимое с RT-PCR. Для обеспечения стенограмме селективный и надежного обнаружения, этот метод также требует надлежащего контроля от цитоплазмы заготовки для усиления действия. Хотя необходимо строго соблюдать правила, обсуждаемых здесь, практически любой электрофизиологической лаборатории можно использовать мультиплекс одну ячейку техника RT-PCR.
Введение
Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, участвующих в различных физиологических процессах. Их определение и характеристика, предварительным условием для понимания их специфических функций, может быть очень сложным ввиду большой морфологических, физиологических и молекулярных разнообразия, что характеризует корковых клеток типы1 ,2,3,4.
Одноклеточных мультиплексной ПЦР-основан на комбинации патч зажим и методов RT-PCR. Она может одновременно зонд выражение более чем 30 предопределенные генов в клет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры с использованием животных были выполнены в строгом соответствии с положениями французского (код сельских R214/87-до R214/130) и соответствует этические руководящие принципы Европейского экономического сообщества (86/609/EEC) и французской национальной хартии по этике экспериментов на животных. Все протоколы были утверждены Комитетом по этике Чарльз Дарвин и представлен в Министерство образования и научных исследований (утверждение 2015 061011367540) Франции. IBPS животных центр аккредитован французскими властями (A75-05-24).
1. предварительные соображения
Примечание: Чтобы избежать з....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представитель проверки мультиплексной ПЦР-это показано на рисунке 3. Протокол был разработан одновременно зонда выражение 12 различных генов. Глутамата Везикулярный транспортер vGluT1 было принято как позитивный элемент управления для глутаматергические нейронов42. ГАМК синтеза ферментов (GAD65 и GAD 67), нейропептида Y (NPY) и соматостатина (SOM) были использованы в качестве маркеров ГАМК интернейронов3,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Одной ячейке мультиплексной ПЦР-после того, как патч зажим можно одновременно и надежно зонд выражение более чем 30 генов в клетки electrophysiologically выявленных5. Анализ экспрессии генов на уровне отдельной ячейки требует высокоэффективных праймеры PCR. Одним из наиболее ограничивающим шагов является сбор содержимого ячейки. Его эффективность зависит от диаметра кончика пипетки патч, который должен быть максимально сопоставления размера ячейки. Пипетки с открытым наконечником диаметром 1-2 мкм.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим д-р Александр Mourot за его замечания по рукописи. Эта работа была поддержана от грантов от Agence Nationale de la Recherche (НРУ 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 и АНР-17-CE37-0010-03), BLG поддерживается стипендий от Fondation pour la Recherche sur Альцгеймера. Мы благодарим животных фонда IBPS (Париж, Франция).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Множественное выравнивание для дизайна праймеров | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | |
| RT Случайные праймеры | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTP | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT и ПЦР |
| РНКазин Ингибиторы рибонуклеазы | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II обратная транскриптаза | инвитроген | 18064014 | RT |
| Taq ДНК-полимераза | Qiagen | 201205 | ПЦР |
| минеральное масло | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | ПЦР ПЦР |
| праймеры | Sigma-Aldrich (Merck) | ПЦР / обессоленные и разведенные при 200 мкм; | |
| Пробирки M, 0,5 мл, плоский колпачок | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT и PCR |
| BT10 Series - 10 & микро; L Фильтрующий наконечник | Neptune Scientific | BT10 | RT и PCR |
| серии BT20 - 20 & микро; L Фильтрующий наконечник | Neptune Scientific | BT20 | RT и PCR |
| BT200 серии - 200 & микро; L Фильтрующий наконечник | Neptune Scientific | BT200 | RT и PCR |
| BT1000 серии - 1000 & микро; L Фильтр Наконечник | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT и ПЦР |
| ДНК Термический Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Бромид этидия | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Электрофорез в агарозном геле |
| Tris-Borate-EDTA буфер | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Электрофорез в агарозном геле |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Электрофорез в агарозном геле& |
| Phi; X174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Электрофорез в агарозном геле |
| EDA 290 | Kodak | Электрофорез в агарозном геле | |
| Электрофорез EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Электрофорез в агарозном геле | |
| Горизонтальный электрофорез Midi Модель SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Электрофорез | |
| в агарозном гелеГладкая бумага с атласным видом | Fisherbrand | 1748B | Патч-хомут внутренний раствор |
| Гидроксид калия | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Патч-хомут внутренний раствор |
| Этиленгликоль-бис(2-аминоэтилевый)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислота | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Патч-хомут внутренний раствор |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Пластырь зажим внутренний раствор |
| Калия D-глюконат | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Пластырь зажим внутренний раствор |
| Раствор хлорида магния | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Пластырь зажим внутренний раствор |
| 5500 Осьмометр давления паров | Wescor | Патчовый зажим внутренний раствор | |
| биоцитин | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Пластырь зажим внутренний раствор |
| Сахароза | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Препарат для слайса |
| D-(+)-Глюкоза моногидрат | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Препарат для слайса |
| Хлорид натрия | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Препарат для слайса |
| Хлорид калия | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Препарат для слайсов |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Препарат для слайса |
| Одноосновной фосфат натрия | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Препарат для слайса |
| Раствор хлорида магния | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Препарат для слайса |
| Раствор хлорида кальция | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Препарат |
| Кинуреновая кислота | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Препарат для слайса |
| Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Препарат для слайса | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Препарат для слайса |
| Раствор перекиси водорода | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set для очистки |
| тонкостенных стеклянных капилляров с нитью накала | World Precision Instruments | TW150F-4 | Патч-хомут |
| PP-83 | Narishige | Патч-хоум | |
| Eppendorf Microloader | Эппендорф | 5242956003 | Патч-хомут |
| BX51WI Вертикальный микроскоп | Olympus | Патч-хомут | |
| XC-ST70/CE CCD Ч/б видеокамера | Sony | Патч-хоум | |
| Axopatch 200B Усилитель | Молекулярные приборы | Патч-хомут | |
| Digidata 1440 | Молекулярные приборы | Патч-хомут | |
| pCLAMP 10 программный пакет | Молекулярные приборы | Патч-хомут | |
| 10 мл шприц | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E series с прямым корпусом (держателем) | Phymep | 64-0997 | Изгнание |
| двухосновного | фосфата натрияSigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Гистохимическое раскрытие |
| Одноосновной фосфат натрия | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Гистохимическое раскрытие |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Гистохимическое раскрытие |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Гистохимическое раскрытие |
| Желатин из холодноводной кожи | рыбыSigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Гистохимическое открытие |
| Стрептавидин, Alexa Fluor 488 конъюгат | ThermoFisher Scientific | S11223 | Гистохимическое открытие |
| 24-луночный планшет | Greiner Bio-One | 662160 | Гистохимическое раскрытие |
Ссылки
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the class....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
