Расследование Teliospore прорастания с использованием Microrespiration анализа и Microdissection

Краткое содержание

Головне грибки вызывают много разрушительных сельскохозяйственных болезней. Они разбросаны как неактивных teliospores, которые прорастают в ответ на экологические сигналы. Мы приводим два метода для изучения молекулярных изменений во время проращивания: увеличение дыхание для выявления метаболических активации и оценки изменения молекулярные события, изолируя teliospores на различных этапах морфологических.

Аннотация

Головне грибы являются этиологические агенты нескольких разрушительных сельскохозяйственных болезней. Они характеризуются производства teliospores, которые являются агентами толстостенные разгон. Teliospores может оставаться покоя на протяжении десятилетий. Покоя характеризуется низким метаболизма, приостановлена макромолекулярных биосинтез и значительно сократить уровни дыхания. После получения необходимых экологических сигналов, teliospores прорастают производить haploid клетки, которые могут инициировать новых раундов инфекции. Teliospore всхожесть характеризуется возобновление макромолекулярных биосинтез, увеличение дыхания и драматические морфологические изменения. Для того, чтобы точно измерить изменения в клеточное дыхание на ранних этапах всхожесть, мы разработали простой протокол, используя Кларк тип респирометра. На более поздних этапах прорастания отличаются конкретные морфологические изменения, но всхожесть является асинхронным. Мы разработали microdissection технику, которая позволяет нам собирать teliospores на прорастание отдельных этапах.

Введение

Головне грибов (Ustilaginales) состоят из более 1600 видов, которые заражают трав, включая важные зерновых, кукурузы, ячменя и пшеницы, вызывая миллиарды долларов потерь урожая ежегодно¹. Эти грибы характеризуются производства teliospores, которые загадочно пигментированные клеточной стенки и рассеивания агентов. Teliospores функция, чтобы оградить генетический материал во время стрессов разгон между растений-хозяев и могут сохраняться в неактивное состояние на²лет. Таким образом teliospores являются важным компонентом распространения болезни.

С целью изучения биологии teliospore, наша лаборатория использует модель головне гриб пузырчатая maydis (U. maydis), который является возбудителя болезни «общие головня кукурузы». Зрелые U. maydis teliospores характеризуются арест роста, сокращение клеточный метаболизм и низкий уровень клеточного дыхания³. В благоприятные экологические условия (например., наличие конкретных сахаров), U. maydis teliospores прорастают и полное мейоз, производство basidiospores, которые могут инициировать новых раундов инфекции. Всхожесть характеризуется повышенной дыхания, возвращение к метаболической активности и прогрессии через наблюдаемых морфологической стадии прорастания⁴.

На начальном этапе прорастания включает в себя увеличение дыхание и метаболические функции, однако, есть нет морфологических признаков перемен. Оригинальные измерения дыхания изменения в U. maydis были проведены более 50 лет назад, измерение потребления кислорода manometrically с Варбург колбу аппарат⁵. Мы разработали новый, простой метод изучения точные изменения дыхания при прорастании teliospore путем измерения потребления кислорода в течение времени прорастания с помощью Кларк типа microrespirometer. Ранее мы использовали этот метод для изучения изменения частоты дыхания между одичал типа U. maydis haploid клетки и мутанты с дефектных митохондрий⁶и адаптировали протокол здесь изучить изменения в teliospore дыхания во время всхожесть. Это обеспечивает средства точного определения сроков изменения дыхания, так что мы можем целевых teliospores в соответствующее время после начала прорастания расследовать раннего молекулярных событий. Прогрессирование прорастания может следовать микроскопически после promycelia вытекает из teliospore, но асинхронной природы тормозится изоляции достаточно teliospores на данном этапе расследования. Мы разработали технику microdissection, аналогичные тем, которые используются для оплодотворения в пробирке собрать физически teliospores в различные морфологические стадии прорастания.

Протокол

1. кукурузного початка инфекции

1. Расти Zea mays (cv. Золотой петух) до тех пор, пока початков формируются и начали шелка (приблизительно 60 дней).
2. Культура совместимый гаплоидным U. maydis штаммов, используя стандартные протоколы, как ранее описанных⁷.
3. Заразить початков кукурузы, используя стандартные протоколы, как описано выше⁷.

2. teliospore уборки

1. Автоклав оборудование (воронки Бюхнера, колбы Бюхнера, блендеры, 250 мл бутылки центрифуги, плоские лопатки и воды) с использованием стандарта сухой цикл с по крайней мере 30 минут стерилизации при температуре 121 ° C (стандартные жидкости цикл для воды).
2. Удаление зараженных початков от растений (приблизительно 28-35 дней поста инфекции) с помощью бритвы и задайте початков на подносе в скамейке протектор.
3. Удаление опухолей из початки с лезвием бритвы и собирать в стакан.
4. Заполнить 250 мл чашка Лаборатория блендер с опухолями до приблизительно 1/3 полного и добавить газобетона dH₂O до тех пор, пока блендер Кубок составляет примерно 3/4 полной. Срывать опухолей, пульсирующий блендер на низком уровне, до гомогенизированный.
5. Подключение вакуумного насоса вода ловушку, а затем колбу Бюхнера 1 Л.
6. Вставка большого воронка Бюхнера в колбу и линии нижней воронка Бюхнера с четырьмя слоями Марли.
7. Включите вакуумный насос.
8. Залейте часть гомогенизированные опухоли через марлю и скрести шпателем.
9. Залейте некоторые dH₂O в марлю для того, чтобы очистить teliospores через.
10. Повторите, пока dH₂O сквозь марлю ясно.
11. Отжимают марлю, содержащие материал гомогенизированные опухоли в фильтр для обеспечения максимальной teliospore восстановления.
12. Когда настой Бюхнера 1 Л становится ближе к полный, вылейте его в большой колбу Эрленмейера и отложите его в сторону.
13. Поставьте новый кусок Марли в фильтр и повторите шаги (2.7-2.12) пока не нарушается и фильтруют все опухолей.
14. Налить отфильтрованной teliospores в газобетона 250 мл бутылки центрифуги и центрифуги на 1000 x g 5 минут и сцеживаться супернатант.
15. Повторите шаг 2.14 до тех пор, пока все отфильтрованные teliospores гранулированных центрифугированием.
16. Приостановите гранулы в небольшом количестве воды и передачи 50 мл пробирок.
17. Центрифуга трубы на 1000 x g 5 минут и сцеживаться супернатант.
18. Приостановить гранулы в приблизительно 50 мл dH₂O, центрифуга трубы на 1000 x g 5 мин и сцеживаться супернатант. Аккуратно соскребите серый верхний слой с помощью шпателя и распоряжаться им. Повторяйте до тех пор, пока существует больше не серый слой сверху.
19. Сухой образцы ночь в вакуумный сушильный шкаф.
20. Храните сушеные teliospores при температуре 4 ° C до использования.
21. При желании, лечить teliospores с медного купороса⁸ перед склонение к прорастанию. Если не лечить, то выполните тщательный анализ микроскопических teliospores для подтверждения образец представляет собой чисто teliospores и лишена бактериального или других загрязнений.
    1. Весят из примерно 50 мг teliospores в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Добавьте примерно 1,0 мл 0,75% CuSO₄ пробки microcentrifuge 1,5 мл, содержащие teliospores. Пипетка вверх и вниз, чтобы приостановить teliospores в растворе₄ CuSO, следуют агитацию в образце для 3 h.
    3. Центрифуга для образца на 2500 x g 5 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте teliospore Пелле стерильной водой, повторить центрифугирования и удалить супернатант.
    4. Повторите шаг 2.21.3 еще два раза.

3. teliospore жизнеспособность и всхожесть теста

1. Весят около 10 мг U. maydis teliospores в 1,5 мл microcentrifuge трубки для оценки их жизнеспособность и времени прорастания.
2. В области биобезопасности кабинета Подготовьте картофеля декстроза бульон (PDB, 24 г/Л) дополнены Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл).
3. Приостановите teliospores в 500 мкл PDB. Аккуратно Пипетка смешивать и разрушить все кусты teliospores.
4. Передача teliospore подвеска для газобетона 250 мл колбу Эрленмейера, содержащие 10 мл PDB.
5. Инкубируйте колбу на 28 ° C, тряски на 90 об/мин для 12 – 16 ч.
6. В области биобезопасности кабинета удалите 20 мкл пример teliospores, индуцированной прорастают и подготовить микроскопа.
7. С помощью микроскопа, визуально оценить стадии прорастания, которые присутствуют и наличие бактериального загрязнения.
   1. Подсчитать количество teliospores на этапов I-V с помощью Горяева и определить процент, проросшие.
   2. Если только этап I teliospores присутствуют, продолжать инкубировать Фляга для в общей сложности 24 ч до оценки всхожести teliospore. Продолжать инкубации максимум 48 часов перед учитывание образца нежизнеспособным.
   3. Если присутствует бактериального загрязнения, дополнение PDB с сульфатом канамицин (50 мкг/мл), а также Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл), а затем повторите шаги 3.1 до 3,7. Если сохраняется бактериального загрязнения, лечить teliospores с медного купороса и повторите шаги 3.1 до 3,7.

4. индукция Проращивание для контроля дыхания

1. Вешу столько же (например., 50 мг) в teliospores для каждого эксперимента дыхания.
2. В области биобезопасности кабинета добавьте teliospores камеру газобетона дыхания.
3. Заполните в камеру с PDB (24 г/Л) дополнены Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл) и канамицин сульфат (50 мкг/мл).
4. Пипетка вверх и вниз, чтобы создать teliospore подвеска.
5. Поместите крышку камеры в камере для создания герметичность уплотнения.

5. получение измерений скорость (OCR) потребление кислорода

1. Место в палате в стойки камеры внутри на водяной бане (разогретую до 28 ° C).
2. Место зонд₂ O внутри открытия камеры.
3. Мониторинг точки данных, появляются в режиме реального времени на программе «SensorTrace курс» и пусть зонд стабилизации (~ 3 мин после того, как зонд находится в камере).
4. Нажмите кнопку «Мера» для измерения уровней₂ O непрерывно в течение 6 ч с измерениями, записанная интервалом 2 s.
5. Остановить измерение и повторить шаги 4.1 – 5.4 для каждой выборки для анализа.
6. Экспортировать данные в Microsoft Excel, нажав кнопку «файл | Экспорт | Сохранить как .xls».

6. анализ данных

1. Расчет оптического распознавания текста
   1. В экспортированном файле Excel на вкладке «Within_Rates» запись «Тариф» для каждой камеры измерения (нмоль/ч).
   2. Для каждого экспериментального образца вычесть «Тариф» пустой камеры от «Тариф» экспериментальный образец камеры для получения исправленное значение OCR и принять абсолютное значение этого числа.
   3. Вычислить общее OCR на мг teliospores путем деления исправленное значение абсолютного OCR сотовых массы используется.
   4. В среднем реплицировать значения «OCR на мг teliospores» для каждого штамма.
2. Анализировать данные с помощью соответствующего статистического метода (например., студента t-тест, дисперсионный анализ) с помощью Microsoft Excel из других статистического программного обеспечения.
3. Граф необработанных данных, чтобы вычислить процент кислорода, оставаясь на каждый момент времени вы хотите, чтобы график. Разделить первое чтение само по себе и умножить на 100 (остальные 100% кислорода), затем разделить каждого последующего чтения в первом чтении и умножить на 100, чтобы получить процент кислорода, оставаясь в камере.

7. индукция Teliospore всхожесть изолировать Teliospores на различных стадиях всхожесть

1. Подготовьте PDB (24 г/Л), дополнены Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл) в области биобезопасности кабинета.
2. Место около 10 мг U. maydis teliospores в трубку microcentrifuge 1,5 мл.
3. Приостановите teliospores в 500 мкл PDB. Пипетка осторожно перемешать до тех пор, пока есть нет сгустки teliospores в среде.
4. Передача teliospore подвеска на колбу Эрленмейера газобетона 250 мл, содержащие PDB, дополнена Стрептомицина сульфат.
5. Инкубируйте колбу на ночь на 28 ° C, тряски на 90 об/мин.

8. Подготовка Петри и микроманипулятор

1. Подготовьте чашку Петри (57 см²) дозирования рядами капель для микрокапиллярной подготовки и сбора проб.
   1. Пипетка 5 мкл (x 4) dH₂O капельки в верхней части Петри.
   2. Пипетка 2 мкл (x3) РНК стабилизации раствора на Петри блюдо, чтобы быть использованы для сбора проб.
   3. Пипетка 5 мкл (x 30) капельки прорастать teliospores на Петри блюдо.
2. Добавьте 15 мл минерального масла на Петри блюдо. Убедитесь, что все капельки покрыты маслом перед продолжением.
3. Подготовьте микрокапиллярной с внутренний диаметр 15 мкм, фланец 1 мм, 55 мм Длина и угол кончика в 20°, поместив его в держатель микрокапиллярной и погружаясь в минеральном масле, где капиллярность позволит минеральное масло для ввода микрокапиллярной. Сбросьте давление в микрокапиллярной до приведения его в капли воды. Аспирационная подготовить микрокапиллярной с водой.

9. изоляция прорастать стадии конкретных Teliospores

1. С помощью элементов управления микроманипулятор, переместите подготовленный микрокапиллярной к одному из капель прорастания. Проникают капли, Нижняя микрокапиллярной и принести в устье микрокапиллярной до прорастания teliospore на стадии прорастания интерес.
2. Медленно аспирационная захватить Прорастающий teliospore. Остановите аспирационных вступлении микрокапиллярной teliospore. Повторяйте до тех пор, пока существует примерно пять teliospores в микрокапиллярной.
3. Поднять микрокапиллярной с микроманипулятор и привести его к коллекции капелька РНК стабилизация решения. Проникать капли и вставляют teliospores капли.
4. Повторите шаги 8.1 до 8,3 до приблизительно 1000 teliospores были захвачены в плен.

10. Восстановление коллекции капелька

1. Пипетка вверх коллекции капли и перенести его на крышке пробки microcentrifuge 2.0 мл РНКазы/DNase бесплатно. Осторожно удалите минеральное масло с пипетки не нарушая капелька коллекции.
2. Используйте teliospores для таких РНК изоляции приложений, ниже по течению.

Результаты

С помощью метода на основе microrespirometer Кларк тип измерения изменений в дыхания во время teliospore покоя и прорастание, мы подтвердили, что спящие teliospores exhibit низкий уровень дыхания (~ 1,075 мкмоль/h/мг) по сравнению с прорастать teliospores (~ 2 614 стерлингов мкмоль/h/мг; Рисунок 1A). Это представляет собой ~2.4-fold изменение в среднем дыхания между спящие teliospores и teliospores, которые побудили к прорастанию. Кроме того мы определили, чт...

Обсуждение

Патогенов растений biotrophic базидиомицета ежегодно вызывают миллиарды долларов в потери урожая. Подавляющее большинство этих патогенов производят teliospores, которые являются неотъемлемой частью грибковых разгон и половое размножение. Получение знаний о развитии и прорастание teliospores имеет решающее значение для понимания распространения смертоносных заболеваний, вызванных этими грибами. Для того, чтобы выявить молекулярные изменения в ключевые контрольные точки мы разработали метод, чтобы определить сроки физиолог...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стрептомицина сульфат	BioShop	STP101
Канамицина сульфат	BioShop	KAN201
Картофельный бульон с декстрозой	BD Difco	254920
1 л Waring Лабораторный блендер	Waring	7011S
Марля	VWR	470150-438
Nalgene Полипропиленовый влагопоглотитель с запорным краном	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
Датчик микродыхания (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Программное обеспечение	Unisense	Н/А
Штатив для микродыхания	Unisense	MR2-Rack
Мешалка для микродыхания	Unisense	MR2-Co
Система микродиссекции
Axio Vert.A1 Микроскоп с инвертированным светом	Zeiss
	Narishige	MMN-1
Трехосевой подвесной джойстик масляного гидромикроманипулятора	Narishige	MMO-202ND
Пневматический микроинжектор	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004