На месте микробной обогащения или на месте выращивания методы могут облегчить изоляции трудных культуры микроорганизмов таксонов, особенно с низким биомассы или geochemically экстремальных средах. Здесь мы описываем электрохимические установки без использования внешнего источника питания для обогащения микробных штаммов, которые способны внеклеточного переноса электронов (EET).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Самостоятельный электрохимических Set-up обогатить анод дышащие бактерий на месте
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Анаэробное дыхание, в сочетании с переноса электронов в нерастворимые минералов (именуемый внеклеточного электронного транспорта [EET]) считается критическим для производства микробных энергии и настойчивости во многих подземных средах, особенно не хватает акцепторов растворимых терминала электрона. Хотя EET-способных микробы были успешно изолированы от различных сред, разнообразие бактерий, способных EET является до сих пор плохо понимает, особенно в трудные для образца, низкой энергии или экстремальных условиях, таких как многие подземные экосистемы. Здесь мы описываем на месте электрохимические системы обогатить EET-способных бактерий с помощью анод как респираторные терминала электрон акцептора. Этот анод подключен к катоду, способный катализировать абиотических кислорода сокращения. Этот подход по сравнению с electrocultivation методами, которые используют потенцио для poising электродный потенциал, двухэлектродное система не требует внешнего источника питания. Мы представляем пример нашего отеля обогащения, используемых в щелочной пруд в кедры, наземные serpentinization сайт в Северной Калифорнии. Ранее попытки культивировать минеральных сокращение бактерии были неудачными, который, вероятно, из-за низкой биомассы характер данного сайта и/или низкой относительное обилие металла, снижения микробов. До внедрения наших двух электрод обогащения, мы измерили вертикальный профиль концентрации растворенного кислорода. Это позволило нам поставить углерода чувствовал, что анод и платины гальваническим углерода чувствовал, что катод на глубинах, поддерживающие анаэробных и аэробных процессов, соответственно. После инкубации на месте мы далее обогащенный анодное электрода в лаборатории и подтвердил различных микробных общины, по сравнению с поверхности придает или биопленки общин обычно наблюдается в кедры. Это обогащение впоследствии привело к изоляции первого electrogenic Микроб от кедры. Этот метод на месте микробной обогащения имеет потенциал, чтобы значительно повысить уровень изоляции EET-способных бактерий от низкой биомассы или трудно образец среды обитания.
Введение
Несколько минерал сокращение микробы показали использовать твердофазный минералы как терминал электрона акцепторов, внеклеточная переноса электронов (EET) процессов, которые поведения электронов к наружной поверхности клетки через окислительно-восстановительных ферментов1. EET чрезвычайно важно не только для микроба минеральные процессов, но также прикладной энергии и экологических технологий, таких как микробные топливные элементы2, электрод синтеза3и биоремедиации4. Новые EET-способных бактерии высоко ценятся и подробно изучены с точки зрения фундаментальных или прикладных5. Однако мы есть только ограниченное понимание экологических или биогеохимических значимость этих бактерий. Большинство EET-способных микробы были изолированы после обогащения от Аква, отложениях или анаэробных варочных котлов с помощью твердых электрона акцепторов MnO2, Fe2O3 или готовы электродов в лаборатории6, 7 , 8. Однако, эти методы часто производят аналогичные консорциумов и потенциально пропустить более чувствительных таксонов, которые могут доминировать низкой энергии или систем низкой биомассы, стабилизатор эти микробы способность адаптироваться к лаборатории или стерильных культуры окружающей среды9 . Обычно для сред низком биомассы, большое количество воды из сайта фильтруются сконцентрировать бактериальной клетки. Однако EET-способных бактерии часто exhibit анаэробных метаболизмом и поэтому воздействия кислорода может далее тормозить или предотвращения их выращивания. Альтернативные методологии на месте сконцентрировать клетки не подвергая их воздействию кислорода может способствовать изоляции EET-способных бактерий. Здесь мы приводим детали установки для занятия электрохимический способ обогатить EET-способных микроба в течение длительного периода времени без необходимости использования внешнего источника питания.
С помощью нашего electrocultivation экспериментов с сильно щелочной весны в Северной Калифорнии, кедры10, мы описываем этой территории электрохимической техники. Геохимия Спрингс в Кедры подвержены serpentinization в недрах. Источники весьма упрощенной, с концентрации кислорода ниже предела обнаружения под интерфейс воды воздуха, отметив потенциал для производства микробных энергии через EET в этом функционально анаэробной среды11. Однако нет никаких доказательств в поддержку EET-способных микробов из кедров (в 16S рРНК или метагеномных анализ). Даже несмотря на то, что эта среда было охарактеризовано как электрон акцептора ограниченный, потенциал использования нерастворимых минералы как терминал электрона акцепторов, включая такие минералы, как железо, обнажая минералы, которые приводят к от serpentinization (то есть, Магнетит), не были всесторонне исследованы12. Мы, таким образом, развертывание нашей электрохимические системы в кемпинге весной, высокий рН Весна в кедры, чтобы обогатить EET-способных микробов (рис.1)13.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Строительство системы двух электрод для окружающей среды инкубации
-
Подготовка материала анода и лечения углерода чувствовал электрода (рис. 2).
- Вырежьте углерода, чувствовал себя равные размеры в зависимости от желаемого биомассы обогащения. Замочите каждый электрод в 90% этанола для 30 минут, затем промойте деионизованной водой, sonicating за 1 мин после каждого полоскания по крайней мере 8 раз.
- Вымойте электроды дважды в 1 М HCl, перемешивании в течение как минимум 12 h для каждой стирки.
- Сухие электродов в печи тепло (37 ° C) для 6-12 ч или до свободной жидкости.
- Прикрепите электроды к Титан проволока с помощью эпоксидных графита в производителя протокол на пластине из политетрафторэтилена (non втыкать поверхность).
Примечание: Мы использовали Титан проволока из-за его высокой толерантностью к аэробной коррозии. - Выпекать электрода на 120 ° C в течение 6 ч.
- Проверить сопротивление между Титан проволока и углерода чувствовал с омметр и подтвердить, что сопротивление между проволокой и чувствовал электродов менее 5 ом.
-
Electroplation платины на углерода чувствовал электрода для подготовки материала катода
- Опускайте чувствовал углеродных электродов, подготовленную на этапе 1.1, в 2 М Кох не менее 12 ч в стеклянной посуде.
- Для электрохимической очистки, место электрода рабочих электродом (мы) в 3 электрод реактор, который также вмещает ссылку (RE) и Счетчик электрода (CE). Связаться мы, RE и CE потенцио, крокодил. Подтвердите все соединения с омметр.
Примечание: Мы использовали Ag/AgCl (KCl насыщенных) электрода и платиновой проволоки как RE и CE, соответственно. - Уравновешенность электрода на 1.0 V против. Ag/AgCl для 600 s в раствор электролита, содержащий 2 M Кох (с помощью достаточного объема затопить всю электрода). Вывезти электрода из электрохимических реактора (который сделан из стекла). Промойте электрод в дейонизированной воде по крайней мере 8 раз, sonicating за 1 мин после каждого полоскания. Сухой электродов при 100 ° C в течение 12 часов.
- Подготовить решение покрытия, добавьте 100 г лимонной кислоты, 5 г натрия сульфата и 2 g гексагидрат дигидроген Гексахлороплатинат (IV) 1 Л 2 М серной кислоты.
- Весят очищены и сушеные электродов, подготовленную в 1.2.1–1.2.2 шаги, а затем покрытия электрода в раствор обшивки, подготовленную на этапе 1.2.3. Sonicate электрод в решении обшивка три раза для 30 s каждый.
- Гальваническим электродов, poising электродный потенциал на – 0,2 V против Ag/AgCl для 460 s в покрытие решения. Ополосните электроды дважды в деионизированной воде и отбросить Платиновый отходов.
- Ополосните электроды в деионизированной воде по крайней мере 3 раза, sonicating за 20 секунд после каждого полоскания. Промыть без sonication еще по крайней мере три раза.
- Сухой электродов при 100 ° C для по крайней мере 12 h. весят электрода для количественного определения гальванических платины на углерода чувствовал электрода.
2. Строительство и монтаж системы двух электрод
-
Исследование места установки для каждого электрода в естественной среде.
- Определение концентрации кислорода, с помощью зонда растворенного кислорода (ДУ).
- Проверка глубины профиля делать на сайте.
Примечание: Желаемый условия окружающей среды для анода являются последовательной гидратации и гипоксия. При необходимости удалите влияние oxygenic фотосинтез, защитный анод от света. Идеальные условия для размещения катод постоянно увлажненной и вблизи поверхностных вод для аэробных. При необходимости прикрепите поплавки для поддержания поверхности контакта в катод.
-
Строительство системы топливных элементов типа 2-электродный инкубации
- Подключите изолированные провода нужной длины и свинца титана провода от электроды (одна анод и один платины покрытием катод), поворачивая две линии. Обложка соединения с водонепроницаемым воском и далее защищать с помощью трубки термоусадочные морского класса.
- Подключите два провода с катодом и анодом, резистор известных сопротивления.
Примечание: Для биологических систем, Нижняя резисторы (10-1000 Ω) привести в более последовательной биологической активности. При желании, высокое сопротивление резистора будет препятствовать биологической активности, как отрицательный контроль. Для предотвращения коррозии каких-либо связей между резистором и приводит, мы охраняли их с трубки термоусадочные.
-
Измерение напряжения и протоколирование температуры с течением времени.
- Проверка напряжения между концами резистор для оценки текущего производства топливных элементов реакции.
- Измерьте напряжение разница во времени с помощью вольтметра протоколирования данных с соответствующие соединения, ведущих к анодом и катодом (см. Протокол изготовителя).
Примечание: Протоколирование данных одновременно является необязательным, но эта информация может помочь связаны изменения в колебания тока в абиотических в отличие от биологических.
-
Защита данных и электрические соединения
- Используйте стационарные или пластиковый мешок для защиты журнала и все электрические соединения от дождя.
- Исправьте пластиковый пакет и кабели плотно, чтобы защитить от сильного ветра. Пример показан на рисунке 1.
3. сбор образец электрод из природной среды
- Чтобы предотвратить качество образца анода от повреждения из-за загрязнения кислорода, соберите электрода в анаэробных условиях.
- По крайней мере 30 минут до сбора образец электрод, положите пробирку в анаэробных месте. Например отдельно поставьте пробирку и крышкой в нижней части пруда сделать бутылку внутри анаэробных.
- Вырезать свинца титана от электрода с резаком проволоку, аккуратно собирать образца электрода в пробирку и запечатать его в зоне анаэробные воды. Чтобы сохранить образец свежие, храните образца при температуре 4 ° C сразу же после проб.
Примечание: в качестве альтернативы, электроды могут быть переданы непосредственно анаэробной среды (N2 очищенные). Мы использовали кедры среднего (описаны Suzuki et al. 11), был разработан с водной геохимии измеряется на сайте и поправки для обеспечения достаточного количества питательных веществ для роста микроорганизмов. Это средства массовой информации была изменена для различных лабораторных экспериментов.
4. Лабораторное подтверждение для текущего производства и анализа ДНК
-
Электрохимические подтверждение текущих производственных мощностей микробной консорциумов, подключая к электроду.
- Построить электрохимический реактор14,15 с пробы электрода, провод платины и Ag/AgCl (KCl насыщенных) электрода, как мы, CE и, соответственно, в анаэробном камере. Заполните электрохимический реактор с кедрами носитель, содержащий доноров электронов растворимых углеводов.
- Равновесие электродный потенциал на 0,2 V против Ag/AgCl и мера текущего производства.
-
Экстракции ДНК от электрода образца с помощью микробных ДНК комплекта (см. таблицу материалы).
- Очистите внутренние анаэробных перчаточный ящик с 70% этанола и поставьте стерилизовать блюдо на алюминиевой фольге.
Примечание: Анаэробные камеры держит концентрация кислорода менее 1 ppm, сохраняя содержание водорода в атмосфере около ~ 2-3% к Мусоробот кислородом в присутствии палладиевого катализатора. - Откройте электрохимических реактора в перчаточном ящике, поместить образец электрод на блюдо и сократить размер трубки, используется в ДНК. Продолжите с протоколом производителя.
- Очистите внутренние анаэробных перчаточный ящик с 70% этанола и поставьте стерилизовать блюдо на алюминиевой фольге.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Текущее производство успешно измеряется приблизительно 3 месяца с помощью регистратор данных напряжения, как показано на рисунке 3. На этот раз был выбран, как он был длинный стабильной инкубационный период весны, из-за сильного падения дожди, влияющих на весну. Более короткий период может быть достаточно, хотя более длительный период может обеспечить более обогащения биомассы. Мы подтвердили связь двух электрод системы после электрохимического инкубации и сл...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В исследовании описано мы показываем обогащения микробной консорциума, связаны с на месте текущего производства. Наблюдаемые закономерности в текущей поддержки активности микроорганизмов в этой системе более короткие и долгое время весы. Важным шагом для построения функциональной двух электрод (топливных элементов типа) системы выявления и использования местоположение с стабильного уровня воды и концентрация кислорода в окружающей среде. Катода подвергается воздействию кислорода на воздух вода интерфейс, в то вр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы хотели бы признать Роджер Raiche и Дэвид Маккрори, позволяя нам доступ к кедры и консультаций на местах для долгосрочной перспективе инкубации. Мы также благодарим экипаж поля кедры в течение сезона 2013-2014: Shino Suzuki, Сунити Ишии, Грег Вангер, Grayson Chadwick, Bonita Лам и Мэтью Шехтер. Дополнительные благодаря Shino Судзуки и Куэнен Хайс для глубоких исследований и культивирования поддержки. Эта работа финансируется за счет субсидий для молодых ученых, A и B от японского общества для поощрения науки (JSP) KAKENHI Грант № 17H, 04969 и 26810085, соответственно и Японское агентство для медицинских исследований и развития (17gm6010002h0002). США финансирование нас управлением глобальной военно-морских исследований (N62909-17-1-2038), и центром для темной энергии биосферы расследований (C-Деби) (OCE0939564) и Института астробиологии NASA - подземной жизни (Най-Лу) (NNA13AA92A). Частью этой работы проводилась в рамках японского общества для поощрения наук: краткосрочные докторантура стипендий для Аннет Роу (PE15019) в университете Токио в лаборатории Кадзухито Хасимото.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Лист углеродного войлока | н/д | /д | Используется для анода и катода |
| Титановая проволока | Nilaco Cooporation | TI-451485 | Используется для создания системы топливных элементов |
| Графитовая эпоксидная | смола Electrolytica lnc. | н/д | Используется для подключения электродов и Ti |
| wire Сушильная печь | Yamato | DY300 | запекает электрод до<бр/> затвердевает проводящий графитовый эпоксидный |
| материал | Fluke | 616-1454 | для проверки омического значения<бр/> сопротивления |
| Зонд растворенного кислорода | Sper Science | # 850045 | для проверки концентрации кислорода<бр/> в Среда Резистор |
| Содиальный | Используется для создания системы топливных элементов<бр/> | ||
| Проводящий провод | Pico | 81141s | Используется для создания системы топливных элементов<бр/> |
| Вольтметр и регистратор данных | T& D corporation | VR-71 | Используется для записи данных |
| Гексахлорплатинат водорода(IV) Гексагидрат | wako | 18497-13-7 | Используется для электрополяции |
| Лимонная кислота | Wako | 038-06925 | Используется для электрополяции |
| Серная кислота | Wako | 192-04696 | Используется для электрополяции |
| HCl | Wako | 083-01095 | Используется для промывки электродов |
| Стеклянный цилиндр | Н/Д | Н/Д | Изготовлен на заказ, используется в качестве крышки и основания электрохимического реактора |
| Н | /Д | /д Н/А | Изготовлен на заказ, используется в качестве крышки и фундамента электрохимического реактора |
| Бутиловый каучук | Н/Д | /Д | Изготовлен на заказ, вставляется между каждым компонентом электрохимического реактора |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Используется в качестве порта впрыска электрохимического реактора |
| Электрод из оксида индия (ITO) | GEOMATEC | No.0001 | Используется в качестве рабочего электрода, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl насыщенный электрод | HOKUTO DENKO | HX-R5 | используется в качестве электрода сравнения, Φ 0,30 мм |
| Платиновая проволока | Nilaco Cooporation | PT-351325 | Используется в качестве противоэлектрода |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Используется для The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Используется для CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Используется для CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Используется для CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Используется для CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Используется для CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Используется для CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Используется для |
| инкубатора | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Используется для предкультивационной |
| автоклавной машины | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Используется для стерилизации электрохимического реактора и среды |
| Чистый стенд | SANYO | MCV-91BNF | Используется для предотвращения загрязнения электрохимического реактора и среды другими микробами |
| Центрифужный сепаратор | Eppendorf | 5430R | Скорость вращения до 6000&крат; g требуется |
| генератор газообразного азота | Puequ CO. LTD. | ПНТН-2 | Баллон с азотом также может быть использован вместо газогенератора |
| Ультрафиолетовый спектрометр | SHIMADZU | UV-1800 | Используется для оптимизации плотности клеток |
| Потенциостат | BioLogic | VMP3 | Используется для экспериментов по образованию биопленки и кинетическому изотопному эффекту |
| Термоциркуляционный циркулятор | воды как один | tr-1A | Используется для поддержания температуры электрохимического реактора |
| Клетка Фарадея | HOKUTO DENKO | HS-201S | Используется для электрохимических экспериментов |
| Анаэробная камера | COY | TypeB (Vinyl) | ДЛЯ проведения экспериментов<бр/> в анаэробных условиях |
| Ультрачистый набор для экстракции ДНК | MoBio |
Ссылки
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).
- Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).
- Lovley, D. R., Coates, J. D. Bioremediation of metal contamination. Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).
- Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200. Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).
- Rowe, A. R., et al. In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring. Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).
- Suzuki, S., et al. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).
- Suzuki, S., et al. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communications. 5, 3900(2014).
- McCollom, T. M., et al. Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine. Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).
- Morrill, P. L., et al. Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars. Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells. , InTech. 207-222 (2012).
- Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier. Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
