Method Article

Развития и функциональная характеристика мышиных Tolerogenic дендритных клеток

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол к развивать и характеризуют tolerogenic дендритных клеток (TolDCs) и оценить их иммунотерапевтических полезности.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунная система работает, поддерживая туго баланс между координации реакции против иностранных антигенов и поддержание отвечать государства против себя антигены, а также антигены от синантропных организмов. Нарушение этого иммунного гомеостаза может привести к хроническому воспалению и развития аутоиммунных заболеваний. Дендритные клетки (DCs) являются профессиональные антиген представляющих клеток иммунной системы участвует в активации наивно T клетки инициировать иммунного ответа против иностранных антигенов. Однако DCs, также могут быть продифференцированы в TolDCs, которые действуют для поддержания и поощрения терпимости Т-клеток и подавить эффекторных клеток, способствуя развитию условий либо аутоиммунных или хронического воспаления. Недавние улучшения в нашем понимании TolDCs предполагает, что DC толерантность может быть достигнуто путем модулирования условий их дифференциация. Это явление привело к огромным ростом развивающихся TolDC терапии для многочисленных иммунных, причиненный из-за перерыва в иммунной толерантности. Успешные исследования в доклинических аутоиммунитета мышиных моделях дополнительно подтверждена иммунотерапевтических утилита TolDCs в лечении аутоиммунных заболеваний. Сегодня TolDCs стали перспективным иммунотерапевтических инструментом в клинике для восстановления иммунной толерантности в различных иммунных ориентации патогенных аутоиммунных реакций, оставляя нетронутыми защитного иммунитета. Хотя массив стратегии было предложено несколько лабораторий, чтобы побудить TolDCs, не существует согласия в характеристике сотовой и функциональных фенотип этих клеток. Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство для развития костного мозга, полученных DCs в больших количествах, уникальный метод, используемый, чтобы отличить их в TolDCs с синтетическими тритерпеновые 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic кислота difluoro пропил Амид (CDDO-ОАФК) и методы, используемые для подтверждения их фенотип, включая анализ основных молекулярной подписей TolDCs. Наконец мы покажем метод для оценки TolDC функции путем проверки их иммуносупрессивные ответ в пробирке и в естественных условиях в доклинических модели рассеянного склероза.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные клетки (DCs) являются неотъемлемой частью иммунной системы и были впервые обнаружены и характеризуется Ральф Стейнман и Zanvil кон в 1973 году как основной профессиональный антиген представляющих клеток1. Показано, что РСУ, играть важную роль в иммунной активации, представив обработанные антигенам Т-клетки и клетки B через комплексов гистосовместимости (MHC) в средних лимфоидных органов связать врожденная и адаптивного иммунитета2. В иммунной системе млекопитающих существует по крайней мере две категории DCs, которые были описаны как миелоидного DCs и плазмоцитарная контроллеров домена (PDC)3. Миелоидные DCs, также известный как обычных DCs (cDCs), характеризуются проявлением CD11c и можно дифференцировать как незрелых DCs (ОРС) в пробирке прогениторных клеток костного мозга и периферической крови моноциты с помощью Гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и Ил-4 в мышиных или человеческого вида, соответственно4.

Активация «угроза» сигналы, такие как патоген связанные молекулярные структуры (PAMP) или повреждения связанные молекулярные модели (сырой), будет управлять созревания ОРС к иммуногенность DCs как зрелые DCs (офицеров) через обязательную различных рецепторов признание шаблон DC поверхности5. Иммуногенность DCs далее премьер наивные Т-клеток пролиферации и дифференцировки через upregulation MHCII2, костимуляторных лигандами (CD80, CD86 и CD40)6, цитокины, и других растворимых медиаторов7. Каскад производства про воспалительных посредника от иммуногенных DCs имеет важное значение для дифференциации cytokine опосредованной Т-клеток. К примеру ИФН γ и Ил-12, необходимые для Th1 дифференцировки8 и IL-1, IL-6 и IL-23 имеют решающее значение для наивного поляризации Т-клеток к Th17 клетки9. Хотя пожилые DCs реагируют на иностранных антигены, неконтролируемая DC активации self-антигенами может привести к терпимости абляции и содействовать развитию аутоиммунных заболеваний путем создания аутореактивная T-клетки, чьи Активация приводит к разрушению тканей10 .

Недавние доклады представили четкие доказательства DC пластичности, подтверждается их способности взаимодействовать с различными подсказками в пределах их микроокружения ткани и дифференцироваться в различных эффекторных/подавитель DC подмножеств. Было показано, что противовоспалительное посредников, как Ил-1011, TGF-β12и Хо-113 играть важную роль в иммуносупрессия, вызывая tolerogenic DCs (TolDCs). Эти TolDCs приобретают функции регулирования и пресечения распространения клеток T14. Кроме того отсутствие сотрудничества стимуляции, DCs производство противовоспалительных медиаторов из TolDCs способствовать индукции регулирующих Т-клеток (Tregs) и также эффективно подавляют дифференциации и расширения Th1 и Th1715. В последние два десятилетия, терапевтический потенциал TolDCs было зарегистрировано несколько следователей. В этих исследованиях администрация экс vivo сгенерирована различных доклинических моделей аутоиммунных заболеваний16 TolDCs не только улучшили патологических симптомов, но и привели к развитию иммунной толерантности больных17 ,18. Интересно, что сегодня TolDCs терапии было рассматривать как альтернативные или добавочной подход для аутоиммунных заболеваний в нескольких клинических испытаний, в том числе тип 1 сахарный диабет19, ревматоидный артрит20, 21, рассеянный склероз (РС)22,23,24и болезнь Крона25.

Существует множество протоколов, которые были использованы для разработки TolDCs и несколько лаборатории сообщили методы для генерации и фенотипические характеристики TolDCs. Эти методы могут использоваться для герметизации создания TolDCs в пробирке из гемопоэтических прародителями и стабильно поддерживать их в tolerogenic государства в vivo26,27,28,29. ОРС могут быть преобразованы в TolDCs под воздействием различных фармакологических агентов иммуномодулирующих или противовоспалительных цитокинов. Например витамин D3 является хорошо известных фармакологических агент, известный для увеличения производства Ил-10 и подавляют секрецию Ил-12 от РСУ и тем самым увеличить их иммуносупрессивные функции30. Кроме того, когда DCs подвергаются мощной воспалительных раздражителей, таких как липополисахаридов (LPS), несколько фармакологических агентов, таких как дексаметазон31,32rapamycin и кортикостероиды33 было показано побудить TolDC фенотип путем сокращения поверхности выражение DC CD40, CD80, CD86 и MHCII34. Ил-10 и TGF-β-это было показано, что наиболее изучены противовоспалительных цитокинов побудить DC терпимости35 и сопутствующей подверженности обоих этих цитокинов побудить tolerogenic фенотип в DCs36.

Начиная с tolerogenic, DC определяется функциональных характеристик, а не фенотипические маркеры, есть большой необходимо разработать согласованный метод для сотовых и функциональных характеристик TolDCs. Кроме того, строгого и последовательного протокола должен быть создан для постоянной оценки и характеристика tolerogenic DC фенотип, если мы хотим эффективно и можно воспроизвести сравнить новых агентов способность вызывать TolDC фенотип в Лаборатория. Здесь мы предоставляем подробный протокол с шаг за шагом методы изолировать ОРС из гемопоэтических прародителями мышей и впоследствии анализировать эффективность новых агентов по оценке для их способность преобразовать ОРС в TolDCs, обеспечивая надежный функциональные и фенотипические характеристики TolDCs в пробирке и в естественных условиях. Это описание включает метод разработки характеризовать TolDCs их поверхности лигандов, цитокинового профиля и иммуносупрессивные функции в пробирке. Мы также предоставляем пример метода, позволяющего исследовать потенциал терапевтического применения этих TolDCs в доклинических модели МС, Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE). Этот протокол будет помочь следователям для оценки новых агентов способность содействовать индукции TolDCs и облегчит усилия по расширению сферы развития терапевтического TolDC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными случае Вестерн Резерв школы медицины университета в институциональный уход животных и использования Комитетом.

1. Подготовьте костного мозга-производные дендритных клеток (BMDCs)

  1. Стерилизовать всех хирургических инструментов через автоклавирования и выполнить эксперимент в классе II биологической безопасности кабинета с присвоенным безопасности процедур.
  2. Усыпить мышей C57BL/6 возраст 8-10 недель с помощью CO2 камеры. Поместите курсор мыши на доске рассечения и промыть 70% этиловом спирте. Акцизный малоберцовой кости берцовой и бедренной костей с помощью хирургические ножницы и место их с 70% этанола в 10 см культуры блюдо.
  3. Использовать хирургические лезвия и щипцы для рассечения тканей от как можно больше на крышке 10 см культуры блюдо и изоляции tibias и бедра, чтобы разместить их с 70% этанола в 6 см культуры блюдо.
  4. Используйте хирургические лезвия для обрезки обоих концах tibias и бедра. Используйте 3 мл PBS в шприц 3 мл с иглой 23G, чтобы очистить содержимое костного мозга от одного конца костей в коническую пробирку, содержащую 12 мл PBS. Повторите этот шаг 3 x для каждого конца костей.
  5. Центрифуга суспензию клеток на 300 g x 5 мин.
  6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 1 мл ACK лизировать буфер для 5 минут для удаления красных кровяных клеток.
  7. Добавьте 9 мл PBS для разбавления ACK лизировать буфер и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
  8. Удалить супернатант и Ресуспензируйте с 10 мл питательной среды (RPMI 1640 плюс L-глютамина, 10% FBS, 1% несущественные аминокислот (100 x), 10 мм HEPES, 50 Нм β-меркаптоэтанол и 5% пенициллина/стрептомицина).
    Примечание: Эндотоксина уровень должен быть менее 0,1 ЕС/мл в FBS.
  9. Передайте суспензию клеток через стрейнер клетки 40 мкм и принять 20 мкл суспензии клеток и смешать с 80 мкл Трипановый синий подсчитать количество живых клеток с помощью цитометр.
  10. Регулировать количество клеток до 1 x 106 клеток/мл с ГМ-КСФ 15 нг/мл и 10 нг/мл Ил-4.
  11. Пластина 3 мл 1 х 106 клеток/мл в каждую лунку 6-ну пластины и инкубации клеток при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности в инкубаторе CO2 .
    Примечание: Клетки костного мозга от одной мыши составляет около 3-5 x 107 клеток, указав, что его можно разместить от 2 до 3 6-ну пластины.
  12. На третий день удалить все 3 мл питательной среды из каждой скважины, добавить 2 мл свежего PBS в каждой скважине, и затем слегка взболтать пластину для обеспечения удаления всех клеток не сторонник.
  13. Замените 3 мл свежей питательной среды 15 нг/мл ГМ-КСФ и 10 нг/мл Ил-4 в каждой скважине. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности в инкубаторе CO2 .
  14. На 5 день напрямую добавьте еще 3 мл свежей питательной среды с ГМ-КСФ 15 нг/мл и 10 нг/мл Ил-4 в каждой скважине. Инкубируйте клетки при 37° C, 5% CO2 и 95% влажности в инкубаторе CO2 .
    Примечание: Общий объем в каждой скважине теперь составляет 6 мл.
  15. На 7 день Положите всю пластину на льду за 10 минут. Аккуратно Пипетка питательной среды в каждой скважине выбить слабо сторонник BMDCs как ОРС в подвеска.
    Примечание: По-прежнему адэрентных макрофаги прикреплены к пластине. Низкая температура и аккуратно процедуры являются ключом к избежать DC активации влияют на дальнейших экспериментов.
  16. Центрифуга суспензию клеток на 300 g x 5 минут и Ресуспензируйте с свежей питательной среды для дальнейших экспериментов.
    Примечание: BMDCs может быть идентифицирован с флуоресцировани обозначенного антитела CD11c проточной цитометрии и мы показали наши стробирования стратегия BMDCs для дальнейших экспериментов на рисунке 1.

2. охарактеризовать ген TolDC и профиль белка

  1. Пластина 2 мл 1 х 106 BMDCs/мл за хорошо в 6 скважин плита с питательной среды в присутствии или отсутствии 100-400 Нм CDDO-ОАФК для инкубации 1 ч при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности воздуха в инкубаторе CO2 .
    Примечание: CDDO-ОАФК, синтетические тритерпеновые, является ядерный фактор (эритроидные производные 2) - как - 2 индуктором фактор (Nrf2) и ингибитор ядерный фактор κB (NF-κB). Применить другие агенты для индукции TolDCs от ОРС, как Ил-10, витамин D3, дексаметазона или залив 11-7085 и изменять этот шаг до оптимального состояния для каждого агента.
  2. Добавьте 10 или 100 нг/мл ПЛАСТИНОК для инкубации 4-24 часа, чтобы побудить офицеров (время инкубации отличается за счет измерения mRNA или белка).
  3. Аккуратно Пипетка питательной среды в каждой скважине и урожай суспензию клеток с помощью пипетки 1 мл. Центрифуга на 300 g x 5 минут собрать клетки и супернатанта, соответственно.
  4. Анализ поверхности лигандов из клеток гранулы подачей cytometry, таких как стимулирующее лигандов: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL или тормозящее лигандам: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Изолировать РНК из клеток окатышей и анализировать РНК и супернатанта образцов для цитокинового профиля и генов и белков уровней Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и ИФА, соответственно.
    Примечание: например, воспалительных цитокинов: EDN-1, Ил-6, Ил-12 и Ил-23 или противовоспалительные цитокины ФНО α, IFNγ,: IL-4, Ил-10, IL-15, TGF-β1 и Хо-1.

3. оценить функцию TolDCs In Vitro и In Vivo

  1. Т-клеток сингенных распространения Assay
    1. Стерилизовать всех хирургических инструментов через автоклавирования и выполнить эксперимент в классе II биологической безопасности кабинета с присвоенным безопасности процедур.
    2. Подготовьте MACS буфер с помощью 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 2 мм ЭДТА в 500 мл PBS. Стерилизуйте буфера путем фильтрации через фильтр 0.2 мкм.
      Примечание: Сохраняйте буфер на льду во время следующий эксперимент.
    3. Для получения CD4+ T клетки, усыпить OT-II Т-клеточный рецептор (TCR) трансгенных мышей возраст 8-10 недель с помощью CO2 камеры. Поместите курсор мыши на доске рассечения и промыть 70% этиловом спирте. Изолируйте селезенки с левой стороны живота, используя Ножницы хирургические и пинцет.
    4. Поставьте селезенки с 2 мл PBS в 6 см культуры блюдо и используйте задней толкающую палку шприц 3 мл для фарша селезенки, передав стрейнер клеток 40 мкм.
    5. Собирайте суспензию клеток и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
    6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 400 мкл буфера MACS.
    7. Добавить 100 мкл CD4 Т-клеток биотин-антитела коктейль+ при температуре 4° C за 5 минут.
      Примечание: Коктейль антитело связывает на другие типы клеток, за исключением CD4 клеток+ T, например CD45R, CD11c, CD8a, CD19, CD25, CD11b (B220), CD49b (DX5), CD105, анти-гистосовместимости, Тер-119 и TCRγ/δ.
    8. Добавьте 300 мкл буфера MACS и 200 мкл анти биотина бусины (Таблица материалов) при 4° C на 10 минут.
    9. Место столбца в составе ферромагнитных сфер (Таблица материалов) и разделительный фильтр вместе в магнитного поля и промойте его с 3 мл MACS буфера.
    10. Добавьте 9 мл MACS буфера в клетки и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
    11. Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл буфера MACS и применять на столбце. Сбор через поток содержащий CD4+ T клетки.
    12. Промойте колонку с другой 3 мл буфера MACS и также собирать потока через.
    13. Чтобы получить селезеночной Пан DCs, усыпить мышей C57BL/6 возраст 8-10 недель с помощью CO2 камеры. Поместите курсор мыши на доске рассечения и промыть 70% этиловом спирте. Изолируйте селезенки с левой стороны живота, используя Ножницы хирургические и пинцет. Положите селезенки в 6 см культуры блюдо с 2 мл раствора коллагеназы D (2 мг/мл коллагеназы D растворяют в HBSS, содержащих кальций, магний).
    14. Придать 1 мл раствора коллагеназы D к селезенке два раза с 1 мл шприца и иглы 25G. Селезенка мелко нарежьте небольшой ножницами.
    15. Встряхнуть и инкубации при комнатной температуре в течение 25 минут.
    16. Добавьте 500 мкл ЭДТА 0,5 М при комнатной температуре в течение 5 минут.
      Примечание: Шаги от 3.1.13-3.1.14 имеют решающее значение для увеличения урожайности DCs.
    17. Теперь используйте задней толкающую палку шприц 3 мл фарш пульпы селезенки, передав стрейнер клетки 40 мкм и собирать суспензию клеток центрифугированием при 300 x g за 5 минут.
    18. Ресуспензируйте Пелле клеток в 350 мкл буфера MACS, 50 мкл Реагента блокирование FcR и 100 мкл Пан дендритных клеток биотин-антитела коктейль на 4° C на 10 минут.
      Примечание: Антитела коктейль против антигенов, которые не выражаются DCs.
    19. Вымойте клетки путем добавления 9 мл буфера MACS и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
    20. Ресуспензируйте Пелле клеток в 800 мкл буфера MACS и добавить 200 мкл анти биотина бусы на 4 ° C на 10 минут.
    21. Повторите шаги от 3.1.9-3.1.11 для сбора DCs.
    22. Промойте колонку с другой 3 мл буфера MACS два раза и также собирать потока через.
    23. Лечить 2 x 105 DCs/мл в наличие или отсутствие 100-400 Нм CDDO-ОАФК при 37 ° C за 1 час отдельно, лейбл CD4+ Т-клеток (1 x 107/мл) с 1 мкм CFSE при 37 ° C в течение 15 минут, промойте PBS и скорректировать объем для получения конечной концентрации в 2 x 10 Т6 клеток/мл.
    24. Далее, в 96-луночных плита, совместно культуры 100 мкл лечение дендритных клеток с такой же объем CFSE-меченых CD4 клеток+ T, оба полученные выше шаги, чтобы получить 1:10 соотношение. Теперь добавьте 100 нг/мл пептид овальбумина (OVA) 323-329 в колодец и мера интенсивности CFSE Т-клеток подачей cytometry после 2-3 дня инкубации.
      Примечание: Числа клеток и соотношение DCs и T клетки были оптимизированы с нашей предыдущей работы37.
  2. Побудить пассивный ЕАЕ путем инъекций BMDCs импульсного с миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG) (35-55)
    1. Пластина 2 мл 1 х 106 BMDCs/мл за хорошо в 6 скважин плита с питательной среды в наличие или отсутствие 100-400 Нм CDDO-ОАФК для инкубации 1 hr.
    2. Добавить 10 нг/мл ПЛАСТИНОК для инкубирования 24 часов.
    3. Добавить 100 мкг/мл MOG (35-55) для инкубирования 4 часов.
    4. Урожай суспензию клеток и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
    5. Ресуспензируйте клетки лепешка с PBS и подсчитать количество ячеек.
    6. Подкожно вводить 200 мкл 2 х 106 клеток до 8-10 недель самок мышей C57BL/6 (100 мкл в каждом задняя нога).
    7. В день BMDC впрыска и 48 часов. позже, придать 200 нг коклюша токсина (PTX) в каждой мыши.
    8. Повторите шаги 3.2.6-3.2.7 один раз в неделю 4 недель подряд.
    9. Оцените клинические симптомы ЕАЕ ежедневно с помощью стандартных критериев37 (0,5 хромать хвост конце, 1-хромать хвост, 2-вмеру задние конечности слабость, слабость 3-тяжелые задних конечностей, 4-комплект задних конечностей паралич, 5-квадриплегией или устаревшей состояние, 6-смерть).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифференциация и выбор BMDCs:

Клетки-предшественники костного мозга были культивировали в полной RPMI среде в присутствии ГМ-КСФ и Ил-4, чтобы дифференцироваться в ОРС в течение 7 дней (рис. 1A). День 1 клетки были небольшими по размеру и показал сферических морфологии. Мойка с PBS, перед заменой свежей среды на 3 день помогли клетки в форме кластеров и также увеличил численность на...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом документе описывается эффективный протокол, который может использоваться для герметизации для создания ОРС и различать их впоследствии в TolDCs, и мы предлагаем, что это может применяться для оценки новых молекулярных целевых агентов способность заставить TolDC фенотип. Как описано в настоящем докладе, мы следовали последовательность, в которой мы впервые проанализированы TolDC выражение поверхности лигандов проточной цитометрии, последующую оценку DC цитокинового профиля как измеряется qRT ПЦР и ИФА. Наконец было...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим повестования Фармацевтика за предоставление CDDO-ОАФК. Мы также признаем поддержку Джейн и ли Сейдман кафедры педиатрического рака инноваций (Джон Letterio). Эта работа была поддержана Министерством обороны [W81XWH-12-1-0452]; Энджи Фаулер подростков и молодых взрослых рака исследовательская инициатива в случае всеобъемлющем онкологический центр; и Каллахан выпускник Академии награду за Hsi Цзюй Вэй F.J. Каллахан фонда.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsв собственном синтезеКлеточная культура
мыши GM-CSFPeprotech Inc.315-03Мышь дифференцировочная BMDC
IL-4Peprotech Inc.214-14Дифференцировка BMDC
Липополисахариды (ЛПС)Sigma Aldrich Inc.L2880Клеточная культура
&бета;-меркаптоэтанолSigma Aldrich Inc.516732Клеточная культура
коклюшного токсина (PTX)R& D systems3097EAE индукционный
MOG (35– 55) пептид21stCentury Biochemicalsв собственном синтезеEAE индукция Trypan
blueGibco, Life Technologies15250-061Клеточная культура
RPMI-1640 плюс L-глутаминThermoFisher Scientific11875-093Клеточная культура
Заменимая аминокислота (100X)ThermoFisher Scientific11140050Клеточная культура
HEPESThermoFisher Scientific15630080Клеточная культура
пенициллин/стрептомицинThermoFisher Scientific15140122Клеточная культура
40 μ m Клеточный фильтрCorning352340Выделение
клеток PE-конъюгированный CD80BD Biosciences557227Проточная цитометрия
PE-конъюгированная CD86BD Biosciences555665Проточная цитометрия
PE-конъюгированная PD-L1BioLegend124307Проточная цитометрия
APC-конъюгированная MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Проточная цитометрия
APC-конъюгированная CD11cBD Biosciences340544Проточная цитометрия
Изотип совместимый PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835проточной цитометрии
APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Проточная цитометрия
CFSEBioLegend423801Анализ пролиферации Т-клеток
Набор для выделения дендритных клетокPan Miltenyi Biotec Inc.130-100-875Анализ пролиферации Т-клеток
Блокирующий реагент FcRMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Анализ пролиферации Т-клеток
Сковорода Дендритные клетки Биотин-антитело коктейльMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Анализ пролиферации Т-клеток
Антибиотин MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Набор
выделения CD4+ Т-клеток для анализаMiltenyi Biotec Inc.130-104-454Анализ пролиферации Т-клеток
CD4+ Т-клетки Биотин-антитела коктейльMiltenyi Biotec Inc.130-104-454Анализ пролиферации Т-клеток
Антибиотин MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454Анализ пролиферации Т-клеток Буфер
для лизинга ACKThermoFisher ScientificA1049201дифференцировка BMDC
1 мл шприцBD Biosciences309626Анализ пролиферации Т-клеток
3 мл шприцBD Biosciences309588дифференцировка BMDC
25G иглаBD Biosciences309626анализ пролиферации Т-клеток
23G иглаBD Biosciences309588дифференциация BMDC
BSASigma Aldrich Inc.A2058Анализ пролиферации Т-клеток
EDTAThermoFisher Scientific15575020Анализ пролиферации Т-клеток
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401анализа пролиферации Т-клеток
Miltenyi Biotec Inc.130-095-823Анализ пролиферации Т-клеток
коллагеназа DSigma Aldrich Inc.11088858001Анализ пролиферации Т-клеток
HBSSThermoFisher Scientific14025076Анализ пролиферации Т-клеток
пептид овальбумина (OVA) 323– 329Сигма Олдрич Инк.O1641Анализ пролиферации Т-клеток
мыши ИФН-&гамма; Зонд TaqManThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Мышь IL-12a Зонд TaqManThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Мышь IL-12 p70 DuoSet ELISAR& D системыDY419-05ИФА
Мышь EDN-1 ИФАRayBiotechELM-EDN1-1ИФА
TNF-α Зонд TaqManThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR& D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan зондThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA KitR& D systemsM6000BELISA
IL-23a TaqMan зондThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Мышь IL-23 DuoSet ELISAR& D системыDY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan зондThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan зондThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β Зонд TaqManThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Антигемоксигеназа 1 антителоAbcamab13248Вестерн блоттинг
Анти-&бета;-актин антителаAbcamab8226Вестерн блоттинг
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSКалибурный клеточный анализаторBD BiosciencesПроточная цитометрия
Соответствие изотипа для пролиферации Т-клеток Фильтр предварительного разделения для

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsBone Marrow Derived DCsCDDO DFPA TreatmentFlow Cytometry AnalysisT Cell Proliferation AssayMagnetic Cell SortingCytokine Gene ExpressionPro Inflammatory ReductionAutoimmune Encephalomyelitis ModelImmunosuppressive Response Testing

Related Articles