Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Индукция нефротический синдром у мышей ретробульбарная инъекций доксорубицина и предотвращения объем удержания устойчивый выпуска Апротинин

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57642

⸱

6 мая 2018 г.

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Diabetology, Vascular Disease, Nephrology and Clinical Chemistry, University Hospital Tübingen, 2Institute of Diabetes Research and Metabolic Diseases (IDM) of the Helmholtz Center Munich, University Tübingen, 3German Center for Diabetes Research (DZD), University Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем индукции экспериментальной нефротический синдром в 129S1/SvImJ мышей впрыской быстрого ретробульбарная доксорубицина. Мы также лечить нефротическим мышей с устойчивый выпуска гранулы, содержащие Апротинин подавлять мочи сериновые протеазы активность и предотвратить задержку натрия.

Аннотация

Нефротический синдром является самым крайним проявлением протеинурией почек и характеризуется тяжелыми протеинурия, Гипоальбуминемия и отек из-за удержания натрия и гиперлипидемии. Для изучения патофизиологии этого синдрома, грызунов, которые были разработаны модели основаны на инъекции токсичных веществ, таких как доксорубицин, причинив ущерб Подоцит. В мышей только несколько штаммов чувствительны к этой модели. В wildtype 129S1/SvImJ мышей администрация доксорубицин путем быстрого внутривенного введения ретробульбарная синуса индуцирует экспериментальный нефротический синдром имеет все симптомы болезней человека, включая сохранение натрия и отек. После начала протеинурия экспонат мышей увеличилась мочевыводящих сериновые протеазы деятельность, которая приводит к активации эпителиальных натриевых каналов (ENaC) и натрия удержания. Фармакологических ингибирование мочевыводящих сериновые протеазы обращения с устойчивый выпуска Апротинин аннулирует ENaC активации и предотвращает сохранение натрия. Эта модель идеально подходит для изучения патофизиологии proteasuria, т.е., выведение активных сериновые протеазы, которые вызывают ENaC активации по протеолиза ее γ-Субблок. Это может рассматриваться как основного механизма ENaC активации и задержке натрия в протеинурией почек.

Введение

Нефротический синдром характеризуется тяжелыми протеинурия, Гипоальбуминемия, отек и гиперлипидемии и может рассматриваться как крайнее проявление протеинурией почек. Грызунов экспериментальный нефротический синдром может быть вызвана одной инъекции антрациклины или puromycin, которая приводит к повреждению Подоцит и напоминает человека минимальные изменения болезни и фокуса сегментарный гломерулосклероза (FSGS)1. После своего первого описания в 1955 году Френк и др. 2, puromycin нуклеозидов нефроз (PAN) в крыс стала стандартной модели для изучения патофизиологии нефротический синдром в многочисленных исследований3,4,5,6. В мышей соответствующая модель может быть вызвана антрациклиновой доксорубицин7. Однако существует сильное напряжение зависимость, которая генетически определяется по меньшей мере два генетических локусов8. Кроме того существуют различия в ответ протеинурией и курс нефротический синдром9,10. С помощью мыши 129S1/SvImJ и быстрого внутривенного введения доксорубицина через ретробульбарная синуса, протеинурия ответы достигать значения, которые являются достаточно, чтобы побудить характерные черты нефротический синдром, особенно объем удержания характеризуется асцит и почти без натрия мочи7. Задержка натрия в экспериментальной нефротический синдром исходил в результате активации эпителиальных натрия канала (ENaC) в дистальных канальцах, необычно отфильтрованных сериновые протеазы например плазмин, вызывая протеолиза ее γ-субъединица4 ,,1112. Недавно эта концепция была доказана в нефротическим мышей, которые были защищены от активации протеолитических ENaC и натрия удержания путем обращения с сериновые протеазы ингибитор Апротинин, который был столь же эффективным, как ENaC блокатор Амилорид13. Для обеспечения непрерывной поставки в дистальных канальцах, Апротинин осуществлялось через подкожно имплантированных устойчивый выпуска пеллет. Будущие исследования необходимы для идентификации сериновые протеазы, которые отвечают за протеолитических ENaC активации в нефротический синдром, который считается параллельно человеческой ситуации. Для этой цели доксорубицин индуцированной нефротический синдром является ценным модель, которая может быть использована в мышах одичал тип или расширен до генной инженерии мышей. Его преимущества включают в себя низкой стоимости препарата, Нижняя сложности управления и хорошая воспроизводимость14.

В этой статье мы демонстрируем индукции экспериментальной нефротический синдром быстрого внутривенного введения доксорубицина ретробульбарная синуса и имплантации устойчивый релиз гранулы, содержащие Апротинин подавлять мочи сериновые протеазы деятельность как измеряется с хромогенных assay.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы были проведены согласно национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных и немецкий закон о благополучии животных, и они были одобрены местными властями (Regierungspräsidium Tübingen).

1. индукция экспериментальной нефротический синдром впрыской доксорубицин ретробульбарная синуса

  1. Подготовьте 0,5 мл шприц с подключенного канюля 30G, пометив положение стоп поршня.
  2. Рассчитайте объем впрыска доксорубицина для мужчин (7,25 мкл/г веса тела (bw) равным 14,5 мкг/г bw доксорубицина) и самок мышей (6,9 мкл/g bw равный 13.8 доксорубицин bw мкг/г) вес тела с утра.
    Примечание: Данная доза подходит для индукции нефротический синдром. Незначительные изменения в дозировке привести к важнейшим другой курс нефропатии, доносящиеся из мягкая хронические заболевания почек с только небольшие изменения в скорость клубочковой фильтрации (доксорубицин bw 12.6 мкг/г) для острой почечной недостаточности (доксорубицин bw 15.4 мкг/г)7, 15.
  3. Теплый вычисленное количество раствора (2 мкг/мкл) доксорубицин в камере теплый 37 ° C.
    Предупреждение: Доксорубицин вред при проглатывании и может вызвать рак. Всегда надевайте перчатки при работе с доксорубицином и избегать любого контакта с кожей.
  4. Заполнять шприц с раствором доксорубицин до точки маркировки и баланс равным нулю. Заполните шприц с объемом впрыска и проверить объем путем взвешивания шприца.
  5. Narcotize мышь глубоко с 5 vol % изофлюрановая с помощью испарителем и поток кислорода 2 Л/мин.
    1. Не следует использовать мазь на глазах до инъекции. Оператор должен четкое представление о орбитальной полости для выполнения безопасного и успешного ретробульбарная инъекций.
    2. Оценить уровень анестезии на педаль рефлекс и при необходимости отрегулировать обезболивающий доставки перед началом инъекций.
  6. Поместите курсор мыши на правой боковой recumbency с его обратно перед тело оператора и его голову перед инъекции руки оператора.
    Примечание: Процедура описана для правша, левша лиц, выполняющих инъекции с левой рукой это легче сделать позицию и инъекции, отменил право слева.
  7. Тщательно торчат мыши левой глазного яблока из глазницы, применяя мягкое давление на кожу, дорсальной и вентральной для глаз.
  8. Прокол левой ретробульбарная пазухи от угол внутренний глаз (медиальной глазной спайки). Избегайте любого контакта с mouse´s глазного яблока.
  9. Слегка наклонить шприц и вставляют всего тома на одном дыхании. Убедитесь, что объем вводится без какого-либо сопротивления и без каких-либо признаков кровоподтек, например exopthalmus или утечки из укола.
  10. Так как доксорубицин является высокотоксичным веществом, проверьте благополучия по крайней мере один раз в день с помощью Оценка лист согласно Мортон и Гриффитс и др. 16 и оплатить особое внимание в месте инъекции. Если какие-либо признаки кровоподтек, как exopthalmus, нарушением веко закрытия или каких-либо признаков некроза как отек или кожных поражений occure после инъекции или в последующие дни, мышь должна быть euthanized.

2. Имплантация устойчивый релиз гранулы, содержащие Апротинин

  1. Заказать окатышей с требуемой дозы в день и выпуска продолжительность заранее. В случае Апротинин выберите в дозе 1 мг в день, чтобы быть освобожден в течение 10 дней.
    Примечание: В этом исследовании, Апротинин гранулы содержат в дозе 10 мг.
    1. Хранить окатышей в сухих условиях и избежать любого воздействия влажности.
  2. Готовить необходимые элементы для хирургии, включая волосы ножницы, ножницы подготовка кожи, скальпель, хирургические пинцеты, две пары ткани пинцет, иглодержатель и 15 см monofile шов не рассасывающиеся.
    1. Стерилизовать инструменты, с помощью тепла стерилизатор для 5 мин при 240 ° C. Перед использованием инструментов, подождите 5 минут до тех пор, пока они достигнут комнатной температуры.
      1. Избегайте любого контакта стерилизованные инструмент советы нестерильной поверхностей.
      2. Избегайте ожогов кожи, горячие инструменты.
  3. Narcotize мышь с изофлюрановая 5 vol % после 1,5% vol, используя испаритель и кислорода поток 2 Л/мин.
  4. Поместите указатель мыши в лежачем положении на устройстве потепления, покрытые слоем марли, чтобы избежать теплового повреждения мыши. Температура поверхности составляет около 37 ° C.
  5. Защитите глаза мазью.
  6. Удалить волосы на середине обратно в площадью около 0,5 см2 с помощью ножниц или триммер волос и продезинфицируйте голые кожу дезинфицирующим средством для дезинфекции кожи. Удалите как меньше волос как можно скорее, так что он остается более трудным для мыши, чтобы достичь рану и поток заканчивается позднее и держать температуру тела.
  7. Надрезать лысый кожи с помощью скальпеля в кранио хвостового направлении длины около 5 мм. Подготовка левой боковой мешочек около 1 см глубины в подкожной соединительной ткани с помощью тупого подготовки.
    1. Оценить уровень анестезии на педаль рефлекс и при необходимости отрегулировать обезболивающий доставки перед началом операции.
  8. Вставьте один релиз 10-дневный Пелле в подготовленный левой боковой мешочек с помощью пинцета стерильные ткани. Оставьте гранулы в нижней части мешочек в планарной позиции.
    1. Избегайте прикосновения Пелле жидкости и влажность до помещены в подготовленных мешочек.
  9. Закройте кожи с 2-3 швами. Только оставьте очень короткие нити концами, чтобы сделать его более трудным для мыши, чтобы открыть швы, грызть.
  10. Поместите мышь отдельно, чтобы уменьшить послеоперационный бедствия и предотвратить открытие швы, грызть. Держите мышь в поле зрения до тех пор, пока он достаточно очнулся после наркоза.
    Примечание: Нет необходимости для управления послеоперационные боли, так как это вмешательство хорошо переносится без каких-либо признаков дискомфорта или боли. В качестве альтернативы мы рекомендуем актуальные обезболивающие, например падение бупивакаин на разрез до закрытия, которая обеспечит до 8 ч анальгезии.

3. Оценка для модели индукции, признаки нефротический синдром и благополучия

  1. Соберите утренней мочи (08:00 утра) в чашку реакции (1,5 мл) каждый день от дня инъекции, массируя мочевого пузыря.
    1. Измерить протеинурия, используя assay протеина Брадфорд и нормализовать креатинина.
      Примечание: Для индукции нефротический синдром, протеинурия должен достичь порога 120 мг/мг креатинина между 7 и 10 день после инъекции доксорубицина.
  2. Посмотрите для развития асцита. Проверить для увеличения окружности брюшной или свисая бочки.
  3. Весят мыши, гранул пищи и питьевой бутылки в первой половине дня (08:00 am) каждый день.
  4. Проверьте благополучия по крайней мере один раз в день, используя судейскую согласно Мортон и Гриффитс и др. 16

4. Измерение мочевыводящих сериновые протеазы с хромогенных Assay

  1. Подготовка рабочего раствора субстрата, добавив 15 мл стерильного фосфатный буфер (PBS) бутылка 25 мг лиофилизированных Хромогенный субстрат S-2251, уступая в концентрации 2 мм. Растворите Апротинин в PBS для получения Апротинин раствор с концентрацией 2 мг/мл.
    1. Хранить готовые решения, при-20 ° C. Это значительно замедляет auto деградации S-2251. Не используйте старые решения с сильным оттенком желтого цвета.
  2. Использование свежезаваренным подготовлен или талой рабочего раствора субстрата и тепло его в камере 37 ° C тепла.
  3. Оттепель мочи при комнатной температуре.
    1. Предотвращение деградации протеазы, избегая повторных оттаивания и замораживания. Хранить образцы мочи при-20 ° C.
  4. Используйте плиту 96 микрорезервуар подходит для фотометрических измерений. 3 мкл Неразбавленную мочу в каждом из двух скважин и добавьте 50 мкл рабочего раствора субстрата с 3 мкл раствора PBS или Апротинин скважин. Крышка с sealer пластины.
  5. Инкубируйте покрыты микрорезервуар пластина для 60 мин в камере 37 ° C тепла.
  6. Измерение оптической плотности каждой скважины на 450 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
  7. Возьмите разницу между ОД без Апротинин и с Апротинин как мочевой Апротинин чувствительных сериновые протеазы деятельность.
    Примечание: Измерение парной выборки с и без Апротинин увеличивает специфика assay субстрата может также расщепляется на другие протеазы, которые не играют роль патофизиологических.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После индукции наркоза изофлюрановая доксорубицин был быстро вводят через левый ретробульбарная синуса. Весь объем 7,25 мкл/г bw вводили без любого сопротивления и кровоподтек доказав исправить внутривенного расположения канюли. Мышь быстро оправился от наркоза и имел не обесценения в тот же день и в дальнейшем. В частности нет никаких признаков повреждения на левый глаз. После доксорубицин инъекции, пищи и жидкости потребления снизился за первые 3 дня из-за общее токсическое действие док...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем, что доксорубицин инъекции через ретробульбарная синуса инъекции индуцирует экспериментальный нефротический синдром в 129S1/SvImJ мышей с протеинурия, задержка натрия, hypoalbumenia и гиперлипидемии. Однако есть два важнейших вопросов, которые должны приниматься во внимание при использовании этой модели. Во-первых модель индукции строго зависит от дозы и отклонения доксорубицин дозы как малые, как 0,3 мкг/г повлиять на реакцию мышей15. Когда вводится с низкой дозы, например ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грант от немецкого фонда научных исследований (DFG, AR 1092/2-1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
supplies
BD Micro FINE + U-40 (0,30 мм x 8 мм)BD Deutschland GmbH, Heidelberg, ГерманияPZN: 07468060шприц
ETHILON*II (5/0, 16 мм, 3/8c, 45 см)Johnson& Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Германия)EH7823Hшов
НазваниеCompany>Номер в каталогеКомментарии
reagents
aprotinin (6000 KIU/mg)LOXO, Гейдельберг, ГерманияCAS 9087-70-1
Bepanthen, Augen- und NasensalbeBayer Vital GmbH, Леверкузен, ГерманияPZN: 1578681мазь
Chromogenix S-2251HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Германия82 0332 39хромогенный субстрат
доксорубицин (2.0 µ g/µ L)Cell Pharm, Бад Фильбель, ГерманияCAS 25316-40-9доксорубицин
изофлуран CP (1 мл/мл)CP-Pharma, Бургдорф, ГерманияCAS 26675-46-7изофлурана
гранулы с матричным замедленным высвобождением (изготовленные на заказ)Innovative Research of America, Сарасота, ФлоридаX-999гранулы
NameCompanyКаталожный номер<strong>Комментарии
equipment
ELx808 Абсорбционный считыватель MikroplateBioTek, Бад-Фридрихсхолл, ГерманияELx808считыватель микропланшетов
MICROSTERIL - 436B.M.S., Trescore Balneario, ИталияGAL/436стерилизатор
Гибридизационная печь/ шейкерGE Healthcare UK Limited, Амершам LIFE SCIENCE, Литтл Чалфонт, ВеликобританияRPN 2511термокамера
Thermo MAT Pro 10 Вт, 15x25 см, Lucky ReptileImport Export Peter Hoch GmbH, Вальдкирх, Германия61201устройство для подогрева мыши

Ссылки

  1. Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
  2. Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
  3. Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
  4. Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
  5. Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
  6. Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
  7. Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
  8. Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
  9. Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
  10. Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
  11. Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
  12. Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
  13. Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
  14. Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
  15. Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
  16. Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
  17. Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
  18. Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
  19. Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
  20. Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
  21. Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
  22. Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
  23. Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
  24. Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Инъекция доксорубицинаретробульбарный синусмочевая сериновая протеазаэпителиальный натриевый каналанализ протезуриизадержка натриямышиная модельхроническая болезнь почек
Индукция нефротический синдром у мышей ретробульбарная инъекций доксорубицина и предотвращения объем удержания устойчивый выпуска Апротинин
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.