Здесь мы представляем надежный метод для перепрограммирования первичной эмбриональных фибробластов в функциональной кардиомиоцитов путем Сверхэкспрессия GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, мир-1 и мир-133 (GHMT2m) наряду с ингибированием TGF-β сигнализации. Наш протокол создает избиение cardiomyocytes как 7 дней после трансдукция с до 60% эффективности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Транс дифференциация одной соматической клетки типа в другой имеет огромный потенциал для моделирования и лечения заболеваний человека. Предыдущие исследования показали что мыши эмбриональные, фибробласты дермы и сердца могут быть перепрограммированы в функциональных индуцированной cardiomyocyte как клетки (ОГВС) через гиперэкспрессия кардиогенным транскрипционных факторов, в том числе GATA4, Hand2, Mef2c, и Tbx5 в пробирке и в естественных условиях. Однако эти предыдущие исследования показали относительно низкая эффективность. Чтобы восстановить функции сердца, после травмы, механизмы, регулирующие сердца перепрограммирования должны раскрыты для повышения эффективности и созревания ОГВС.
Ранее мы показали, что ингибирование pro фиброзный сигнализации резко повышает эффективность перепрограммирования. Здесь мы подробно методы для перепрограммирования эффективности до 60%. Кроме того мы опишем несколько методов, включая проточной цитометрии, immunofluorescent изображений и изображений кальция для количественного определения перепрограммирования эффективность и созревания перепрограммировать фибробластов. С использованием протокола подробно здесь, механистических исследования могут быть приняты для определить положительные и отрицательные регуляторы сердечной перепрограммирования. Эти исследования могут идентифицировать сигнальных путей, которые могут быть направлены на содействие перепрограммирования эффективность и созревания, что может привести к Роман клеточной терапии для лечения заболеваний сердца человека.
Введение
Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах1. Приблизительно 800 000 американцев опыт первого или рецидивирующие инфаркта миокарда (MI) за1год. После ми гибели кардиомиоцитов (CMs) и сердечной фиброз, сданный активированные сердечной фибробластов, повредить сердце функция2,3. Прогрессирование сердечной недостаточности после ми в значительной степени необратимы, из-за плохой регенеративной способностью взрослых CMs4,5. Хотя текущий клинической терапии замедлить прогресс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты, требующих животных были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на UC Денвер Anschutz медицинского университета.
1. изоляция MEFs
- Приобрести беременных мышей C57BL/6 на E13. Корабль на ночь.
- Усыпить мать согласно утвержденным IACUC протоколы (ex: ~1.3 Л/мин CO2 до появления мертвых животных следуют шейки матки дислокации)
- Спрей мать с 70% этанола и открыть брюшной полости. Удаление рога матки, содержащие эмбрионов и место в 10 см блюдо с стерильных PBS.
- Сделайте надрез в sac эмбриона выпустить эмбриона. Трансфер эмбрионов для очистки 10 см блюд....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы с помощью перепрограммирования стратегии, изложенной выше и на рисунке 1B, созданных iCMs с приблизительно 70% клеток выразить сердечные тропонина T и около 55% клеток, выражая сердечной α-актинина, количественно подачей cytometry в день 9 После трансдукции GHMT2m (рисунок 2A и B). Кроме того, большинство клеток выразить сердечные тропонина T, тропонин I и сердца α-актинина, а также разрыв соединения маркер Co.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящее исследование излагается стратегия высокой эффективности непосредственно перепрограммировать фибробластов в функциональных iCMs через доставку GHMT2m перепрограммирования факторы, в сочетании с подавления про фиброзный сигнальных путей. С помощью проточной цитометрии, immunofluorescent изображений, кальция изображений и избиение клеток, мы показываем большинство клеток в этом протоколе пройти успешного перепрограммирования и принять см линии судьбы. Ранее мы показали, что добавление анти фиброзных соединений, вк.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование было поддержано средств от Боттчер Уэбб-Уоринг биомедицинских исследований программы Фонда, американский ученый сердца ассоциации грант развития (13SDG17400031), Университет Колорадо Департамента медицины выдающиеся начало карьеры Программа, Университет Колорадо Отдела кардиологии Барлоу Nyle Дотационный и низ R01HL133230 (для K.S). A.S.R было поддержано TL1TR001081 номер гранта NIH/NCATS Колорадо CTSA и предварительного докторских стипендий из университета Колорадо консорциума для исследования фиброз и перевода (CFReT). Это исследование было также поддерживается рака центр поддержки Грант (P30CA046934), кожи болезни исследования ядер Грант (P30AR0572....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 Мыши, | Лаборатория Чарльза Ривера, | 027 | Для выделения MEF |
| Платиновая E (PE), Клетки | , Биолаборатории, INC | RV-101 | Для производства ретровируса |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022. | FS Компонент iCM, PE и питательных сред |
| Среда 199 | Life Technologies | 11150-059 | Компонент среды iCM |
| Фетальная бычья сыворотка | Gemini | 100106 | Компонент iCM, PE и питательных сред Донорская |
| лошадиная сыворотка | Gemini | 100508 500 | Компонент iCM media |
| MEM Незаменимые аминокислоты, 50X | Life Technologies | 11130051 | компонент iCM медиа |
| Раствор пирувата натрия, 100X | Life Technologies | 11360070 | Компонент среды iCM и для визуализации кальция |
| MEM Заменимые аминокислоты, 100X | Life Technologies | 11140050 | Компонент iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Компонент среды iCM |
| Инсулин-трансферрин-селен | Gibco | 41400045 | Компонент среды iCM |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Компонент среды iCM |
| Пеницилин-стрептомицин | Gibco | 15140-122 | Компонент среды iCM, PE и питательных сред |
| GlutaMAX (добавка L-глутамина) | Gibco | 35050-061 | Компонент среды iCM, PE и питательных сред |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Компонент среды PE |
| Пуромицина дигидрохлорид | Life Technologies | A11138-03 | Компонент ПЭ среды |
| 0,25% трипсин/ЭДТА | Gibco | 25200-056 | Для отделения клеток из культуральных чашек |
| A-83-01 | R& D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells для ингибирования передачи сигналов TGF-β - способствует высокоэффективному перепрограммированию. Использование при 0,5 & микро; M |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | Для разбавления и хранения А-83-01 и компонента субстраментной среды |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | Для покрытия посуды на тарелках MEF |
| FuGENE 6 Трансфекционный реагент | Promega | E2692 | Трансфекционный реагент |
| Opti-MEM Восстановленный сывороточный медиатор | Gibco | 11058-021 | Трансфекционный реагент |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Плазмида, содержащая фактор | ||
| перепрограммирования pBabe-X miR-1 | Плазмида, содержащая Фактор перепрограммирования | ||
| pBabe-X miR-133 | Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования | ||
| pBabe-X GFP | Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования | ||
| полибрена (гексадиметрина бромид) | Sigma | H9268-5G | Для индукции вируса. Использование в концентрации 6&микро; г/мл |
| Вакуумный фильтр + бутылки (0,22 &; m pores) | Nalgene | 569-0020 | Для фильтрующих материалов |
| Шприцы | Bd Vacutainer Labware | 309654 | Для фильтрации вирусов |
| 0,45 & микро; m Фильтры | Celltreat | 229749 | Для фильтрации вирусов |
| 70 & микро; m клеточные фильтры | Falcon | 352350 | Для выделения MEF и проточной цитометрии |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Для фиксации и пермеабилизации клеток для проточной цитометрии |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | Для промывки клеток для проточной цитометрии |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | Для промывки клеток |
| Бычья сыворотка Альбумин | VWR | 0332-100г | Для проточной цитометрии и визуализации кальция |
| Козья сыворотка | Sigma | G9023 | Для блокирования клеток для проточной цитометрии |
| Сыворотка осляка | Sigma | D9663-10mg | Для блокирования клеток для проточной цитометрии |
| мышиный тропонин T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Проточная цитометрия |
| мыши α-актинин | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Проточная цитометрия |
| кролика Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 |
| IF Кролик Тропонин I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, кролик | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, мышь | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, мышь | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Проточная цитометрия |
| 27-цветный проточный цитометр ZE5 | Bio-RAD | Для FACS | |
| Параформальдегид | sigma | P6148-500mg | Для фиксации клеток для IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Для пермеабилизации клеток для IF |
| EVOS™ Система цветной визуализации FL | Thermo Scientific | AMEFC4300 | для IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | Для визуализации кальция |
| KCl | VWR | 395 | Для визуализации кальция |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | Для визуализации кальция |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | Для визуализации кальция |
| глюкоза | sigma | G7528-250g | Для визуализации кальция |
| HEPES | sigma | H4034-500g | Для визуализации кальция |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | Для визуализации кальция |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | Для визуализации кальция |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | Для разрушения переходных процессов кальция в iCMs - используйте при 10 & микро; |
| М Изопротеренол | сигма | I6504-1g | Для увеличения количества кальциевых переходных процессов в iCM - используйте при 1-2 & микро; M |
| Marianas Вращающийся диск Конфокальный микроскоп | 3i | Для визуализации кальция | |
| этанол | Decon Laboratories | 2801 | |
| отбеливатель | Clorox | ||
| 50 мл конические пробирки | GREINER BIO-ONE | ||
| 15 мл конические пробирки | GREINER BIO-ONE | ||
| 15 см чашки для клеточных культур | Falcon | ||
| 10 см чашки для клеточных культур | Falcon | 353003 | |
| 60 мм чашки для клеточных культур | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 лунок для клеточных культур | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12-луночные планшеты для культивирования клеток | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24-луночные планшеты для культивирования клеток | GREINER BIO-ONE | 662160 |
Ссылки
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
