Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57687

⸱

3 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Population Health Sciences, Medical College of Georgia, Augusta University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем надежный метод для перепрограммирования первичной эмбриональных фибробластов в функциональной кардиомиоцитов путем Сверхэкспрессия GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, мир-1 и мир-133 (GHMT2m) наряду с ингибированием TGF-β сигнализации. Наш протокол создает избиение cardiomyocytes как 7 дней после трансдукция с до 60% эффективности.

Аннотация

Транс дифференциация одной соматической клетки типа в другой имеет огромный потенциал для моделирования и лечения заболеваний человека. Предыдущие исследования показали что мыши эмбриональные, фибробласты дермы и сердца могут быть перепрограммированы в функциональных индуцированной cardiomyocyte как клетки (ОГВС) через гиперэкспрессия кардиогенным транскрипционных факторов, в том числе GATA4, Hand2, Mef2c, и Tbx5 в пробирке и в естественных условиях. Однако эти предыдущие исследования показали относительно низкая эффективность. Чтобы восстановить функции сердца, после травмы, механизмы, регулирующие сердца перепрограммирования должны раскрыты для повышения эффективности и созревания ОГВС.

Ранее мы показали, что ингибирование pro фиброзный сигнализации резко повышает эффективность перепрограммирования. Здесь мы подробно методы для перепрограммирования эффективности до 60%. Кроме того мы опишем несколько методов, включая проточной цитометрии, immunofluorescent изображений и изображений кальция для количественного определения перепрограммирования эффективность и созревания перепрограммировать фибробластов. С использованием протокола подробно здесь, механистических исследования могут быть приняты для определить положительные и отрицательные регуляторы сердечной перепрограммирования. Эти исследования могут идентифицировать сигнальных путей, которые могут быть направлены на содействие перепрограммирования эффективность и созревания, что может привести к Роман клеточной терапии для лечения заболеваний сердца человека.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах1. Приблизительно 800 000 американцев опыт первого или рецидивирующие инфаркта миокарда (MI) за1год. После ми гибели кардиомиоцитов (CMs) и сердечной фиброз, сданный активированные сердечной фибробластов, повредить сердце функция2,3. Прогрессирование сердечной недостаточности после ми в значительной степени необратимы, из-за плохой регенеративной способностью взрослых CMs4,5. Хотя текущий клинической терапии замедлить прогрессирование болезни и уменьшить риск будущих сердца события6,,78,9, не терапии вспять прогрессирование болезни из-за неспособности Восстановите CMs после инфаркта10. Роман клеточной терапии начинают лечить пациентов после смертоносного MI. неутешительно, клинические испытания, обеспечивая стволовых клеток к сердцу, до настоящего времени после ми показали неубедительными регенеративный потенциал11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

Поколение человека производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) от фибробластов, гиперэкспрессия четырех факторов транскрипции, впервые продемонстрированная Такахаси и Яманака, открыл дверь в новые прорывы в ячейке терапии19. Эти клетки могут дифференцироваться в все три зародышевых19, и несколько очень эффективных методов для генерации большого количества CMs были ранее показали20,21. HiPSC производные CMs (бедра CMs) предлагает мощную платформу для изучения cardiomyogenesis и может иметь важные последствия для восстановления сердца после травмы. Однако бедра CMs в настоящее время сталкиваются поступательные препятствиями из-за проблем формирования тератома22, и их незрелых природа может быть pro аритмогенная23. Перепрограммирование фибробластов в hiPSCs вызвал интерес в непосредственно перепрограммирования фибробластов в другие типы клеток. Арип et al. продемонстрировал что Сверхэкспрессия GATA4, Mef2c и Tbx5 (GMT) в фибробласты, приводит к прямой перепрограммирования для сердечной линии, несмотря на низкую эффективность24. Перепрограммирование эффективность была улучшена с добавлением Hand2 (GHMT)25. Поскольку эти ранние исследования многих публикаций показали, что изменяя перепрограммирования фактор коктейль с дополнительной транскрипции факторы26,27,28,29, Хроматин модификаторы30,31, микроРНК32,33или малых молекул,34 , приводит к улучшению перепрограммирования эффективности и/или созревание индуцированных cardiomyocyte подобных клеток (ОГВС ).

Здесь мы предоставляем подробный протокол для создания iCMs от мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) с высокой эффективностью. Мы ранее показал, что коктейль GHMT значительно улучшилась с добавлением мир-1 и мир-133 (GHMT2m) и дальнейшего улучшения при про фиброзный сигнальные пути, включая преобразование фактор роста β (TGF-β) сигнализации или Ро связанные протеин киназы (рок) сигнальные пути являются тормозится35. Используя этот протокол, мы показываем, что приблизительно 60% клеток выразить сердечные тропонина T (cTnT), примерно 50% Экспресс α-актинина, и большое количество биений клеток может наблюдаться 11 день после трансдукции перепрограммирования факторы и лечение в кратчайшие сроки с фонд TGF-β типа ингибитор рецепторов A-83-01. Кроме того эти iCMs Экспресс разрыв соединения белков, включая connexin 43 и спонтанного сокращения и кальция транзиентов. Это отмечено улучшение перепрограммирования эффективности по сравнению с предыдущими исследованиями демонстрирует потенциал для восстановления CMs от эндогенных клеточных популяций, которые остаются в сердца после инфаркта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, требующих животных были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на UC Денвер Anschutz медицинского университета.

1. изоляция MEFs

  1. Приобрести беременных мышей C57BL/6 на E13. Корабль на ночь.
  2. Усыпить мать согласно утвержденным IACUC протоколы (ex: ~1.3 Л/мин CO2 до появления мертвых животных следуют шейки матки дислокации)
  3. Спрей мать с 70% этанола и открыть брюшной полости. Удаление рога матки, содержащие эмбрионов и место в 10 см блюдо с стерильных PBS.
  4. Сделайте надрез в sac эмбриона выпустить эмбриона. Трансфер эмбрионов для очистки 10 см блюдо с стерильных PBS. Тщательно промойте.
  5. Вырезать тела ниже печени и отбросить головы и верхней части тела. Удалите внутренние органы и отбросить. Передать оставшиеся ткани чистой 10 см блюдо с стерильных PBS и передачи пластину биобезопасности уровня 1 или 2 кабинета. Комбинировать ткани от всех эмбрионов в чистые, сухие 10 см блюдо и фарш на мелкие кусочки.
  6. Добавьте 6 мл 0,25% трипсина/1 мм толщины ЭДТА в фарш эмбрионов. Нарезанных несколько раз в пипетку с распадаются ткани. Инкубируйте 40 минут при 37 ° c с 5% CO2.
  7. Ресуспензируйте клетки в среднего роста (Таблица 1). Объем средств массовой информации регулируется основе количество эмбрионов собирают. В общем используйте соотношение примерно 25 мл питательной среды на 1.2 эмбрионов.
  8. Тарелка 25 мл ресуспензированы клеток в 15 см блюдо. После 24 часов аспирационная средства массовой информации и добавить 25 мл свежего роста среднего для каждой пластины.
  9. После 72 ч добавьте 2 мл 0,25% трипсина/1 мм толщины ЭДТА в каждое блюдо 15 см. Когда клетки отсоединить от культуры блюдо, инактивировать трипсина с 15 мл среднего роста и собирать клетки в 50 мл полистирола конические трубы. Центрифуга клетки на 3 мин на 160 x g при комнатной температуре. Ресуспензируйте Пелле клеток в среднего роста и фильтр через стрейнер клеток поры 70 мкм.
  10. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и заморозить MEFs аликвоты 2 миллионов клеток в среде замораживания (10% ДМСО, 25% FBS в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) / высокие глюкоза)-80 ° c. Клетки перехода для жидкого азота после 24 h и магазин до готовой к использованию.
    Примечание: Глобальные ген выражение в MEFs профилируемый изолированы используя этот протокол, РНК последовательности (РНК seq) для обеспечения аутентификации клеток. РНК seq данных от кодирования MEF клетки были загружены из низ ген выражение Омнибус (GEO) с номером присоединения GSE93454. Данные выражения гена РНК seq для MEFs, используемые нами были сданы в низ GEO присоединения номер GSE71405. Эти два набора данных были объединены согласно общих генов символов. Выражение данных были затем лог трансформированных и рассеяния выражение данных для наших MEFs и КОДИРОВАТЬ MEFs были создан и подходят с линией линейной регрессии (рис. 1A). MEFs, изолированные, используя этот протокол, молекулярно аналогичны изолированы от других лабораторий.

2. производство ретровируса и трансдукция MEFs

Примечание: Все шаги в этом разделе должна осуществляться в шкафу 2 уровня биобезопасности. Поскольку этот протокол использует ретровирусных трансдукции, убедитесь, что безопасность, которую принимаются меры предосторожности, включая лечение, все отходы, содержащие вирусных средств массовой информации с 10% отбеливатель для по крайней мере 20 минут смотрите на рисунке 1B для временной шкалы для перепрограммирования.

  1. Производство ретровируса, используя линии клетки Platinum E (PE)
    1. Поддерживать коммерчески доступных ячеек PE PE среднего (Таблица 1) содержащий blasticidin и puromycin маркеры выделения обеспечить выражение кляп-Поль и env генов для производства эффективного ретровирусные частицы36 . Проход клеток в 1:4 или 1:5 каждые два дня. Будьте осторожны во избежание переполненности камер, поскольку это может уменьшить ретровирусной производства урожаев.
    2. В день -1 семя примерно 5 х 106 клеток на 10 см блюдо в среднего роста (Таблица 1) 16-20 h до трансфекции (см. таблицу 2 для покрытия плотности для других размеров блюдо культуры стандартной ячейки). Осторожно покачайте блюда и обратно несколько раз и тщательно место в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для обеспечения даже покрытия распределения (см. Рисунок 1 c для оптимального покрытия плотностью до трансфекции).
      Примечание: Будьте осторожны пластины PE клеток в среде свободной от маркеры выделения до трансфекции чтобы убедиться, что носитель, содержащий сгенерированный ретровирусные частицы не убили MEFs.
    3. В тот день 0 подготовиться трансфекции ДНК. Для transfection 10 см блюдо, добавить 2 мкг каждого перепрограммирования фактора — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, мир-1 и мир-133 (GHMT2m) — до 1,5 мл.
      Примечание: Обратитесь к таблице 2 для масштабирования количество ДНК, необходимо transfect другой стандартной ячейки культуры блюдо размеров.
    4. В отдельном 1,5 мл добавьте 360 мкл сокращение сыворотке СМИ. Затем добавьте 36 мкл Реагента трансфекции непосредственно на сокращение сыворотке СМИ. Осторожно проведите трубки и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
      Примечание: Чтобы избежать трансфекции снижение эффективности, тщательно добавьте трансфекции реагент непосредственно сокращение сыворотке СМИ.
    5. Добавьте сокращение сыворотке смеси реагентов в СМИ/transfection GHMT2m ДНК коктейль. Осторожно проведите трубки и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин. Сделать не вихря.
    6. Добавить смесь реакции каплям PE клетки, нежно вихревой СМИ за 10-15 s и место в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
      Примечание: По словам производителя, PE клеток генерировать средний титр 106 -107 инфекционных единиц/мл. Этот протокол создает примерно 2 х 106 инфекций единиц/мл через 24 ч и 6 x 106 инфекций единиц/мл 48 ч в среднем MOI 4. Трансфекция GFP/DsRed может также использоваться в качестве суррогатной эффективность трансфекции/трансдукции при желании; Ожидается, что эффективность трансфекции превышать 90% от 48 h (рис. 1 c).
  2. Трансдукция MEFs
    1. В тот день 0 пальто блюда с коллагеном и место в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для минимум 2 ч.
    2. Удаление MEFs из жидкого азота и оттепели. Пластина 0,2 х 106 клеток на 60 мм блюдо в среднего роста. Мягко рок пластины для обеспечения даже покрытия распределения и место в инкубатор (см Рисунок 1 c для оптимального покрытия плотностью и таблице 2 покрытие плотности для других размеров блюдо культуры стандартной ячейки).
      Примечание: Эти плотности покрытия были протестированы на несколько пакетов изолированных MEFs; Если MEFs дисплея значительно подрывает жизнеспособность, корректировки плотности заполнения ячейки не является необходимым.
    3. В день 1, 24 ч после трансфекции, используйте 30 мл шприц для сбора ретровирусной среднего, порожденных PE клеток. Передайте среды через фильтр размер пор 0,45 мкм в 50 мл Конические трубки. Добавьте hexadimethrine бромид трансфекции реагента в конечной концентрации 6 мкг/мл. Тщательно добавьте 10 мл свежего роста среднего PE клетки дозирования СМИ на стену культуры блюдо для предотвращения перемещения ячеек.
    4. Аспирационная среднего от MEFs и добавить 4 мл свежеубранных ретровирусной среды в каждое блюдо. Возвращение MEFs для инкубатора. Добавьте 10% Блич все материалы в контакте с вирусной среднего для нейтрализации ретровирусные частицы.
    5. В день 2, 48 ч после трансфекции, повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3. PE клетки удаляются после 2nd коллекции ретровирусной среды.
      Примечание: Добавьте 10% отбеливатель отбрасываются клеток PE для по крайней мере 20 минут для нейтрализации нежелательных ретровирус.
    6. На 3 день, аспирационная среднего от MEFs и пополнить с 4 мл iCM носитель (Таблица 1), содержащий 0,5 мкм A-83-01, TGF-β I типа ингибитор рецепторов. Пополняете iCM носитель, содержащий A-83-01 каждые 2 дня.
      Примечание: При использовании GFP как элемент трансдукции, выражение ожидается превышает 90% этого времени (рис. 1 c).

3. проточной цитометрии для сердца маркеров

  1. Аспирационная средний день 9 перепрограммирована MEFs и мыть (1 x) с ПБС для удаления мертвых клеток и мусора.
  2. В 37 градусов, добавьте 1 мл 0,25% трипсина/ЭДТА на 5 мин. Проверьте ячейки с помощью световой микроскоп и поколебать блюдо; Если клетки остаются присоединенными, Инкубируйте более 5 мин при 37 ° c, пока клетки.
  3. Вымойте клетки в однократном ПБС, содержащих 5% FBS и фильтр через стрейнер клеток поры 70 мкм.
  4. Центрифуга на 160 x g 3 мин при комнатной температуре и аспирата жидкости из гранул.
    Примечание: Для увеличения урожайности ячейки, оставьте приблизительно 50 мкл жидкости выше ячейки Пелле.
  5. Вымойте клетки с PBS 1 x 500 мкл, содержащей 1% BSA.
  6. Исправьте клетки с 0,2 мл/1 миллион клеток фиксации решение для 20 мин на льду.
  7. Добавьте 1 mL 1 x ледяной Пермь/мыть буфера.
    Примечание: Решение производителя является 10 x.
  8. Центрифуга клетки на 160 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
  9. Повторите шаги 3.7 и 3.8 дополнительное время. После 2-й вымыть сразу перейти к следующему шагу или сохранить клетки на 4 ° C на ночь.
  10. Блок с 100 мкл 5% сыворотки коза и осел сыворотки в 1 x Пермь/мыть буфер для 30 мин при комнатной температуре.
  11. 100 мкл разбавленного основное антитело.
    Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены с помощью мыши тропонина T (1: 200) и мышь α-актинина (1: 200) для количественного определения процент клеток положительный для ключевых компонентов сердца Саркомер. Инкубируйте основное антитело для 1 ч при комнатной температуре.
  12. Центрифуга клетки на 160 x g для 5 м при 4 ° C, аспирационная супернатанта и мыть 2 x с ледяной Пермь/мыть буфера.
  13. 100 мкл разбавленного вторичное антитело.
    Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены анти мыши 647 Нм вторичное антитело (1: 200). Инкубируйте вторичное антитело для 45 мин при комнатной температуре на конец над конец трубки ротатора. Защите клетки от света, завернув трубы в фольге.
  14. Центрифуга клетки на 160 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатанта и мыть 2 x с ледяной Пермь/мыть буфера.
  15. Добавить 1 мл 1% BSA в PBS и немедленно выполнять СУИМ.
    Примечание: Генерировать вперед против стороны точечной точечная для первых ворот жизнеспособных клеток, при выполнении СУИМ. Кроме того используйте коммерчески доступных жить/мертвые клетки пятно до фиксации клетки для выявления жить и мертвые клетки населения.

4. иммуноокрашивания перепрограммировать MEFs

  1. Средний аспирата из 14 день перепрограммировать MEFs и мыть (1 x) с 1 мл раствора 1 x ледяной PBS.
    Примечание: Для иммуноокрашивания, перепрограммирование была исполнена в 12 хорошо пластины для сведения к минимуму объемов раствор антител. 24 хорошо плиты также могут быть использованы; просто половина всех после томов.
  2. Аспирационная и исправить клетки с 500 мкл параформальдегида 2% за 10 мин при комнатной температуре.
  3. Аспирационная и вымыть клетки 3 раза с ПБС 1 мл (5 мин на мыть при комнатной температуре).
  4. Разрушения клеток с 500 мкл 0,2% permeabilization реагента в PBS для 15 мин при комнатной температуре.
  5. Аспирационная и блокировать в 500 мкл 10% лошадь сыворотки в PBS на 30 минут при комнатной температуре.
  6. Аспирационная и проинкубируйте с 500 мкл разбавленного основное антитело за 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены с помощью мыши тропонина T или α-актинина (каждый 1: 400) и совместно помечены Connexin 43 (1: 400) или тропонина I (1: 400).
  7. Аспирационная основное антитело и стирать три раза с ПБС 1 мл (5 мин на мыть при комнатной температуре).
  8. Аспирационная и инкубировать 1 час при комнатной температуре с 500 мкл разбавленного вторичное антитело.
    Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены анти мыши 555 Нм вторичное антитело (терапевтами) признать тропонина T или α-актинина и анти кролик 488 нм вторичное антитело (терапевтами) признать Connexin 43 или тропонин I. Кроме того, окрашивали ядер "Хёхст" (1:10 000). Защитите клетки от света, инкубации в темноте.
  9. Аспирационная вторичные антитела и стирать три раза с ПБС 1 мл (5 мин на мыть при комнатной температуре). Оберните пластину в фольгу, чтобы защитить клетки от света и хранить при 4 ° C.
  10. Изображение с помощью 3 канальный микроскопия помощью эпифлуоресцентного.

5. кальция изображений

Примечание: Если изображений при 10-кратном, стандартная ячейка культуры блюда и тарелки подходят для кальция изображений. Изображений на увеличение требует, что клетки быть покрытие на coverslips стекла или стекла дно блюда.

  1. Аспирационная среднего и добавить 2 мл (для хорошо пластины 6) изменение Tyrode в раствор (140 мм NaCl, 5 мм KCl, 1.8 мм CaCl2, 1 мм MgCl2, глюкоза 10 мм, 10 мм HEPES, BSA 0,1% и 1% пируват, рН 7,4) содержащий 5 мкм фура-2 AM и 0,1% плюрониевого F-127 к избиению (D14 t iCMs o D20). Инкубируйте 30 минут при 37 ° C.
    Примечание: Защитите клетки от света во избежание закалки флуоресцентный индикатор.
  2. Вымыть клетки в 2 мл Tyrode раствора для 30 мин при комнатной температуре, чтобы позволить де этерификации фура-2 AM.
  3. Изображение с вращением диска конфокальная микроскопия на 340 Нм и 380 Нм, с использованием Slidebook 5.5 Ca2 + визуализации программного обеспечения. Выполнение визуализации при комнатной температуре.
  4. Кальция транзиентов рассчитаны с использованием коэффициента интенсивности флуоресценции в 340 Нм по интенсивности флуоресценции в 380 Нм.
  5. При желании, лечить iCMs с 1 или 2 isoproterenol мкм и 10 мкм нифедипин манипулировать кальция, обработка после визуализации исходных кальция транзиентов. Добавление соединений локально клетки и изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы с помощью перепрограммирования стратегии, изложенной выше и на рисунке 1B, созданных iCMs с приблизительно 70% клеток выразить сердечные тропонина T и около 55% клеток, выражая сердечной α-актинина, количественно подачей cytometry в день 9 После трансдукции GHMT2m (рисунок 2A и B). Кроме того, большинство клеток выразить сердечные тропонина T, тропонин I и сердца α-актинина, а также разрыв соединения маркер Co...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящее исследование излагается стратегия высокой эффективности непосредственно перепрограммировать фибробластов в функциональных iCMs через доставку GHMT2m перепрограммирования факторы, в сочетании с подавления про фиброзный сигнальных путей. С помощью проточной цитометрии, immunofluorescent изображений, кальция изображений и избиение клеток, мы показываем большинство клеток в этом протоколе пройти успешного перепрограммирования и принять см линии судьбы. Ранее мы показали, что добавление анти фиброзных соединений, вк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано средств от Боттчер Уэбб-Уоринг биомедицинских исследований программы Фонда, американский ученый сердца ассоциации грант развития (13SDG17400031), Университет Колорадо Департамента медицины выдающиеся начало карьеры Программа, Университет Колорадо Отдела кардиологии Барлоу Nyle Дотационный и низ R01HL133230 (для K.S). A.S.R было поддержано TL1TR001081 номер гранта NIH/NCATS Колорадо CTSA и предварительного докторских стипендий из университета Колорадо консорциума для исследования фиброз и перевода (CFReT). Это исследование было также поддерживается рака центр поддержки Грант (P30CA046934), кожи болезни исследования ядер Грант (P30AR057212) и потока Cytometry основных медицинских кампуса университета Колорадо Anschutz.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL/6 Мыши,Лаборатория Чарльза Ривера,027Для выделения MEF
Платиновая E (PE), Клетки, Биолаборатории, INCRV-101Для производства ретровируса
DMEM High GlucoseGibcoSH30022. FS Компонент iCM, PE и питательных сред
Среда 199Life Technologies11150-059Компонент среды iCM
Фетальная бычья сывороткаGemini100106Компонент iCM, PE и питательных сред Донорская
лошадиная сывороткаGemini100508 500Компонент iCM media
MEM Незаменимые аминокислоты, 50XLife Technologies11130051компонент iCM медиа
Раствор пирувата натрия, 100XLife Technologies11360070Компонент среды iCM и для визуализации кальция
MEM Заменимые аминокислоты, 100XLife Technologies11140050Компонент iCM media
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Компонент среды iCM
Инсулин-трансферрин-селенGibco41400045Компонент среды iCM
B27Gibco17504-044Компонент среды iCM
Пеницилин-стрептомицинGibco15140-122Компонент среды iCM, PE и питательных сред
GlutaMAX (добавка L-глутамина)Gibco35050-061Компонент среды iCM, PE и питательных сред
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Компонент среды PE
Пуромицина дигидрохлоридLife TechnologiesA11138-03Компонент ПЭ среды
0,25% трипсин/ЭДТАGibco25200-056Для отделения клеток из культуральных чашек
A-83-01R& D Systems - Tocris2939/10Treat cells для ингибирования передачи сигналов TGF-β - способствует высокоэффективному перепрограммированию. Использование при 0,5 & микро; M
DMSOThermo Scientific85190Для разбавления и хранения А-83-01 и компонента субстраментной среды
SureCoatCellutronSC-9035Для покрытия посуды на тарелках MEF
FuGENE 6 Трансфекционный реагентPromegaE2692Трансфекционный реагент
Opti-MEM Восстановленный сывороточный медиаторGibco11058-021Трансфекционный реагент
pBabe-X Myc-GATA4Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования
pBabe-X Myc-Hand2Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования
pBabe-X Myc-Mef2cПлазмида, содержащая фактор перепрограммирования
pBabe-X Myc-Tbx5Плазмида, содержащая фактор
перепрограммирования pBabe-X miR-1Плазмида, содержащая Фактор перепрограммирования
pBabe-X miR-133Плазмида, содержащая фактор перепрограммирования
pBabe-X GFPПлазмида, содержащая фактор перепрограммирования
полибрена (гексадиметрина бромид)SigmaH9268-5GДля индукции вируса. Использование в концентрации 6&микро; г/мл
Вакуумный фильтр + бутылки (0,22 &; m pores)Nalgene  569-0020 Для фильтрующих материалов
ШприцыBd Vacutainer Labware 309654Для фильтрации вирусов
0,45 & микро; m ФильтрыCelltreat229749Для фильтрации вирусов
70 & микро; m клеточные фильтрыFalcon 352350Для выделения MEF и проточной цитометрии
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722Для фиксации и пермеабилизации клеток для проточной цитометрии
perm/wash buffer BD554723Для промывки клеток для проточной цитометрии
DPBS 1XGibco14190-250Для промывки клеток
Бычья сыворотка АльбуминVWR0332-100гДля проточной цитометрии и визуализации кальция
Козья сывороткаSigma G9023Для блокирования клеток для проточной цитометрии
Сыворотка ослякаSigmaD9663-10mgДля блокирования клеток для проточной цитометрии
мышиный тропонин TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Проточная цитометрия
мыши α-актининSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Проточная цитометрия
кролика Connexin 43Sigma C62191:400
IF Кролик Тропонин IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, кроликLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, мышьLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, мышьLife TechnologiesA-315711:200 Проточная цитометрия
27-цветный проточный цитометр ZE5 Bio-RADДля FACS
ПараформальдегидsigmaP6148-500mgДля фиксации клеток для IF
Triton X-100PromegaH5142Для пермеабилизации клеток для IF
EVOS™ Система цветной визуализации FLThermo ScientificAMEFC4300для IF
NaClRPIS23020-5000Для визуализации кальция
KClVWR395Для визуализации кальция
CaCl2FisherC614-500Для визуализации кальция
MgCl2VWR97061-352Для визуализации кальция
глюкозаsigmaG7528-250gДля визуализации кальция
HEPESsigmaH4034-500gДля визуализации кальция
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221Для визуализации кальция
Fluronic F-127SigmaP2443-250gДля визуализации кальция
NifedipineSigmaN7634-1GДля разрушения переходных процессов кальция в iCMs - используйте при 10 & микро;
М ИзопротеренолсигмаI6504-1gДля увеличения количества кальциевых переходных процессов в iCM - используйте при 1-2 & микро; M
Marianas Вращающийся диск Конфокальный микроскоп3iДля визуализации кальция
этанолDecon Laboratories2801
отбеливательClorox
50 мл конические пробиркиGREINER BIO-ONE
15 мл конические пробиркиGREINER BIO-ONE
15 см чашки для клеточных культурFalcon
10 см чашки для клеточных культурFalcon353003
60 мм чашки для клеточных культурGREINER BIO-ONE628160
6 лунок для клеточных культурGREINER BIO-ONE657160 
12-луночные планшеты для культивирования клетокGREINER BIO-ONE665180 
24-луночные планшеты для культивирования клетокGREINER BIO-ONE662160 
, , , ,, 227261 188271 353025

Ссылки

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678(2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577(2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TGFGHMT2M
Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.