Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Делая спряжение индуцированной флуоресцентные Пегилированный вирус типа частиц по химии Dibromomaleimide дисульфида

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57712

⸱

27 мая 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем процедура дневно functionalize дисульфиды на Qβ VLP с dibromomaleimide. Мы описываем выражение Qβ и очистки, Синтез функционализированных dibromomaleimide молекул и спряжение реакции между dibromomaleimide и Qβ. Результате желтый флуоресцентный конъюгированных частиц может использоваться как флуоресценции зонда внутрь клетки.

Аннотация

Недавний рост вирусоподобных частиц (VLP) в биомедицинских и материалы исследований можно отнести их простота биосинтез, дискретных размер, генетическое программирование и способность к биологическому разложению. Хотя они очень поддаются реакции bioconjugation для добавления синтетическими лигандами на их поверхность, диапазон в методологии bioconjugation на эти водные родился capsids относительно ограничен. Чтобы облегчить направление исследований функциональные биоматериалы, должны рассматриваться нетрадиционных bioconjugation реакций. Реакции, указанных в настоящем Протоколе использует dibromomaleimides ввести новую функциональность в растворителе, подвергаются дисульфидными облигаций VLP основе бактериофага Qβ. Кроме того конечный продукт флуоресцентные, которая имеет дополнительное преимущество генерации отслеживаются в vitro зонд, с помощью набора коммерчески доступных фильтров.

Введение

С помощью нано размера вирусного capsids стала возбуждающего поля, которая направлена на расширение сферы применения биомедицинских исследований в1,2,3. Recombinantly выразил вирусоподобных частиц (VLP) структурно являются производными от вирусов, но им не хватает оригинальных вирусного генетического материала, делая их неинфекционных белковых наночастиц. Как особенности поверхности генетически запрограммирован и каждый капсид выражается одинаково на те до и после него, это можно узнать местонахождение и количество реактивных боковых цепей аминокислот с атомистическим точностью. Во многих случаях наружных и внутренних поверхностей обладают многие виды растворителей подвергаются аминокислотных остатков, которые реально могут быть функционализированных через bioconjugation реакции - реакции, которые образуют ковалентные связи между биомолекулы и синтетические молекула4,5.

Bioconjugation реакции помогают биомолекул интерес у более разнообразных функций в относительно простой моды. Молекулы интереса, таких как лечебных препаратов6, флуоресцентные метки7 и полимеров8,9 могут быть предварительно синтезируется и характеризуется, прежде чем они крепятся на поверхности VLP. Особенно распространены VLP в биомедицинских и биоматериалов исследования был ВЛП, основанные на бактериофага Qβ, который, как recombinantly выраженным, является 28 Нм икосаэдра вирусного капсида10. Наиболее распространенные реакции сайты на Qβ являются lysines с большим отрывом, хотя недавно мы общались успешного сопряжения11 dibromomaleimide соединений для снижения дисульфиды, которые выстилают поры Qβ через Haddleton-Бейкер реакции. Реакция идёт с хорошим доходность и, что не менее важно, без потери термостабильности частиц. В то же время эта реакция генерирует спряжение индуцированной флуоресценции, который может использоваться для отслеживания поглощение этих частиц в клетки. В этой работе мы демонстрируем спряжение полиэтиленгликоля (PEG) на поверхность Qβ через Haddleton-Бейкер реакцию, которая приводит яркий желтый Флюорофор. Эти частицы затем могут быть отслежены, как они принимаются клетки. Протокол здесь поможет генерировать новые люминесцентные Пегилированный белковых наночастиц на основе Qβ, хотя его принципы применяются к одному из многих других VLP, содержащие растворитель подвергаются дисульфиды исследователей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Сделать Lysogeny бульон (LB) агар и залить12пластин.
  2. Преобразование BL21(DE3) с pET28 плазмиды, содержащих последовательности белка wtQβ пальто.
    1. Оттепель E. coli BL21(DE3) сведущие клетки в ледяной бане. Место 50 мкл клеток в пробки microcentrifuge.
    2. Добавить 2 мкл плазмида в одну трубу и мягко проведите трубки. Затем Инкубируйте на льду за 30 мин.
    3. Теплового шока клетки для 45 s в ванне с водой, в Ровно 42 ° C. Сразу после тепло шокирующие Поместите трубку обратно в ледяной ванне и инкубировать в течение 5 мин.
    4. Добавление 950 мкл LB средств массовой информации, которые не содержат любой антибиотик.
    5. Встряхнуть культуры на 200 об/мин, 60 мин при температуре 37 ° C.
    6. Пластина 100 мкл культуры на плитах агара фунтов (с канамицин) и инкубировать пластину на ночь при 37 ° C. Выберите белый колонии при необходимости.
  3. Сделайте супер оптимального бульон (SOB) средства массовой информации.
    1. Автоклав два 2 L озадаченного Эрленмейер колбы на superdry цикла.
    2. В асептических условиях весят и добавить 20,0 г Триптон, 5,0 г дрожжей экстракт, 2.469 g безводного сульфата магния, 0,584 г натрия хлорида и 0,186 г хлористого калия на каждый флакон.
    3. Доводят объем до 1 Л с ультрачистая вода в каждом колбу и автоклава на жидком цикла.
    4. После того, как СОБ СМИ достигла комнатной температуре после автоклавирования, добавить 1 мл канамицин (100 мг/мл) в каждый литр средства массовой информации и хранить при 4 ° C.
  4. Сделайте буфер фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
    1. Сделайте 1 M калия монокальций решения путем растворения 68.045 г калия монокальций в 500 мл ультрачистая вода.
    2. Сделайте 1 M калия двуосновной решения путем растворения 87.09 г калия двуосновной в 500 мл ультрачистая вода.
    3. Добавьте 38,5 мл раствора калия монокальций и 61,5 мл калия двуосновной бутылка 1 Л.
    4. Отрегулируйте пэ-аш до 7.00, в случае необходимости и довести до объемом 1 л.
  5. Сделать 5-40% сахарозы градиенты в буфере фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
    1. В 50 мл пробирок Подготовьте решения с сахарозы 5-40% (увеличение с шагом 5%), растворенного в буфере фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
    2. Депозит 3,3 мл раствора 5% сахарозы в нижней части 38 мл раунд дно из поликарбоната с помощью длинной иглой шприца и повторите это действие для пяти других труб.
    3. Тщательно депозит 3,3 мл 10% раствора сахарозы в нижней части трубки и осторожно извлеките иглу относительно не беспокоить градиента. Повторите для других пяти трубок.
       
  6. Продолжать депозит слои 3,3 мл растворов сахарозы, увеличение от 15% до 40% в каждой тюбике, будучи осторожны, чтобы не нарушить градиента.
  7. Когда закончите, охватывают верхушки градиенты с фольгой и хранить при температуре-80 ° C.

2. выражение Qβ

  1. Протрите скамейке Блич/этанол 1:1.
  2. Сделать два 3 мл закваски в асептической среде путем добавления одной колонии E. coli BL21(DE3) в 3 мл SOB СМИ в асептической среде.
  3. Растут на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% относительная влажность (rH) номер на ночь.
  4. Прививать закваски в СОБ СМИ:
    1. Снять оба 3 мл стартерных культур шейкер и в асептических условиях, налить каждый закваски в один из двух 2 L озадаченного Эрленмейер колбы с 1 Л свежих SOB СМИ в каждом.
    2. Место привитых СМИ на шейкер на 250 об/мин в комнате 37 ° C и 0% rH.
  5. Расти бактерии на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% rH комнате, пока ОД600 достигает 0,9 – 1,0.
  6. Добавьте 1 mL 1 М изопропиловый β-D-1 тиогалактопиранозид (IPTG) с помощью пипетки P1000 побудить выражения протеина.
  7. Оставьте СМИ на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% rH комнате на ночь.
  8. Удалите СМИ из шейкер следующее утро и центрифуги с помощью 1000 мл бутылки на 20,621 × g за 1 час при температуре 4 ° C для сбора клеток.
  9. Отменить супернатант и собирать Пелле ячейки.
    1. Залейте супернатант в колбу с около 5 мл отбеливатель, чтобы убить бактерии. Это отходов.
    2. Лопаточкой скрести клетки гранулы из нижней части бутылки центрифуги и положить лепешку в 50 мл пластиковых пробирок.

3. Очистка Qβ

  1. Ресуспензируйте клетки лепешка с ~ 20-30 мл 0,1 М калия фосфат буфера (pH 7.00).
  2. Убедитесь, что ресуспендирования имеет не куски и лизировать клетки, с помощью microfluidizer процессора по данным производителя протокол (см. Таблицу материалы). Лизируйте клетки по крайней мере дважды увеличить доходность частиц.
  3. Центрифуга lysate в 250 мл бутылки центрифуги на 20,621 x g за 1 час при 4 ° C.
  4. Отменить гранулы и измерить объем супернатант в мл. Умножьте это значение на 0,265 и добавить что количество г сульфата аммония супернатант.
  5. Движение на 4 ° C для по крайней мере 1 h на плите переполох на 200 об/мин, чтобы осадить из белка.
  6. Центрифуга в 250 мл бутылки на 20,621 x g за 1 час при 4 ° C.
  7. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с около 10 мл 0,1 М калия фосфат буфера (pH 7.00).
  8. Добавьте равных объемах 1:1 хлороформ/н бутанолом в сырой пример и микс, vortexing на несколько секунд.
  9. Центрифуга 38 мл пробирки на 20,621 × g 30 минут при 4 ° C.
  10. Восстановите Топ водный слой с помощью пипетки Пастера. Будьте осторожным, чтобы не принимать любое из геля как слой, который сложился между водный и органического слоя.
  11. Оттепель шесть 5-40% готовые сахарозы градиенты и загрузки около 2 мл экстракт на каждую.
  12. Ультрацентрифуги на 99,582 x g для 16 ч при 4 ° C с бесплатным замедления.
  13. Блеск Светоиспускающий диод (LED) свет под каждой трубы и синей полосой должен стать видимым. Восстановите эти частицы с длинной иглой шприца.
  14. Ultrapellet частиц на 370,541 x g для 2,5 ч при 4 ° C.
  15. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Прозрачные гранулы очищенный частиц с буфером фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).

4. Количественная оценка и подтверждение продукта

  1. Использование Assay Брадфорд для количественного определения продукта13.
  2. Выполнения сокращения и не сокращение натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) для подтверждения продукта14.
    Примечание: Уменьшение SDS-PAGE используется для подтверждения низкомолекулярных белков пальто; не сокращение SDS-PAGE является подтверждение структуры высшего порядка.

5. спряжение DB соединений на Qβ

  1. Уменьшите дисульфиды на Qβ.
    1. Распустить 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP) в 1 мл сверхчистой воды сделать Стоковый раствор 100 x.
      Примечание: Подготовьте свежие TCEP до сокращения.
    2. Добавьте 200 мкл Qβ (5 мг/мл) в трубку microcentrifuge.
    3. Следовать за путем добавления 20 мкл 100 x TCEP раствор.
    4. Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
  2. Повторно мост снижение дисульфида, с помощью dibromomaleimide Полиэтиленгликоль (DB-PEG).
    1. Растворите 0,0017 г dibromomaleimide-Полиэтиленгликоль (DB-PEG) в 100 мкл ДМФ.
    2. 680 мкл раствора натрия фосфата 10 мм (рН 5.00).
    3. Добавить сократить Qβ в раствор DB-КОЛЫШЕК и наблюдать процесс смешивания под лампой УФ 365 Нм. Яркие желтые флуоресценции могут быть немедленно визуализированы с 365 Нм Карманный УФ лампой после смешивания.
    4. Пусть реакции перейти на ночь при комнатной температуре (RT) на вертеле.
  3. Очистить реакционной смеси центробежным фильтром (COMW = 10 кДа) три раза с использованием ПБС в 3,283 x g 20 мин при 4 ° C.
  4. Контролировать спряжение, не снижая SDS-PAGE и родной геля агарозы.
    Примечание: VLP как нетронутыми частиц в родной агарозном геле, и они разделяются на их заряда, размер и форму.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Dibromomaleimide производные могут быть синтезированы посредством реакции конденсации между dibromomaleimide ангидрид и первичных аминов15. Кроме того мягкий синтетический метод16 , с использованием N-метоксикарбонил активированный 3,4-dibromomaleimide эксплуатировался здесь, реагируя с methoxypolyethylene гликоль (PEG) доходности DB-ПЭГ (рис. 1). ЯМР была использована для выявления составных структуру (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

По сравнению с небольших очищение протеина, уникальный шаг в очищающий бактериофага Qβ — сахароза градиентного центрифугирования. После извлечения хлороформ/н бутанолом шага Qβ далее очищается с помощью 5-40% сахарозы градиентов. Во время центрифугирования частицы разделяются на их размеры. Крупные частицы поездки в регионе более высокой плотности, в то время как мелкие частицы остаются в регионе нижней плотности. Qβ едет в нижней трети градиента и остается там в то время как меньшие белковых примесей оказались в ловушке...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

J.J.G. признает Национальный научный фонд (DMR-1654405) и Институт исследования профилактики рака штата Техас (CPRIT) (RP170752s) за их поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
LB Бульон (Мельник) EMD Millipore1.10285.0500
Триптон, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Дрожжевой экстракт, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Безводный сульфат магнияP212121CI-06808-1KG
Хлорид натрия (кристаллический/сертифицированный ACS)FisherScientific S271-10
Хлорид калияFisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Система очистки водыFisher Scientific4474524
Фосфат калия одноосновнойFisherScientific BP362-1
Фосфат калия двухосновной безводныйFisher ScientificP288-500
СахарозаFisher Scientific
ЭтанолBP2818500Фишера
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX ротор Fisher Scientific096-041053
Сульфат аммонияP212121KW-0066-5KG
ХлороформAlfa Aesar32614-M6
1-БутанолFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Ротор, качающееся ковш, алюминиевыйсошник Beckman 342204: SW 28 Ti Ротор/ 342217: Комплект
типа 70 Ti Ротор, фиксированный угол, Титан, 8 x 39 мл,Beckman Coulter337922
Coomassie (Bradford) Анализ белкаFisher ScientificPI23200
TRISHydrochloride Research Products InternationalT60050-1000.0
ТетраметилэтилендиаминАльфа АэсарJ63734-AC
Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлоридСигма ОлдричC4706-2G
2 3-диброммаламимид 97%Sigma Aldrich553603-5G
ПолитиленгликольAlfa Aesar41561-22
Фосфат натрияFisher ScientificAC424375000
Акриламид/бис-акриламидP212121RP-A11310-500.0
Додецилсульфат натрияSigma AldrichL3771-100G
Персульфат аммонияFisher ScientificBP179-100
FV3000 конфокальный лазерный сканирующий микроскопOlympus FV3000 
Револьвер Labnet Регулируемый вращатель Томас Научный 1190P25 
Высокопроизводительная бутылка Sorvall объемом 1000 мл, ПК, с алюминиевой крышкой Thermo Scientific010-1459
Nalgene Центрифуга Бутылки с крышками, сополимер полипропиленаThermo Scientific3141-0250
Nunc Пробирки с круглым дном; 38 мл; PCThermo Scientific3117-0380
л Узкое горлышко Колбы Erlenmeyer с сверхмощным ободкомPyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 Центробежные фильтрующие блокиMillipore SigmaUFC801024
M-110P Микрофлюидизатор Материалы ПроцессорМикрофлюидикаM-110P
Nalgene Высокоскоростной поликарбонат Круглодонные центрифужные пробиркиThermo Scientific3117-0380PK
Бутылка, с крышкой в сборе, поликарбонатBeckman Coulter41121703
цилиндре, градуированный - полипропилен 250 млPolyLab80005
533LS-E серия паровых стерилизаторовGetinge533LS-E
TrueLine, планшет для клеточной культуры, обработанный, PS, 96 лунок, с крышкойLabSourceD36-313-CS
Коническая центрифужная трубка Falcon 15 млFisher Scientific14-959-53A
Микроцентрифугная трубка: 1,5 млFisher Scientific05-408-129
Орбитальный шейкер VWR Os-500 VWRScientifc Продукция14005-830
Tetra Ручные кастинговые системыBio-Rad1658000FC
Полипропилен, 250 млBeckman Coulter41121703
Спектрофлуориметр NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Long Needle Гамильтон 7693
Exel International Шприцы от 5 до 6 куб. см Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilson
Intel Взвешивание PM-100 Лабораторные классические высокоточные лабораторные весыИнтеллектуальная технология взвешиванияIWT_PM100
Falcon 50 мл Коническая центрифуга ПробиркаFisher Scientific14-432-22
4– 15% гель Mini-PROTEAN TGX, 10 лунок, 50 и микро; lБио-Рад456-1084
S25590B Научного ковшей 2 F144802

Ссылки

  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
  3. Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
  4. Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
  5. Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
  6. Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
  7. Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
  8. Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
  10. Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
  11. Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
  12. Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
  13. Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
  14. Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
  15. Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
  16. Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
  17. Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
  18. Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
  19. Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

QBetaSDS PAGE
Делая спряжение индуцированной флуоресцентные Пегилированный вирус типа частиц по химии Dibromomaleimide дисульфида
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.